葉先文，張金蓮，鄧亞羚，劉敏敏，劉 穎，夏瀾婷，任洪民，李安全，葉嘉麗

(江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江西 南昌 330004)

冠狀病毒 (CoVs) 由單股正鏈RNA病毒構(gòu)成，屬于冠狀病毒科，具有外套膜，感染的動物和人有可能發(fā)展為呼吸道、腸道和神經(jīng)系統(tǒng)等疾病[1]。2019年爆發(fā)的新型冠狀病毒由國際病毒分類委員會分類為嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2 (SARS-CoV-2)，世界衛(wèi)生組織把這種病毒造成的疾病命名為COVID-19[2]。

COVID-19與嚴(yán)重急性呼吸綜合征 (SARS) 的病理機(jī)制類似，SARS-COV-2感染細(xì)支氣管上皮誘導(dǎo)細(xì)支氣管炎，侵入鄰近深部肺間質(zhì)，造成肺泡壁上皮細(xì)胞的損傷，進(jìn)而導(dǎo)致間質(zhì)和肺泡水腫、出血，同時肺泡內(nèi)形成透明膜[3]。石正麗團(tuán)隊報道了SARS-CoV-2與一種蝙蝠中的CoVs序列一致性高達(dá)96%，推測其宿主來源于蝙蝠[4]。肖永紅團(tuán)隊依據(jù)深度學(xué)習(xí)算法模擬得出SARS-CoV-2與嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒 (SARS-CoV)、蝙蝠SARS-CoV和中東呼吸綜合征冠狀病毒 (MERS-CoV) 具有相近的感染力，并推測出蝙蝠和水貂可能是SARS-CoV-2的源頭[5]。穿山甲CoVs的S蛋白與SARS-CoV-2兩者的受體結(jié)合域僅存在一個氨基酸差異，這說明穿山甲也可能是SARS-CoV-2的起源或中間宿主[6]。鐘南山團(tuán)隊在文獻(xiàn)報道中表明，63.4%的COVID-19患者的臨床癥狀是發(fā)燒，胸腔CT掃描出現(xiàn)肺異常，實驗研究表明COVID-19患者有淋巴細(xì)胞減少癥，反應(yīng)蛋白 (CRP) 水平增加[7]。

苦參是豆科植物苦參SophoraeflavescentisAit的干燥根，氣微，味極苦[8]?？鄥A類生物堿具有抗乙型肝炎病毒 (HBV) 的作用[9]，能誘導(dǎo)HepG 2.2.15細(xì)胞凋亡，將細(xì)胞增殖阻滯于S期[10]。對乙型肝炎病毒e抗原 (HBeAg)，乙型肝炎病毒s抗原 (HBsAg)的分泌也有抑制作用，高濃度的苦參堿能長期高效抑制HepG2.2.15細(xì)胞中HBV復(fù)制，該作用與病毒核酸復(fù)制和基因表達(dá)的抑制有關(guān)[11]?？鄥A類生物堿除抗HBV外，還能抗流感病毒、呼吸道合胞體病毒、牛乳頭狀瘤病毒和巨細(xì)胞病毒等[12]。COVID-19以“濕”邪為主，其病機(jī)為濕、毒、瘀、虛，中醫(yī)辨證為濕邪偏盛，而苦參味苦，性寒，是常用的燥濕藥，可退熱泄降，蕩滌濕火等，這為苦參可能治療COVID-19提供中醫(yī)藥理論基礎(chǔ)[2]。

近期網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)大量運用于中藥及中藥處方抗SARS-CoV-2研究，如藿香正氣口服液[13]、達(dá)原飲[14]、清肺排毒湯[15]等，本文基于TCMSP數(shù)據(jù)庫，運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探尋苦參抗SARS-CoV-2的可能機(jī)制。

1 方法

1.1 化學(xué)成分搜索 SymMap[16]通過內(nèi)部分子機(jī)制和外部癥狀定位，將中醫(yī)和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)結(jié)合，集TCM-ID、TCMID、TCMSP數(shù)據(jù)庫于一體。它收錄499種草藥、19 595種成分、1 717種相應(yīng)的中醫(yī)癥狀。以“苦參”為關(guān)鍵詞對其化學(xué)成分進(jìn)行搜索。

1.2 活性成分篩選 基于TCMSP[17]數(shù)據(jù)庫，以符合口服生物利用度(OB)>30%、類藥性(DL)>0.18為標(biāo)準(zhǔn)篩選化學(xué)成分，得到相應(yīng)的靶標(biāo)蛋白，即為活性成分。

1.3 靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析 通過UniProt[18]將靶標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)為相應(yīng)的基因名，String[19]構(gòu)建靶標(biāo)蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò) (PPI網(wǎng)絡(luò))，同時將核心靶點與COVID-19相關(guān)的靶點進(jìn)行共表達(dá)分析，利用Cytoscape 3.7.2[20]軟件平臺構(gòu)建化合物-靶點PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.4 靶點GO功能及KEGG通路富集分析 將靶點上傳至Metascape[21]，物種限定為人，閾值P<0.05，進(jìn)行GO生物功能富集分析，同時通過DAVID[22]進(jìn)行KEGG信號通路富集分析。

1.5 成分-靶點分子對接 從PDB[23]下載SARS-CoV-2 3CL 水解酶 (3CLpro) 和Uniprot新冠肺炎專題“View SARS-CoV-2 Proteins and Receptors”下的9個人體靶蛋白，見表1，TMPRSS2無晶體結(jié)構(gòu)，利用Swiss-Model進(jìn)行同源建模，見圖1。將10個目標(biāo)大分子通過Discovery Studio 2016 Client軟件對其進(jìn)行加氫，刪除水分子，移除配體等操作。將目標(biāo)成分及大分子上傳CB-Dock[24]進(jìn)行分子對接，以結(jié)合能≤-5.0 kJ/mol為分子-靶點有相互作用的依據(jù)[13-15]。

表1 3CLPro與9個人體靶蛋白信息

圖1 TMPRSS2預(yù)測模型

2 結(jié)果

2.1 化學(xué)成分篩選 基于SymMap獲得苦參化學(xué)成分114種，以O(shè)B>30%、和DL>0.18進(jìn)行篩選后得到45種。在TCMSP中，23種成分已通過PreDC (Predict Drug Combination) 預(yù)測靶標(biāo)蛋白，即為活性成分，見表2。

表2 苦參活性成分信息

2.2 化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)分析 將TCMSP獲取的靶標(biāo)蛋白以Uniprot進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，利用Cytoscape 3.7.2構(gòu)建化合物-靶點PPI網(wǎng)絡(luò)，見圖2，含223個節(jié)點、3 907條邊，其中23個節(jié)點為活性成分，剩余200個為相互作用靶點；平均度值Degree為35.04，倒三角形為成分，圓形為靶點，度值小于平均度值的底色為白色，度值越大越接近紅色，形狀也越大，以度值大于2倍Degree獲取核心網(wǎng)絡(luò)；成分K23 (Degree 145.0)、K13 (Degree 56.0)、K8 (Degree 36.0)可能為主要藥效物質(zhì)；靶點AKT1 (Degree 128.0)、IL6和TP53 (Degree 117.0)、PTGS2 (Degree 111.0) 等28個靶點均大于2倍的平均度值，可能為苦參主要作用的靶標(biāo)蛋白，見圖2，再對其進(jìn)行共表達(dá)分析，見圖3，在該共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)圖中，含34個節(jié)點、388條邊，平均度值22.8，其中27個節(jié)點為預(yù)測靶點 (除PTGS2)，剩余7個 (除MPP5、SGTA) 為與COVID-19相關(guān)的靶蛋白，提示核心靶點與新冠肺炎的發(fā)生發(fā)展具有緊密的相關(guān)性。

圖2 苦參成分-靶點PPI網(wǎng)絡(luò)

圖3 核心靶點與新冠肺炎相關(guān)靶點共表達(dá)分析

2.3 GO、KEGG信號通路富集分析 由Metascape獲得GO功能1 999項，其靶點按屬性可聚類成7項 (圖4A)，最顯著的一項以靶點淀粉樣β前體蛋白 (APP) 為中心，具有重要的突觸功能，充當(dāng)細(xì)胞表面受體，并在神經(jīng)元表面執(zhí)行與神經(jīng)突生長，神經(jīng)元粘附和軸突發(fā)生有關(guān)的生理功能[25]，將前20項保留，見圖4B，推測細(xì)胞對有機(jī)環(huán)化合物的反應(yīng)、對有毒物質(zhì)的反應(yīng)、細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑等可能是苦參抗SARS-CoV-2重要生物過程。由DAVID富集到132條結(jié)果，其中92條對應(yīng)多種疾病，如乙型肝炎、膀胱癌、前列腺癌等；通路有40條，較顯著的前3條為TNF信號通路、HIF-1信號通路、PI3K-Akt信號通路，大多與免疫和炎癥通路有關(guān)，提示苦參可能通過炎癥和免疫途徑抗SARS-CoV-2，見圖5。

2.4 分子對接 選擇表2中的生物堿 (苦參堿、槐果堿、槐定堿)及度值前三的化合物 (槲皮素、木犀草素、刺芒柄花素)，與表1中的靶蛋白進(jìn)行分子對接，結(jié)果見圖6～7。由此可知，目標(biāo)成分與10個目標(biāo)大分子的結(jié)合能均小于-5.0 kJ/mol，提示這些成分可能具有抗SARS-CoV-2的作用。

圖4 苦參作用靶點GO富集分析

圖5 苦參作用靶點KEGG信號通路富集(前20條通路)

圖6 苦參活性成分與目標(biāo)蛋白的結(jié)合能熱圖

圖7 苦參堿與MPP5的分子對接模式

3 討論

氣溶膠傳播、糞-口傳播有可能是SARS-CoV-2的傳播途徑。Vincent Munster團(tuán)隊報道了SARS-CoV-2和SARS-CoV在物體表面和氣溶膠中有相似的穩(wěn)定性和半衰期，表明SARS-CoV-2存在氣溶膠和其他途徑傳播[26]，有效的消毒對于減少SARS-CoV-2的氣溶膠傳播至關(guān)重要[27]。中山大學(xué)第五醫(yī)院在53.42%的COVID-19患者糞便中檢測出病毒RNA呈陽性，在胃腸道組織中也可檢測病毒RNA呈陽性，提示糞-口傳播可能為SARS-CoV-2的傳播途徑[28]。

吳玉章團(tuán)隊在咽拭子樣本和尿液中發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2的N蛋白的結(jié)果與核酸檢測100%匹配，在73.6%的被診斷為COVID-19的患者尿液中檢測到病毒N蛋白，這表明N蛋白可能作為COVID-19的診斷方法[29]。高水平的利鈉肽患者死亡風(fēng)險較大[30]，COVID-19患者可能發(fā)展為心肌炎和心力衰竭等嚴(yán)重心臟并發(fā)癥[31]。ACE2為SARS-COV-2入侵人體的主要受體蛋白，是抑制病毒與細(xì)胞結(jié)合、減少肺部和心臟損傷、抑制炎癥風(fēng)暴的潛在治療靶點[32]。3CLpro作為冠狀病毒的主要蛋白酶之一，具有高度保守性，在SARS-CoV-2的復(fù)制過程中起重要作用，可在藥物設(shè)計中作為關(guān)鍵靶標(biāo)[33]。NIH團(tuán)隊研究表明，ACE2主要在精原細(xì)胞、睪丸間質(zhì)細(xì)胞、以及支持細(xì)胞中表達(dá)，暗示睪丸可能也是SARS-CoV-2感染人體的靶點之一[34]。通過ePlant[35]對其進(jìn)行定位表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)ACE2在腎臟中高表達(dá)，在心臟、肺部、支氣管等也有表達(dá)，提示在COVID-19治療中，應(yīng)進(jìn)行多個器官觀察，見圖8。在COVID-19老年及重癥患者中，T細(xì)胞、CD4+和CD8+T細(xì)胞總數(shù)顯著減少，T細(xì)胞數(shù)與血清炎癥因子濃度呈負(fù)相關(guān)，而在恢復(fù)期這些因子卻下降，且T細(xì)胞計數(shù)逐漸恢復(fù)。不僅如此，T細(xì)胞的耗竭標(biāo)志物PD-1和Tim-3表達(dá)增高，進(jìn)一步提示T細(xì)胞功能耗竭和減少為COVID-19患者的重要臨床特征[36]。在感染SARS-CoV-2后，CD4+T細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)橹虏⌒缘腡h1細(xì)胞，并產(chǎn)生GM-CSF等。細(xì)胞因子誘導(dǎo)單核細(xì)胞 (CD14+，CD16+) 的IL-6的高表達(dá)，過多的炎癥反應(yīng)可能進(jìn)入肺循環(huán)，破壞了免疫環(huán)境，從而導(dǎo)致肺功能損傷和快速死亡[37]。

苦參堿類生物堿雙向調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，即高劑量免疫抑制，低劑量免疫促進(jìn)[38]。在CoVs肺炎寒濕疫毒襲肺病證結(jié)合小鼠模型中，苦參堿氯化鈉注射液對模型組小鼠肺指數(shù)抑制率高達(dá)86.86%，其機(jī)制與抑制病毒復(fù)制、調(diào)節(jié)免疫功能 (升高外周血CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞及B細(xì)胞的百分比) 和抑制炎癥因子 (IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ) 釋放有關(guān)[39]?？鄥A類生物堿有可能通過阻滯病毒吸附，減少病毒進(jìn)入細(xì)胞并且抑制病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制，從而產(chǎn)生抗病毒作用；對磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B信號通路有上調(diào)作用，對把關(guān)受體-4/髓樣分化因子-88/TNF-α 受體相關(guān)信號通路有下調(diào)作用；通過上調(diào)或下調(diào)相關(guān)通路，不僅增加了干擾素的表達(dá)，還阻滯了炎性因子表達(dá)，減少病毒對細(xì)胞的損傷[12,40]。氧化苦參堿聯(lián)合恩替卡韋可抑制p38蛋白磷酸化，同時下調(diào)鈉離子-?；悄懰峁厕D(zhuǎn)運蛋白 (NTCP) 的表達(dá)，這可能是其抗病毒的機(jī)制[41]。

圖8 ACE2在人體呼吸循環(huán)系統(tǒng)中的表達(dá)

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，獲得苦參潛在活性成分23種，可能靶點200個，對其成分-靶點進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，發(fā)現(xiàn)苦參堿、槐果堿、槐定堿、槲皮素、木犀草素、刺芒柄花素等可能是苦參抗SARS-CoV-2的關(guān)鍵成分，淀粉樣β前體蛋白 (APP)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶 (AKT1)、白細(xì)胞介素6 (IL6)、細(xì)胞腫瘤抗原p53 (TP53)、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2 (PTGS2) 等28個靶標(biāo)度值大于2倍平均度值，且27個靶標(biāo)與7個COVID-19相關(guān)靶點有緊密的共表達(dá)關(guān)系，提示這些核心靶點可能為苦參治療COVID-19的關(guān)鍵靶點。通過GO生物功能和KEGG信號通路富集分析，得到1 999個GO功能和132條KEGG信號通路。在GO功能中，多為細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)，如細(xì)胞對有機(jī)環(huán)化合物、有毒物質(zhì)、內(nèi)毒素、激素、氧化等應(yīng)激反應(yīng)；也有生物調(diào)節(jié)功能，如正向調(diào)節(jié)細(xì)胞因子、胰島素及活性氧代謝等。在KEGG信號通路富集分析中，TNF信號通路、HIF-1信號通路、PI3K-Akt信號通路、甲狀腺激素信號通路、p53信號通路、T細(xì)胞受體信號通路等40條通路可能為苦參抗SARS-CoV-2的途徑；乙型肝炎、膀胱癌、前列腺癌、非小細(xì)胞肺癌、HTLV-Ⅰ 感染、小細(xì)胞肺癌等92條疾病途徑也可能與苦參抗SARS-CoV-2有關(guān)。在與COVID-19相關(guān)靶點的分子對接中，苦參堿、槐果堿、槐定堿、槲皮素、木犀草素、刺芒柄花素與其結(jié)合能等均小于-5 kJ/mol，提示這些成分可能與新冠肺炎的相關(guān)靶點有良好的相互作用。

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法系統(tǒng)的在多成分、多靶點、多途徑層面闡明苦參抗SARS-CoV-2的可能機(jī)制，后續(xù)將通過動物體內(nèi)外試驗進(jìn)一步探索苦參抗SARS-CoV-2的藥效作用及機(jī)制，為COVID-19的治療提供更多依據(jù)。