安 冬，梁永林.2*，李 璐，毛慧芳

(1.甘肅中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，甘肅 蘭州 730000；2.敦煌醫(yī)學與轉化教育部重點實驗室，甘肅 蘭州 730000)

“陰中求陽”法是趙獻可、張景岳在對陰陽互根互用關系認識的基礎上創(chuàng)立的治療腎陽虛證的原則。在《醫(yī)貫·陰陽論》中趙獻可指出“真元致病，即以水火之真調(diào)也。然不求其屬，投之不入。……火以水為主，水以火為原……取之陽者，水中求火，其明不熄”。趙獻可提出水為火之主體，腎陽虛致病，不只在“火衰”，而在于“水虧”，應滋水之源以助火“不熄”。在《景岳全書·陰陽篇》中張景岳提出“陰根于陽,陽根于陰。凡病有不可正治者，當從陽以引陰，從陰以引陽，各求其屬而衰之”，認為腎陰腎陽如陰陽水火，同出一根，互為前提，治療時當各求其屬。右歸丸作為“陰中求陽”的經(jīng)典方，充分體現(xiàn)張氏“陰中求陽，陽得陰助而生化無窮”的補腎原則。相關研究表明[1-3]，腎陽虛證存在線粒體能量代謝障礙。采用氫化可的松誘導的腎陽虛大鼠動物模型，將右歸丸拆分為滋陰藥組和補陽藥組，及運用全方組對其進行干預，觀察線粒體能量代謝在右歸丸全方組及拆方組干預下的變化規(guī)律，研究右歸丸“陰中求陽”配伍作用機理，揭示“陰中求陽”法的實質(zhì)。

1 材料

1.1 動物 56只SPF級SD大鼠，雄性，體質(zhì)量(200±20)g，購自中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所，動物生產(chǎn)許可證號SCXK (甘) 2015-0001。

1.2 試劑與藥物 氫化可的松注射液購自國藥集團容生制藥有限公司(批號1804217)。琥珀酸脫氫酶(SDH)、Na+-K+-ATPase、乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒、ATP水平測定、蛋白濃度測定試劑盒均購自南京建成科技有限公司，批號分別為20190919、20191006、20191021、20191004、20191016；細胞色素c氧化酶(CCO)檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司(批號20191010)。

1.3 儀器 通用臺式高速離心機(美國Sigma公司)；Biorad iMark酶標儀(美國Bio-Rad公司)；氣浴恒溫搖床(美國Scilogex儀器公司)；恒溫金屬浴(上海一恒科技有限公司)，掌上離心機[生工生物工程(上海)股份有限公司]；電子天平(奧豪斯儀器有限公司)。

2 方法

2.1 分組與造模 將56只SD大鼠隨機分為5組，分別為模型組、右歸丸組、滋陰組、補陽組(12只/組)，空白對照組8只。除空白對照組外，其余各組大鼠于每天上午8:30背部皮下注射5 mg/mL氫化可的松25 mg/kg，持續(xù)2周，制備腎陽虛模型[4]。若造模組大鼠出現(xiàn)精神狀態(tài)萎靡、活動反應遲鈍、爪甲與耳廓顏色變淡、體毛失去光澤、糞質(zhì)稀薄、弓背蜷縮、喜扎堆等典型腎陽虛表現(xiàn)，攝食量及飲水量減少，肛溫顯著下降及體質(zhì)量增長緩慢，并且與空白對照組比較，cAMP水平下降，cGMP水平升高，cAMP/cGMP比值降低 (P<0.05)，表明造模成功[5-6]。造模結束時，測定空白對照組、模型組大鼠體質(zhì)量和肛溫。根據(jù)課題組前期預實驗結果，取各組大鼠腹腔靜脈血，測定cAMP、cGMP。

2.2 藥物制備及給藥 根據(jù)《景岳全書》[7]確定藥物配伍與劑量。右歸丸組方藥材熟地黃24 g、山茱萸9 g、炒山藥12 g、枸杞子12 g、鹿角膠(鹿角霜)12 g、菟絲子12 g、杜仲12 g、肉桂6 g、當歸9 g、制附子6 g，滋陰組組方藥材熟地黃24 g、炒山藥12 g、枸杞子12 g、山茱萸9 g、當歸9 g，補陽組組方藥材肉桂6 g、杜仲9 g、制附子6 g、鹿角膠(鹿角霜)12 g、菟絲子12 g。以上中藥材均購自甘肅中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，經(jīng)藥劑科張鑒定符合規(guī)定。

按中藥常規(guī)煎法進行煎煮，以上各配伍組的藥物總質(zhì)量與水的比例設定為1∶10，取總水量的50%，先將其他藥物浸泡30 min，同時含制附子的藥物加入總水量的20%煎煮30 min以去除毒性，再加入浸泡后的藥物共煎30 min(用大火煮沸后調(diào)至小火保持微沸)后，用紗布過濾藥液，剩余殘渣加總水量30%的水進行二次煎煮，30 min后用紗布過濾藥液，將2次藥液合并，濃縮至含生藥1 g/mL的濃縮液，4 ℃恒溫保存?zhèn)溆?。按照人和動物體表面積換算系數(shù)[8]計算出給藥劑量，結果右歸丸組、滋陰組、補陽組分別按生藥10.26、6.21、4.05 g/kg劑量灌胃，空白組、模型組大鼠以生理鹽水灌胃，體積均為7.5 mL/kg，1次/d，連續(xù)28 d。

2.3 標本收集與指標檢測 大鼠末次給藥后，測定肛溫和體質(zhì)量，給予10%水合氯醛溶液(3 mg/kg)腹腔注射麻醉。常規(guī)備皮，剖開腹腔，取下腔靜脈血，室溫下放置10～20 min，2～8 ℃離心20 min(2 000～3 000 r/min)，收集上清，采用ELISA法檢測血清cAMP和cGMP。

迅速取下大鼠肝臟，取組織0.5～1 g，按1∶9比例量取生理鹽水制備勻漿液[9-10]，1 000 r/min 離心10 min(0～4 ℃)，取上清液裝入樣品管，采用酶標儀法測定大鼠肝線粒體SDH、Na+-K+-ATPase、CCO、LDH活性及ATP；另一部分組織用刀片快速切成約0.5 mm×0.5 mm×0.5 mm的小塊，經(jīng)過戊二醛固定、磷酸緩沖液漂洗、脫水、滲透包埋、切片、染色后，在顯微鏡下觀察采集圖像。

3 結果

3.1 一般狀況 在造模1周左右，空白對照組大鼠活動正常，反應靈敏，體毛順澤，無扎堆(取暖)表現(xiàn)，食量、飲水量正常；其余各組大鼠精神狀態(tài)欠佳，毛發(fā)暗淡，喜扎堆，糞質(zhì)稀薄，肛周污染，攝食量及飲水量減少。藥物干預結束時，模型組大鼠腎陽虛癥狀嚴重；右歸丸組大鼠腎陽虛癥狀明顯好轉，精神狀態(tài)恢復，體毛順澤明亮，扎堆癥狀消失，糞質(zhì)不稀薄、部分干燥；滋陰組和補陽組大鼠腎陽虛癥狀略微改善。

3.2 造模后肛溫、體質(zhì)量、血清cAMP/cGMP比值 與空白對照組比較，模型組大鼠肛溫、體質(zhì)量、cAMP/cGMP比值均下降(P<0.05，P<0.01)，見表1。

表1 造模后各組大鼠體溫、體質(zhì)量及血清cAMP/cGMP比值

3.3 干預后肛溫、體質(zhì)量、血清cAMP/cGMP比值 與空白對照組比較，模型組大鼠肛溫、體質(zhì)量、cAMP/cGMP比值降低(P<0.05，P<0.01)。與模型組比較，右歸丸組大鼠肛溫、體質(zhì)量、cAMP/cGMP比值均升高(P<0.01)；補陽組大鼠肛溫無明顯變化，體質(zhì)量和cAMP/cGMP比值升高(P<0.05)；滋陰組大鼠肛溫、體質(zhì)量、cAMP/cGMP比值變化不明顯。與空白對照組比較，右歸丸組大鼠肛溫有所恢復，體質(zhì)量近似正常水平，cAMP/cGMP比值變化不明顯；補陽組大鼠體質(zhì)量較低，cAMP/cGMP比值降低(P<0.05，P<0.01)，見表2。

表2 干預后各組大鼠肛溫、體質(zhì)量及cAMP/cGMP比值

3.4 肝線粒體能量代謝 與空白對照組比較，模型組大鼠4種酶活性及ATP水平均下降(P<0.01)。經(jīng)滋陰組藥物干預后，與模型組比較，Na+-K+-ATPase、LDH活性及ATP水平升高(P<0.05)，SDH、CCO活性無明顯變化(P>0.05)；與空白組比較，Na+-K+-ATPase、LDH活性及ATP仍然處于較低水平(P<0.05，P<0.01)。經(jīng)補陽組藥物干預后，與模型組比較，SDH、Na+-K+-ATPase、LDH活性和ATP水平升高(P<0.05，P<0.01)，CCO活性無明顯變化；與空白組比較，SDH、LDH活性及ATP水平基本恢復正常水平，Na+-K+-ATPase活性仍然處于較低水平(P<0.05)。經(jīng)右歸丸全方藥物干預后，與模型組比較，四種酶活性及ATP水平均升高(P<0.05，P<0.01)，與空白組比較，四種酶活性及ATP含量基本恢復正常水平；與補陽組比較，右歸丸組SDH、LDH活性及ATP水平略高，見表3。

表3 各組大鼠SDH、Na+-K+-ATPase、CCO、LDH活性及ATP含量

3.5 肝組織透射電鏡 與空白對照組比較，模型組異常線粒體腫脹破裂，膜邊緣模糊，嵴斷裂消失等結構異常性變性，部分線粒體空泡樣變性。與模型組比較，補陽組和滋陰組線粒體膜邊緣清晰，脊數(shù)量增加，排列疏松，但較對照組，脊數(shù)量減少；右歸丸組線粒體結構基本恢復，脊數(shù)量增加，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體等細胞器結構正常。見圖1。

圖1 各組大鼠肝線粒體超微結構(×20 000)

4 討論

腎陽對機體臟腑功能和機體活動的調(diào)節(jié)作用與線粒體能量代謝的水平和功能狀態(tài)影響人體機能活動之間具有相關性[1]。若腎中陽氣不足，機體出現(xiàn)機能衰退，代謝減緩、產(chǎn)熱不足等功能障礙及相關癥狀，與現(xiàn)代醫(yī)學中的線粒體功能障礙而導致的產(chǎn)能不足的病理變化相似[11]。ATP含量是衡量線粒體功能和能量代謝水平的直觀指標[12]。它是糖、脂肪、蛋白質(zhì)在線粒體內(nèi)經(jīng)過三羧酸循環(huán)、電子傳遞過程，最終發(fā)生氧化磷酸化產(chǎn)生。SDH是參與三羧酸循環(huán)的關鍵酶，其活性可作為評價三羧酸循環(huán)程度的指標[13]。Na+-K+-ATP酶(鈉泵)通過排鈉保鉀維持著細胞內(nèi)外離子濃度梯度，以保證物質(zhì)運送、能量轉換及信息傳送等[14]。CCO是呼吸鏈電子傳遞的最后一個載體，最終將電子傳遞給氧分子，其功能的喪失意味著呼吸鏈的中斷及氧化磷酸化障礙。LDH活性的高低，在一定程度上能反映糖酵解能力的高低，糖酵解障礙則合成ATP的原料減少[15]。腎陽虛證大鼠上述酶活性及ATP含量降低，存在能量代謝障礙。經(jīng)右歸丸干預后，能量代謝障礙得以調(diào)節(jié)，腎陽虛癥狀明顯改善。經(jīng)補陽組藥物干預后，大鼠腎陽虛癥狀有所恢復，但較右歸丸組較慢。滋陰組藥物對腎陽虛證能量代謝障礙基本沒有調(diào)節(jié)作用。

右歸丸全方“陰中求陽”的組方配伍對能量代謝障礙的調(diào)節(jié)作用更為顯著，其優(yōu)勢在于兩方面，一方面右歸丸中熟地黃用量最大，并協(xié)同山茱萸、山藥、枸杞子、當歸滋補肝腎陰、填精益髓，為制附子、肉桂、鹿角膠、杜仲、菟絲子溫補腎陽奠定物質(zhì)基礎，補精以化腎氣、助陽而不傷陰[16]，腎陽“得陰助而生化無窮”，故能量代謝酶的活性和ATP含量顯著上升。另一方面則體現(xiàn)在對腎中所藏之氣的調(diào)節(jié)。腎氣(元氣)源于先天之精，并受后天水谷之精氣和肺吸入的自然界清氣相合而成的宗氣，以三焦為通道下丹田以養(yǎng)之，此即為命門所藏相火，以水為宅安居在下焦。相火妄動與否，就取決于腎陰(水)的涵養(yǎng)[17]。右歸丸中滋陰藥和補陽藥多數(shù)以味厚之品[18]，以沉降之性使命門相火潛入腎陰，則腎水不寒。補陽組單純扶陽相當于在爐中直接加火，不加碳，沒有物質(zhì)基礎，一時之火是可起作用，但并不長久，一則沒有來源，二則無處潛藏。在線粒體能量代謝機制中，右歸丸“陰中求陽”通過提高相關能量代謝酶的活性，相繼發(fā)揮底物利用、催化脫氫、傳遞氫、傳遞電子等作用，最終將電子傳遞給O2產(chǎn)生H2O，發(fā)生氧化磷酸化產(chǎn)生ATP，完成了通過物質(zhì)代謝(陰)生成能量(陽)的過程。以上分屬于兩個體系中的兩個過程在“陰中求陽”的作用機理中達到統(tǒng)一。