李信萍，張 響，王 玥，王劍文，鄭麗屏

(1.蘇州大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 蘇州 215006；2.蘇州大學(xué) 金螳螂建筑學(xué)院，江蘇 蘇州 215006)

微粒促進培養(yǎng)(microparticle-enhanced cultivation,MPEC)技術(shù)是指將固體微粒如Al2O3、CaCO3、滑石粉(talc)添加到發(fā)酵培養(yǎng)體系中以提高真菌代謝物產(chǎn)量的一種新型調(diào)節(jié)方法。當(dāng)用CaCO3處理根霉菌(Rhizopusoryzae)種子液后，乳酸的產(chǎn)量最高達72.62 g/L[1]。Dong等[2]用10 g/L的Al2O3處理深綠木霉(Trichodermaviride)的種子液，促進纖維素的產(chǎn)生。土曲霉(Aspergillumterreus)的種子液經(jīng)過滑石粉(直徑10 μm)處理，洛伐他汀的產(chǎn)量比對照組提高3.5倍[3]。MPEC已逐漸成為工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)重要代謝物的新型培養(yǎng)方式[4]。

萃取發(fā)酵常用于真菌發(fā)酵培養(yǎng)中，即在常規(guī)發(fā)酵的同時，對目標(biāo)產(chǎn)物進行原位去除(insituproduct removal)，可有效緩解底物抑制作用，也有利于下游產(chǎn)物的分離純化，降低分離純化難度，節(jié)約生產(chǎn)成本[5-6]。水-有機溶劑兩相萃取發(fā)酵是增加真菌代謝產(chǎn)物的有效途徑[7]。近年來，非離子表面活性劑Triton X-100(TX100)作為一種有效的真菌發(fā)酵萃取劑，已成功用于紅曲霉(Monascus)[8]和黃絲曲霉(Talaromyces)[9]胞內(nèi)色素的滲透萃取，在釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)生物轉(zhuǎn)化甲苯以及分枝桿菌(Mycobacteriumsp.NRRL B-3683)轉(zhuǎn)化膽固醇中[10-11]中亦有應(yīng)用。

竹黃菌菌絲和子實體中的主要苝醌色素為竹紅菌素(hypocrellin)，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤等生物活性，現(xiàn)已研發(fā)出“竹紅菌素軟膏”，在臨床上用于治療外陰白斑、皮膚白色病變和瘢痕疙瘩等皮膚病[12-13]。由于竹紅菌素顏色鮮艷、著色能力強且無毒，也可作為食品添加劑[14]。竹紅菌素還具有開發(fā)為新型、低毒、高效的光活化農(nóng)藥的潛力[15-17]。竹紅菌甲素(HA)是一種非卟啉類的新型光敏化合物，具有吸收光譜廣、光暗毒性小、產(chǎn)單線態(tài)氧能力強等優(yōu)點，在抗癌、抗病毒、治療皮膚病等光化學(xué)療法中有很好的應(yīng)用前景[18]。

目前，由于野生竹黃資源非常有限，從野生竹黃菌提取竹紅菌素已無法滿足醫(yī)藥工業(yè)的需求。竹黃菌無性菌絲的液態(tài)發(fā)酵已成為生產(chǎn)竹紅菌素的首選。在無性菌絲培養(yǎng)中，種子液培養(yǎng)的變化，包括接種量、培養(yǎng)基成分、搖床轉(zhuǎn)速、通氣效率等都顯著影響真菌的生長和代謝物的積累[1,19]。在竹黃菌的發(fā)酵生產(chǎn)中，目前沒有關(guān)于竹黃菌種子液優(yōu)化處理的報道，且鮮少有竹黃菌萃取發(fā)酵的相關(guān)研究。因此，筆者選用了固體顆粒Al2O3、talc以及竹炭微粉(bamboo charcoal powder，BCP)處理竹黃菌種子液，考察這些顆粒對竹黃菌生長和HA合成的影響；另一方面，為了提高發(fā)酵體系中HA的產(chǎn)量并簡化下游分離純化步驟，筆者采用兩段發(fā)酵法對竹黃菌進行萃取發(fā)酵，即在種子液培養(yǎng)期，應(yīng)用BCP處理竹黃菌種子液，促進HA的合成，在發(fā)酵生產(chǎn)期添加TX100對竹黃菌進行萃取發(fā)酵。筆者研究了TX100萃取發(fā)酵對HA合成的影響和竹紅菌素在濁點系統(tǒng)中的分配，以期為藥用真菌活性代謝物產(chǎn)量的提高及分離純化步驟的簡化提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株：竹黃菌(Shiraiasp.S8)，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，編號CGMCC No.3984。

種子液培養(yǎng)基(g/L)：馬鈴薯100、可溶性淀粉20、NaNO34、KH2PO41.5、CaCO30.5、VB10.01；pH自然。

生產(chǎn)培養(yǎng)基(g/L)：馬鈴薯100、可溶性淀粉20、NaNO34、KH2PO41.5、CaCO30.5、VB10.01；pH自然。

以上培養(yǎng)基都在121 ℃條件下滅菌25 min。

1.2 實驗方法

1.2.1 種子液制備

將保種于PDA斜面培養(yǎng)基的竹黃菌在28 ℃條件下進行活化，取少量菌絲接種于新配制的PDA平板中，28 ℃培養(yǎng)10 d。用10 mL無菌水洗下培養(yǎng)10 d后的竹黃菌孢子，計數(shù)后配制成2×107個/mL的孢子懸液，吸取200 μL孢子懸液接種于種子培養(yǎng)基中(150 mL錐形瓶，裝液量50 mL)，于28 ℃、150 r/min培養(yǎng)2 d即得竹黃菌種子液，用于后續(xù)實驗。

1.2.2 MPEC與TX100處理

為了研究不同固體顆粒處理對竹黃菌生長和產(chǎn)HA的影響，分別向竹黃菌的種子液培養(yǎng)基中添加2 g/L的Al2O3、talc、BCP，按上述方法得種子液后接種1 mL于生產(chǎn)培養(yǎng)基中，于28 ℃、150 r/min下培養(yǎng)8 d，用紗布過濾收集菌絲與發(fā)酵液用于生物量和HA含量的測定。

在BCP聯(lián)合TX100的萃取發(fā)酵實驗中，在接種BCP處理的種子液后的第2、3、4、5、6、7和8天分別添加25 g/L的TX100啟動萃取發(fā)酵，培養(yǎng)9 d，用于生物量和HA含量的測定。

1.2.3 菌絲球形態(tài)觀察和直徑的測定

1)形態(tài)觀察。在竹黃菌生產(chǎn)發(fā)酵的第1、3、5和7天中的同一時間點，取適量菌絲球于培養(yǎng)皿中，在體視顯微鏡下觀察其形態(tài)并拍照。

2)菌絲球直徑測定。在竹黃菌生產(chǎn)發(fā)酵的第1、3、5和7天中的同一時間點，取適量菌絲球于培養(yǎng)皿中，通過刻度尺測量菌絲球直徑，繪制菌絲球直徑-時間圖。

1.2.4 濁點萃取及蘇丹黑B染色

1)濁點萃取竹紅菌素。取一定量的經(jīng)TX100萃取發(fā)酵9 d后的發(fā)酵液，5 000 r/min離心10 min去除菌絲體，取上清液用于濁點萃取竹紅菌素。具體操作：取上清液于玻璃試管中，置于水浴鍋中并緩慢升溫，當(dāng)溶液變渾濁時，可觀察到分層現(xiàn)象，靜置一段時間并拍照。

2)蘇丹黑B染色[11]。相分離后，濁點系統(tǒng)可分為稀相(dilute phase)和凝聚層相(coacervate phase)，取兩相溶液分別用蘇丹黑B染色后于顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5 HA提取和含量測定

1)胞內(nèi)HA的提取。將烘干的菌體取出，放入研缽，加液氮研磨成粉，精確稱取粉末，加10倍體積無水乙醇后超聲避光提取2 h，浸提24 h，提取液用0.45 μm的有機相針頭過濾器過濾，并用高效液相色譜法(HPLC)檢測HA含量。

2)胞外HA的提取。用3倍體積的乙酸乙酯萃取發(fā)酵液，旋蒸除去乙酸乙酯，所得提取物浸膏用2 mL無水乙醇重新溶解，提取液用0.45 μm的有機相針頭過濾器過濾，并用HPLC檢測HA含量。

3)色譜檢測條件。Agilent HC-C18色譜柱(250 mm× 4.6 mm)，柱溫25 ℃；流動相為乙腈-水溶液(體積比65∶ 35)，流速1 mL/min，檢測波長465 nm，進樣量20 μL。

1.2.6 統(tǒng)計分析

本實驗中，對照組和處理組均有3次獨立的重復(fù)實驗驗證(每次重復(fù)至少3個平行，n≥3)。采用Student’st-test分析實驗結(jié)果。每組數(shù)據(jù)表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。P<0.05代表具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 竹黃菌液體發(fā)酵中竹紅菌素的生產(chǎn)

竹黃菌生長曲線及竹紅菌甲素合成動態(tài)曲線如圖1所示。由圖1可知：當(dāng)接種1 mL的竹黃菌種子液后，菌絲在發(fā)酵的前5天快速生長，之后進入生長穩(wěn)定期。在接種后第2天開始菌絲內(nèi)HA快速積累，呈指數(shù)增長，同時釋放到胞外的HA也顯著增多，至第8天HA總產(chǎn)量積累最多，產(chǎn)量達峰值309.49 mg/L。

圖1 竹黃菌生長曲線及竹紅菌甲素合成動態(tài)曲線Fig.1 Time-courses of mycelia growth and HA biosynthesis of Shiraia sp.S8

2.2 固體顆粒對竹黃菌生長和竹紅菌素生產(chǎn)的影響

為了研究不同固體顆粒對竹黃菌生長和產(chǎn)HA的影響，分別使用Al2O3、talc和BCP處理竹黃菌的種子液，微粒對竹黃菌生長和產(chǎn)HA的影響如表1所示。由表1可知：在培養(yǎng)液中加入2 g/L的Al2O3、talc或BCP顆粒對竹黃菌的生物量均無顯著影響。Al2O3顆粒對竹黃菌HA總產(chǎn)量幾乎無影響，但talc和BCP顆粒均能顯著促進HA的合成，產(chǎn)量分別為556.31和619.64 mg/L，比對照組分別提高了104.05%和127.27%。后期我們采用BCP進一步優(yōu)化發(fā)酵條件(加入濃度和時間)。

表1 微粒對竹黃菌生長和產(chǎn)HA的影響Table 1 Effects of microparticles on biomass and HA production in Shiraia cultures

2.3 竹炭微粉處理發(fā)酵種子液的優(yōu)化

用0～20 g/L竹炭微粉(BCP)處理竹黃菌種子液，結(jié)果見表2。由表2可知：竹黃菌的生物量不受影響，胞內(nèi)HA含量和胞外HA產(chǎn)量均呈現(xiàn)出劑量依賴性，且2 g/L的竹炭微粉對HA的促進作用最顯著。用BCP處理竹黃菌種子液顯著影響其生產(chǎn)培養(yǎng)基中的菌球形態(tài)，即對照組中的菌絲球更大、更蓬松且菌絲分枝更多，而BCP處理組中的菌絲球更小、更緊密、菌絲分枝也少(圖2)。經(jīng)BCP(2 g/L)處理3 d后，竹黃菌胞內(nèi)HA含量和胞外HA產(chǎn)量分別增加了63.0%～64.9%和63.5%～147.4%，發(fā)酵8 d后HA總產(chǎn)量可達604.8 mg/L，是對照組的1.65倍(表3)。

表2 不同濃度BCP對竹黃菌生長和產(chǎn)HA的影響Table 2 Effects of BCP concentration on mycelia growth and HA production in Shiraia cultures

圖2 BCP(2 g/L)處理對生產(chǎn)培養(yǎng)基中菌絲球形態(tài)和直徑的影響Fig.2 Effects of 2 g/L BCP treatment on fungal morphology and average pellet diameters in the production culture

表3 竹炭微粉(2 g/L)對竹黃菌生長和HA合成的影響Table 3 Effects of 2 g/L BCP on fungal biomass and HA production in Shiraia cultures

2.4 竹炭處理竹黃菌種子液與Triton X-100萃取發(fā)酵的聯(lián)合

注：##表示P<0.01(與竹炭處理組比較)圖3 不同時間添加TX100萃取發(fā)酵對BCP(2 g/L)處理的竹黃菌生長和HA生產(chǎn)的影響Fig.3 Effects of 2 g/L TX100 addition time on the cell growth and HA production in Shiraia cultures treated with 2 g/L BCP in extractive fermentation

為了提高HA的產(chǎn)量，同時減輕產(chǎn)物抑制效應(yīng)和節(jié)約下游分離純化產(chǎn)物的成本，筆者將MPEC技術(shù)與萃取發(fā)酵相結(jié)合，即前期采用BCP(2 g/L)處理竹黃菌種子液，后期在生產(chǎn)發(fā)酵階段加入TX100(25 g/L)進行萃取發(fā)酵，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知：與單獨BCP處理組相比，在不同時間添加TX100對竹黃菌生物量和HA總產(chǎn)量均有影響，添加時間越遲，菌體受抑制的程度越小，HA總產(chǎn)量也越高。在第2、3天添加TX100顯著抑制菌體生物量和HA總產(chǎn)量，菌體生物量抑制程度分別為35.8%和24.7%。HA總產(chǎn)量抑制程度分別為90.9%和81.4%，其發(fā)酵液呈鮮紅或暗紅色。在第4～8天添加TX100對竹黃菌菌體生物量無顯著影響，胞內(nèi)HA含量顯著減少，均低于10 mg/g(以每克干質(zhì)量計算)，胞外HA產(chǎn)量顯著增加，其發(fā)酵液呈暗黑色，HA總產(chǎn)隨發(fā)酵時間的延長逐漸增加。在第8天添加TX100發(fā)酵1 d后，胞內(nèi)HA含量為4.38 mg/g，胞外HA產(chǎn)量為554.41 mg/L，HA總產(chǎn)量達615.29 mg/L，與BCP處理組(563.95 mg/L)無顯著差異。由此可見，TX100可將大多數(shù)菌絲內(nèi)的HA萃取到胞外的表面活性劑膠束溶液中。

2.5 竹紅菌素在濁點系統(tǒng)中的分配

TX100膠束溶液的相分離和竹紅菌素在濁點系統(tǒng)中的分配關(guān)系如圖4所示。由圖4可知：在BCP(2 g/L)處理竹黃菌的第8天添加TX100(25 g/L)發(fā)酵1 d后，發(fā)酵液經(jīng)75 ℃水浴1 h可分為兩層，形成濁點系統(tǒng)(上層的水相(dilute phase)和下層富含表面活性劑的油相(coacervate phase))，由于HA是疏水性產(chǎn)物，所以大都聚集于下層，故下層油相顏色明顯較深。用油溶性染料蘇丹黑B對上下層進行染色觀察，發(fā)現(xiàn)上層水相中存在水包油現(xiàn)象，下層油相中存在油包水現(xiàn)象。HPLC分析結(jié)果顯示，濁點萃取可有效地將HA富集到富含表面活性劑的油相中。

圖4 TX100膠束溶液的相分離結(jié)果和竹紅菌素在濁點系統(tǒng)中的分配Fig.4 Phase separation of TX100 micelle solution and pigments partitioning in cloud point system

2.6 討論

MPEC技術(shù)是調(diào)控真菌形態(tài)以及提高真菌代謝物產(chǎn)量的有效方法。Bai等[1]研究發(fā)現(xiàn)，利用CaCO3處理根霉菌(R.oryzae)種子液可減小其在生產(chǎn)培養(yǎng)基中的菌絲球直徑，并使乳酸的產(chǎn)量最高，可達72.62 g/L；在深綠木霉(T.viride)的種子液中添加10 g/L的Al2O3有利于纖維素的產(chǎn)生[2]；talc(12 g/L，10 μm)處理土曲霉(A.terreus)種子液可使其菌絲球直徑減小3倍以上，同時使洛伐他汀含量增加3.5倍[3]。此外，在裂褶菌(Schizophyllumcommune)的生產(chǎn)培養(yǎng)基中直接添加Al2O3(20 g/L，小于30 μm)可使裂褶菌的多糖產(chǎn)量從10 g/L增加至15 g/L，發(fā)酵周期從10 d縮減至7 d[20]。在本研究中，筆者分別用2 g/L的Al2O3(75～150 μm)、talc(45 μm)和BCP(2.3～5.5 μm)顆粒處理竹黃菌的種子液，研究這些顆粒對竹黃菌生長和HA合成的影響，發(fā)現(xiàn)talc和BCP顆粒均能促進HA的產(chǎn)量，其中BCP的促進效果最顯著，而Al2O3對竹黃菌的代謝無顯著影響。通過篩選BCP的最佳質(zhì)量濃度后，發(fā)現(xiàn)2 g/L的BCP處理竹黃菌種子液對HA的促進作用最顯著，且胞內(nèi)外HA產(chǎn)量均顯著增加，最終HA產(chǎn)量可達604.8 mg/L。

竹炭是一種環(huán)境友好的、低成本的可再生生物資源[21]，一般用作燃料，但它還可用于凈化水質(zhì)、居室調(diào)濕、吸附異味、制作保健產(chǎn)品和美容護膚等方面[22]。將粒徑為25～125 μm的竹炭作為吸附劑或除臭劑可以除去苯、甲苯、吲哚和含硫化合物等有毒物質(zhì)[23-24]。Kishimoto[25]研究發(fā)現(xiàn)竹炭可在不改變橄欖油外觀的情況下改善高酸性橄欖油的品質(zhì)，進而可減少未售出橄欖油的處置量。在本研究中，筆者首次應(yīng)用MPEC技術(shù)，將BCP作為一種固體顆粒刺激真菌的代謝產(chǎn)物。在筆者課題組前期的研究中，非生物誘導(dǎo)子如超聲、光暗比和紅光處理竹黃菌后，HA的產(chǎn)量為175.53～247.67 mg/L[26-28]。與這些非生物誘導(dǎo)子相比，BCP處理具有易制備、成本低和最有效的優(yōu)勢。因此，筆者的研究為BCP在菌絲無性發(fā)酵生物技術(shù)生產(chǎn)次生代謝物方面提供了新的應(yīng)用數(shù)據(jù)和實例。

微生物發(fā)酵中存在產(chǎn)物的負反饋抑制效應(yīng)，低底物溶解度、底物或產(chǎn)物的抑制和產(chǎn)物的降解是導(dǎo)致終產(chǎn)物產(chǎn)量較低的關(guān)鍵原因[7]，因此在萃取發(fā)酵時將表面活性劑添加到發(fā)酵液中，同時具有增加底物溶解度和萃取產(chǎn)物的作用，能有效解決上述問題。濁點萃取作為一種新型的液-液萃取技術(shù)，具有應(yīng)用范圍廣、萃取效率高、富集倍數(shù)大、有機溶劑用量小等優(yōu)點，它利用非離子表面活性劑膠束水溶液的溶解性和“濁點”特性，通過改變實驗條件(如溫度)達到其濁點時引發(fā)相分離，從而將待測物與基質(zhì)分離，并得到一定程度的富集[29]。Yang等[30]利用非離子表面活性劑Brij 35(4 g/L)對紅曲霉(Monascussp.NJ1)進行萃取發(fā)酵10 d，胞外紅色、橙色和黃色色素的產(chǎn)量相比于對照組分別增加了1.47、1.71和2.07倍。胡夢花等[31]發(fā)現(xiàn)在竹黃菌S.bambusicola(GDMCC 60438)生長的第70小時添加1%(體積分數(shù))的TX100啟動萃取發(fā)酵，菌絲體內(nèi)HA含量為0.88 mg/g，發(fā)酵液中HA的質(zhì)量濃度為101.03 mg/L，而對照組中菌絲體內(nèi)HA含量為17.40 mg/g，發(fā)酵液中未檢測到HA。將筆者在本研究中的結(jié)果與胡夢花等[31]的結(jié)果對比，可見MPEC技術(shù)與萃取發(fā)酵技術(shù)聯(lián)合使用更有利于HA的生物技術(shù)生產(chǎn)。筆者對胞外發(fā)酵液進行濁點萃取，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液在75 ℃水浴1 h的條件下可分為兩層，形成濁點系統(tǒng)：上層的水相和下層富含表面活性劑的油相。HPLC實驗結(jié)果表明，濁點萃取可有效地將HA富集到富含表面活性劑的油相中，是一種環(huán)境友好、成本低、條件溫和的真菌次生代謝成分萃取技術(shù)。

3 結(jié)論

通過Al2O3、talc和BCP顆粒處理竹黃菌種子液以建立竹黃菌液體發(fā)酵的MPEC技術(shù)，發(fā)現(xiàn)talc和BCP均可顯著促進HA合成，其中BCP對HA合成的促進作用更顯著。通過對BCP濃度的篩選后，發(fā)現(xiàn)2 g/L的BCP處理可使竹黃菌菌絲球直徑減小，HA總產(chǎn)量最高(可達604.8 mg/L)，是對照組的1.65倍。將MPEC技術(shù)與萃取發(fā)酵技術(shù)相結(jié)合，發(fā)現(xiàn)在BCP處理組竹黃菌生長的第8天添加25 g/L的TX100啟動萃取發(fā)酵1 d，菌絲體內(nèi)HA含量僅為4.38 mg/g，而胞外HA產(chǎn)量可達554.41 mg/L，可見TX100可將大多數(shù)菌絲體內(nèi)的HA(約90%)萃取至發(fā)酵液中。通過本研究的發(fā)酵策略，可簡化HA的提取過程、節(jié)約生產(chǎn)成本、提高生產(chǎn)效率，并為真菌活性次生代謝物的增產(chǎn)、分離提供一種新型生產(chǎn)工藝。