徐莉莉，李祥婷，張 雯,2，蔡定芳,2，王 飛，向 軍,2*

(1.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，上海 200032；2.復(fù)旦大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院內(nèi)科研究所，上海 200032；3.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院藥劑科，上海 200032)

抑郁癥是以心情低落為主要癥狀的疾病，影響人體的認(rèn)知、行為和社會功能。據(jù)統(tǒng)計全球約有3.5億抑郁癥患者，造成嚴(yán)重的社會和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。抑郁癥患病率和復(fù)發(fā)率均高，有預(yù)測到2030年抑郁癥可能成為我國負(fù)擔(dān)排名首位的疾病[2]。目前治療藥物主要基于經(jīng)典的單胺類遞質(zhì)學(xué)說，具有一定的局限性。因此，越來越多的研究者將目光投向天然藥物[3-4]。

羅布麻ApocynumvenetumL.屬夾竹桃科植物，以干燥葉入藥，味甘、苦，性涼，歸肝經(jīng)，具有平抑肝陽、清熱利水等功效[5]。近年來，國內(nèi)外學(xué)者在動物模型中發(fā)現(xiàn)羅布麻具有較好的抗抑郁作用[6-7]，但其活性成分、作用靶點(diǎn)等尚不明確，因此本研究擬通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析羅布麻的抗抑郁的潛在機(jī)制，為進(jìn)一步研究提供參考。

1 方法

1.1 羅布麻成分收集和篩選 利用在線數(shù)據(jù)庫TCMSP(http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)、TCMID(http://www.megabionet.org/tcmid/)結(jié)合文獻(xiàn)檢索收集羅布麻主要活性成分，并根據(jù)毒藥物動力學(xué)(ADME)參數(shù)對所得成分進(jìn)一步篩選，包括藥物口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%、類藥性(drug likeness,DL)≥0.18。

1.2 羅布麻成分靶點(diǎn)預(yù)測 利用中藥成分靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫、靶點(diǎn)預(yù)測數(shù)據(jù)庫TCMSP、TCMID、文獻(xiàn)檢索進(jìn)行驗證靶點(diǎn)和預(yù)測靶點(diǎn)的垂釣，進(jìn)而獲取活性成分的作用靶點(diǎn)。

1.3 抑郁疾病靶點(diǎn)預(yù)測 采用疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫GeneCard(http：//www.genecards.org/)、DisGeNET(https://www.disgenet.org/)、TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)、OMIM(https：//omim.org/)，輸入關(guān)鍵詞“depression”，獲得抑郁的相關(guān)基因。

1.4 蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò) 利用Venny 2.1獲得成分與疾病的靶點(diǎn)的交集，導(dǎo)入String(http：//stringdb.org/)進(jìn)行蛋白互作分析，結(jié)果保存為TSV格式文件，并將其導(dǎo)入Cytoscape 3.8.1(http：//www.cytoscape.org/)軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。

1.5 成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用“1.1”“1.2”“1.3”項下所得結(jié)果構(gòu)建成分-靶點(diǎn)關(guān)系，Cytoscape 3.8.1(http://www.cytoscape.org/)軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)。

1.6 靶點(diǎn)功能和通路富集分析 利用基因本體(gene ontology,GO)、京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)數(shù)據(jù)庫，以及R 3.6.3軟件運(yùn)行的Bioconductor生物信息軟件包(http://www.bioconductor.org/)對靶點(diǎn)功能和通路進(jìn)行富集分析，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.7 分子對接 PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載小分子數(shù)據(jù)，采用openbabel將其轉(zhuǎn)化為mol2格式，并用autodocktools程序提供的腳本prepare_ligand4.py為小分子添加電荷，分配原子類型，所有可旋轉(zhuǎn)鍵均設(shè)置為柔性，保存為pdbqt格式，用于分子對接。RCSB蛋白晶體數(shù)據(jù)庫下載受體蛋白數(shù)據(jù)，在pymol 1.7程序中刪除受體蛋白結(jié)構(gòu)中的結(jié)晶水和其他小分子，添加氫原子后保存。載入AutoDocktool 1.5.6程序，添加電荷，分配原子類型，保存為pdbqt格式，作為分子對接受體，采用vina1.1.2軟件進(jìn)行分子對接。對接盒子大小設(shè)置為能夠恰好包含蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，選取對接最佳構(gòu)象作為分子對接結(jié)果，提取結(jié)合能(affinity)評分并進(jìn)行排序。結(jié)合力數(shù)值越低，表明結(jié)合越好。

2 結(jié)果

2.1 羅布麻活性成分及其靶點(diǎn) 數(shù)據(jù)庫中獲得56種羅布麻活性成分，經(jīng)篩選后得到6種，包括山柰酚、右旋兒茶精、表兒茶素、花青素B1、木犀草素、谷甾醇，另外金絲桃苷、蕓香苷OB值雖然較低，但大量文獻(xiàn)報道兩者抗抑郁作用[8-11]，故也將其納入，最終獲得8種，見表1。利用數(shù)據(jù)庫查詢上述活性成分的靶點(diǎn)信息，篩選去重后得到118個作用靶點(diǎn)。

表1 羅布麻活性成分

2.2 羅布麻抗抑郁潛在靶點(diǎn) 共篩選出756個與抑郁相關(guān)的靶點(diǎn)，采用Venny 2.1軟件取其與羅布麻活性成分靶點(diǎn)的交集，最終得到34個共同靶點(diǎn)，見圖1。

圖1 羅布麻活性成分靶點(diǎn)與抑郁靶點(diǎn)交集Venny圖

2.3 成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò) 網(wǎng)絡(luò)中共有113個節(jié)點(diǎn)及其相互聯(lián)系的184條邊，與疾病靶點(diǎn)作用最廣泛的成分是山柰酚、木犀草素、右旋兒茶精、蕓香苷，見圖2。

注：棕色三角形節(jié)點(diǎn)代表羅布麻活性成分，綠色長條形節(jié)點(diǎn)代疾病靶點(diǎn)，藍(lán)色長條形節(jié)點(diǎn)代表疾病。圖2 成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)

2.4 潛在靶點(diǎn)蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò) 如圖3A所示，網(wǎng)絡(luò)中共有33個節(jié)點(diǎn)及其相互聯(lián)系的277條邊。Degree值排名前20位的靶點(diǎn)見圖3B，可知INS、VEGFA、AKT1、TP53、IL-6、CAT、JUN、TNF等可能是抗抑郁的重要潛在靶點(diǎn)。

注：節(jié)點(diǎn)越大，顏色越深，表明該節(jié)點(diǎn)與其他節(jié)點(diǎn)之間的相互作用越廣泛密切。圖3 潛在靶點(diǎn)蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

2.5 GO分子功能富集分析 34個靶點(diǎn)通過GO富集分析，篩選出70個分子功能條目(P<0.05)，關(guān)系最密切的20條分子功能見圖4，包括細(xì)胞因子受體結(jié)合(cytokine receptor binding)、受體配體活性(receptor ligand activity)、細(xì)胞因子活性(cytokine activity)、生長因子受體結(jié)合(growth factor receptor binding)、血紅素結(jié)合(heme binding)、四吡咯結(jié)合(tetrapyrrole binding)、氧化還原酶活性(oxidoreductase activity)、磷酸酶結(jié)合(phosphatase binding)等。

圖4 GO功能富集分析氣泡圖

2.6 KEGG通路富集分析 34個靶點(diǎn)通過KEGG通路富集分析篩選出162條信號通路，關(guān)系最密切的20條信號通路見圖5，包括糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、C-型凝集素受體信號通路(C-type lectins receptor signaling pathway)、IL-17信號通路(IL-17 signaling pathway)、胰島素抵抗(Endocrine resistance)、Toll樣受體信號通路(Toll-like receptor signaling pathway)、T細(xì)胞受體信號通路(T cell receptor signaling pathway)等。

圖5 KEGG通路富集分析氣泡圖

2.7 分子對接 將羅布麻4種主要活性成分與5個關(guān)鍵抗抑郁靶點(diǎn)蛋白采用Vina 1.1.2軟件進(jìn)行分子對接，選取對接最佳構(gòu)象作為分子對接結(jié)果，提取對接結(jié)合能(affinity)評分并進(jìn)行排序，affinity值越低，表明結(jié)合越好。如表2所示，蕓香苷(rutin)與TP53、VEGFA、AKT1的結(jié)合評分最優(yōu)，而木犀草素(luteolin)與IL-6、INS的結(jié)合評分最優(yōu)，上述活性成分的與抗抑郁靶點(diǎn)的最佳復(fù)合結(jié)構(gòu)見圖6。

3 討論

抑郁癥是一個涉及多種神經(jīng)遞質(zhì)、腦區(qū)及環(huán)路、多種機(jī)制的病理過程，包括單胺類遞質(zhì)理論、GABA和其受體相互作用改變、神經(jīng)生化機(jī)制、腦內(nèi)谷氨酸濃度異常升高、腦內(nèi)神經(jīng)肽及受體改變、細(xì)胞因子水平改變、海馬神經(jīng)元營養(yǎng)/再生學(xué)說、星形膠質(zhì)細(xì)胞功能障礙、細(xì)胞信號機(jī)制異常等[12-14]。

表2 抗抑郁靶點(diǎn)分子對接評分

圖6 關(guān)鍵抗抑郁靶點(diǎn)與活性成分的最佳嵌合結(jié)構(gòu)

為了探討羅布麻抗抑郁機(jī)制，本研究通過文獻(xiàn)和網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫篩選出羅布麻8個活性成分，包括山柰酚、兒茶素、表兒茶素、花青素B1、木犀草素、谷甾醇、金絲桃苷、蕓香苷，及其與抑郁相關(guān)的34個作用靶點(diǎn)。隨后通過整合這34個靶點(diǎn)構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)INS、VEGFA、AKT1、TP53、IL-6、CAT、JUN、TNF等可能是羅布麻抗抑郁重要的潛在靶點(diǎn)。通過GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子受體結(jié)合、細(xì)胞因子活性、受體配體活性、生長因子受體結(jié)合、氧化還原酶活性、泛素蛋白連接酶結(jié)合、磷酸酶結(jié)合、蛋白磷酸酶結(jié)合等功能相密切相關(guān)。KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)與糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE信號通路、C-型凝集素受體信號通路、IL-17信號通路、胰島素抵抗、Toll樣受體信號通路、T細(xì)胞受體信號通路等密切相關(guān)。采用分子對接方法對關(guān)鍵抑郁靶點(diǎn)進(jìn)行驗證，木犀草素、蕓香苷與關(guān)鍵抗抑郁靶點(diǎn)能夠最佳結(jié)合。

綜合抑郁癥的病理生理學(xué)研究進(jìn)展以及羅布麻的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果，推測羅布麻抗抑郁機(jī)制可歸納為神經(jīng)炎癥、細(xì)胞凋亡兩個方面。其中神經(jīng)炎癥主要涉及炎性因子靶點(diǎn)IL-6、VEGFA、IL-2、IL-10、TNF、NOS3、NOS2等及其介導(dǎo)的T細(xì)胞受體信號通路、IL-17信號通路；細(xì)胞凋亡靶點(diǎn)AKT1、TP53、JUN、STAT1、BCL2、MAPK1、MAPK8、BAX等及其介導(dǎo)的凋亡信號通路。由于神經(jīng)炎癥與細(xì)胞凋亡之間的交叉重疊，且凋亡多為炎癥的下游反應(yīng)，因此羅布麻抗抑郁作用可能與其調(diào)控炎性因子介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥與細(xì)胞凋亡有關(guān)。

炎性因子是參與炎癥反應(yīng)的各類細(xì)胞因子的總稱，被認(rèn)為是抑郁癥的發(fā)病機(jī)制中重要的環(huán)節(jié)之一[12]。1991年Smith首次提出抑郁癥與巨噬細(xì)胞過度分泌細(xì)胞因子有關(guān)[15]，隨后越來越多的抑郁癥患者被發(fā)現(xiàn)免疫系統(tǒng)基因調(diào)節(jié)異常、免疫功能失調(diào)[16-18]。深入研究發(fā)現(xiàn)炎性因子可影響神經(jīng)遞質(zhì)代謝、神經(jīng)內(nèi)分泌以及神經(jīng)可塑性[12-14]，進(jìn)一步證實炎性因子介導(dǎo)的病理過程與抑郁癥關(guān)系密切。根據(jù)效應(yīng)的不同，炎性因子可分為促炎性因子和抗炎性因子。促炎性因子包括IL-1β、IL-2、IL-6、IFN-γ、TNF-α等，在炎癥反應(yīng)過程中加強(qiáng)炎癥反應(yīng)并且誘導(dǎo)生成了更多的炎癥因子，協(xié)助人體完成免疫反應(yīng)過程；抗炎性因子包括IL-4、IL-10、IL-13、TGF-β等，抑制免疫系統(tǒng)過度的產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[16-18]。研究發(fā)現(xiàn)抑郁癥病理過程中IL-10、IL-1受體拮抗劑與IL-4、IL-13、TGF-β和脂聯(lián)素等抗炎性因子的表達(dá)是下降的，若補(bǔ)充外源抗炎性因子則具有一定的抗抑郁作用，同時藥物的抗抑郁作用也可能與其對抗炎性因子表達(dá)的上調(diào)有關(guān)[17-18]。因此，抗炎策略被認(rèn)為在抑郁癥治療中有重要的應(yīng)用前景。

已有研究發(fā)現(xiàn)羅布麻提取物或水煎劑在心血管系統(tǒng)、骨關(guān)節(jié)系統(tǒng)的抗炎作用以及對TNF-α、PGE2等炎癥因子的調(diào)節(jié)作用[19-20]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，羅布麻的主要活性成分也表現(xiàn)出較好的抗炎和神經(jīng)保護(hù)作用。木犀草素可抑制脂多糖誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞活化及其釋放的多種促炎性因子如TNF-α、IL-1β、NO等[21]；蕓香苷可抑制三甲基錫誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞的活化及其釋放的促炎性因子，減輕海馬椎體細(xì)胞損傷[22]。因此，本研究推測羅布麻通過調(diào)控炎癥因子及其介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥是其抗抑郁的重要機(jī)制，后續(xù)研究中可借助細(xì)胞因子芯片等高通量檢測手段，篩選羅布麻相關(guān)的細(xì)胞因子表達(dá)譜，進(jìn)一步明確其作用靶點(diǎn)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。