王 娜，張 霞，王玉凈，張華林，孟亞麗

(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院，河北 石家莊 050000)

宮頸癌為威脅婦女生命健康的重大疾病，全球每年約有50萬新發(fā)病例，且其致死率高居女性惡性腫瘤第四位[1]。近年來，隨著宮頸癌篩查手段及水平的提高，宮頸癌發(fā)病率明顯下降，但仍然有一大部分患者確診時(shí)即為晚期而失去了手術(shù)的最佳階段[2]。目前，化療仍然是復(fù)發(fā)和晚期宮頸癌患者最主要的治療手段[3]。中藥治療宮頸癌具有低毒副作用、療效顯著、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，引起了廣大研究者的關(guān)注[4]。

牡荊素是來源于牡荊子和牡荊葉中的天然黃酮類化合物，具有預(yù)防心肌缺血再灌注損傷、降血糖、神經(jīng)保護(hù)、止痛、抗氧化、抗炎等生物活性[5]。研究發(fā)現(xiàn)，牡荊素能呈時(shí)間-劑量依賴性的抑制人肝癌細(xì)胞SMMC-7721的增殖，并誘導(dǎo)凋亡[6]。姜玲等[7]證實(shí)在體外牡荊素能抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞系干細(xì)胞樣細(xì)胞球的形成，但牡荊素抑制腫瘤細(xì)胞增殖的機(jī)制并未闡明，且其對宮頸癌的抑制作用相關(guān)報(bào)道較少。因此，本研究以人宮頸癌HeLa細(xì)胞為研究對象，在證實(shí)牡荊素具有抑制其增殖作用的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討與凋亡及細(xì)胞周期的關(guān)系，初步闡明其作用機(jī)制，以期為后續(xù)臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 試劑與藥物 牡荊素(純度>96%，南京道斯夫生物科技有限公司)；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(大連美侖生物技術(shù)有限公司)；細(xì)胞周期檢測試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司)；Bcl-2、Bax、caspase-3、p-P53、cyclin B1、cyclin E、GAPDH多克隆抗體(美國CST公司)。

1.2 儀器 YSK-239型高速離心機(jī)(美國Sigma公司)；IX7型倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；Multiscan-GO酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)；FACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國BD公司)；Mini-Protean小垂直板電泳儀(美國Bio-Rad公司)。

1.3 細(xì)胞株 人宮頸癌HeLa細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

2 方法

2.1 HeLa細(xì)胞增殖 HeLa細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，離心收集細(xì)胞并用完全培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/mL。取100 μL胞懸液于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)液，分為對照組，牡荊素低、中、高劑量組，分別加入含終濃度為0、2.5、5、10 μmol/L牡荊素完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h。采用MTT法，于450 nm波長處測光密度(OD)值。

2.2 細(xì)胞凋亡率檢測 HeLa細(xì)胞培養(yǎng)于6孔培養(yǎng)板中，按“2.1”項(xiàng)下方法分組處理，培養(yǎng)48 h后，離心并收集細(xì)胞于上樣管中。依次加入Annexin V-FITC結(jié)合液150 μL、Annexin V-FITC 3 μL、PI 2 μL重懸細(xì)胞，在室溫條件下于暗室內(nèi)孵育15 min。加入磷酸鹽緩沖液使終體積為500 μL，經(jīng)300目篩子濾過后，上機(jī)檢測，并通過Cell Quest軟件分析。

2.3 細(xì)胞周期檢測 HeLa細(xì)胞培養(yǎng)于6孔培養(yǎng)板中，按“2.1”項(xiàng)下方法分組處理，培養(yǎng)48 h后，離心并收集細(xì)胞于上樣管中。在4 ℃條件下用預(yù)冷至0 ℃75%乙醇固定HeLa細(xì)胞0.5 h，加少量磷酸鹽緩沖液重懸細(xì)胞，再加入適量PI使其終濃度為50 mg/L。在室溫條件下于暗室內(nèi)孵育30 min，加入磷酸鹽緩沖液使終體積為500 μL，經(jīng)300目篩子濾過后，上機(jī)檢測。

2.4 Western blot法檢測Bcl-2、Bax、caspase-3、p-P53、cyclin B1、cyclin E蛋白表達(dá) HeLa細(xì)胞培養(yǎng)于6孔培養(yǎng)板中，按“2.1”項(xiàng)下方法分組處理，培養(yǎng)48 h后，離心并收集細(xì)胞于1.5 mL離心管中。在冰水浴下加入細(xì)胞裂解液裂解0.5 h，離心取上清，采用考馬斯亮藍(lán)法測總蛋白濃度。經(jīng)12%SDS-PAGE凝膠電泳分離目的蛋白，并通過濕轉(zhuǎn)法將目的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上。用封閉液在4 ℃條件下封閉2 h，再用稀釋后(1∶2 000)一抗(Bcl-2、Bax、caspase-3、p-P53、cyclin B1、cyclin E)孵育過夜，二抗(1∶5 000)孵育2 h。采用ECL法顯色，以GAPDH為內(nèi)參蛋白，Image J軟件對目的蛋白條件進(jìn)行分析與半定量。

3 結(jié)果

3.1 牡荊素對HeLa細(xì)胞增殖的影響 與對照組比較，牡荊素各劑量組在24、48、72 h內(nèi)HeLa細(xì)胞存活率均下降(P<0.05，P<0.01)，且隨著藥物濃度及作用時(shí)間的延長，細(xì)胞存活率越低，具有明顯的劑量依賴關(guān)系及時(shí)間依賴關(guān)系，結(jié)果見表1。由此可知，牡荊素具有抑制HeLa細(xì)胞增殖的作用。

表1 牡荊素對HeLa細(xì)胞增殖的影響

3.2 牡荊素對HeLa細(xì)胞凋亡率的影響 與對照組比較，牡荊素各劑量組HeLa細(xì)胞48 h后的細(xì)胞凋亡率均增加(P<0.01)，結(jié)果見圖1。由此可知，牡荊素對HeLa細(xì)胞凋亡率的誘導(dǎo)作用，隨著作用劑量的增加而增強(qiáng)，表現(xiàn)出明顯的劑量依賴關(guān)系。

注：與對照組比較，**P<0.01。圖1 牡荊素對HeLa細(xì)胞凋亡率的影響(n=5)

3.3 牡荊素對HeLa細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與對照組比較，牡荊素各劑量組HeLa細(xì)胞Bcl-2表達(dá)降低(P<0.05，P<0.01)，Bax表達(dá)升高(P<0.01)，牡荊素中、高劑量組HeLa細(xì)胞caspase-3表達(dá)升高(P<0.01)，牡荊素低劑量組caspase-3表達(dá)升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，結(jié)果見圖2、表2。由此可知，牡荊素具有HeLa細(xì)胞凋亡作用。

圖2 牡荊素對HeLa細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3.4 牡荊素對HeLa細(xì)胞周期分布的影響 與對照組比較，牡荊素各劑量組HeLa細(xì)胞S期細(xì)胞數(shù)減少(P<0.05，P<0.01)，而G1細(xì)胞數(shù)增加(P<0.05，P<0.01)，結(jié)果見圖3。由此可知，牡荊素對HeLa細(xì)胞周期G1/S進(jìn)程具有阻滯作用。

表2 牡荊素對HeLa細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖3 牡荊素對人宮頸癌HeLa細(xì)胞周期分布的影響(n=5)

3.5 牡荊素對HeLa細(xì)胞p-P53、cyclin B1、cyclin E蛋白表達(dá)的影響 與對照組比較，牡荊素組各劑量組HeLa細(xì)胞p-P53表達(dá)增加(P<0.01)，cyclin B1、cyclin E蛋白表達(dá)降低(P<0.05，P<0.01)，結(jié)果見圖4、表3。由此可知，牡荊素具有細(xì)胞周期阻滯作用。

4 討論

細(xì)胞凋亡與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，凋亡進(jìn)程由多種基因嚴(yán)密調(diào)控，是一種為適應(yīng)外部環(huán)境而進(jìn)行的主動(dòng)性程序死亡過程[8]。在眾多的凋亡調(diào)控基因中，B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl-2)和Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)在宮頸癌等多種腫瘤中表達(dá)異常，為細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵調(diào)控因子，已成為多種抗癌藥物研發(fā)的熱門靶點(diǎn)[9]。Bcl-2基因可阻斷細(xì)胞凋亡進(jìn)程，而作為Bcl-2同源基因的Bax則具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用[10]。細(xì)胞凋亡最主要的途徑為線粒體凋亡途徑，凋亡信號首先促使線粒體的通透性轉(zhuǎn)換孔開放，隨后使線粒體跨膜電位下降，進(jìn)而導(dǎo)致線粒體膜功能障礙，引起半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)的激活及表達(dá)增加，誘發(fā)caspase家族級聯(lián)反應(yīng)，最終使細(xì)胞發(fā)生凋亡[11]。本研究首先采用Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞法在細(xì)胞水平上，發(fā)現(xiàn)牡荊素具有誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡的作用；進(jìn)而采用Western blot法在分子水平上，證實(shí)牡荊素可以降低HeLa細(xì)胞Bcl-2表達(dá)、增加Bax、caspase-3表達(dá)，進(jìn)一步提示牡荊素抑制HeLa細(xì)胞增殖作用與誘導(dǎo)凋亡有關(guān)。

圖4 牡荊素對人宮頸癌HeLa細(xì)胞p-P53、cyclin B1、cyclin E蛋白表達(dá)的影響

表3 牡荊素對人宮頸癌HeLa細(xì)胞p-P53、cyclin B1、cyclin E蛋白表達(dá)的影響

近年來，細(xì)胞癌變與細(xì)胞周期的關(guān)系已成為廣大研究者關(guān)注的焦點(diǎn)，通過靶向細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑中的相關(guān)蛋白，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程[12]。除G0期、G1期、S期、G2期及M期外，G1/S期是最為重要的檢查點(diǎn)，其可監(jiān)測DNA合成的保真度和細(xì)胞組分的完整性[13]。本研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，人宮頸癌HeLa細(xì)胞經(jīng)不同濃度的牡荊素處理48 h后，S期細(xì)胞數(shù)減少，而G1細(xì)胞數(shù)增加，提示牡荊素對HeLa細(xì)胞周期G1/S進(jìn)程具有阻滯作用。p53蛋白是基因組的監(jiān)護(hù)者，致癌信號、DNA損傷等細(xì)胞應(yīng)激均會激活p53信號通路，進(jìn)而活化多個(gè)下游途徑，使細(xì)胞周期檢查點(diǎn)G1/S期暫時(shí)停頓，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及衰老[14]。細(xì)胞周期蛋白及細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶共同調(diào)控細(xì)胞周期的進(jìn)程，其中細(xì)胞周期蛋白cyclin B1和cyclin E是促進(jìn)G1期向S期轉(zhuǎn)換的主要調(diào)節(jié)蛋白，若表達(dá)降低，則會導(dǎo)致G1/S進(jìn)程受阻[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)人宮頸癌HeLa細(xì)胞經(jīng)不同濃度的牡荊素處理48 h后，p-P53表達(dá)增加，而cyclin B1、cyclin E蛋白表達(dá)降低，進(jìn)一步提示牡荊素具有阻滯細(xì)胞周期G1/S進(jìn)程的作用。

綜上所述，牡荊素可能通過誘導(dǎo)人宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯，發(fā)揮抑制HeLa細(xì)胞增殖作用，為牡荊素治療宮頸癌提供重要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，也可為牡荊素抗腫瘤作用機(jī)制的研究提供新的思路。