韓永梅，衛(wèi)愛武

(河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046)

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion，RSA)是指連續(xù)發(fā)生至少2次妊娠不足20周胎兒丟失的病理現(xiàn)象，屬于育齡期女性常見病和疑難病[1]。研究顯示，胎盤植入的局部微環(huán)境異常改變是導(dǎo)致胎兒丟失的主要原因，胎盤植入過程與胚胎、子宮內(nèi)膜等多因素相關(guān)，其中免疫微環(huán)境調(diào)節(jié)至關(guān)重要[2]。中醫(yī)學(xué)在治療復(fù)發(fā)性流產(chǎn)方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，現(xiàn)代中醫(yī)學(xué)通過聚類分析發(fā)現(xiàn)，腎虛血瘀是臨床復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者最為常見的證型，認(rèn)為腎虛沖任不固為本，瘀血阻滯胞宮為標(biāo)[3]。補(bǔ)腎活血方是根據(jù)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)病機(jī)及辨證論治原則，該方由中醫(yī)經(jīng)典補(bǔ)腎安胎方藥壽胎丸《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》及養(yǎng)血活血安胎方藥芎歸湯《景岳全書·婦人規(guī)》配伍而成，具有補(bǔ)腎活血之功效[4]。為觀察補(bǔ)腎活血方對(duì)常規(guī)西藥對(duì)腎虛血瘀型復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的輔助效果，本研究通過建立腎虛血瘀型復(fù)發(fā)性流產(chǎn)小鼠模型，分析其對(duì)胚胎種植及子宮免疫微環(huán)境的影響及機(jī)制，為臨床復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的治療提供依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)雌性CBA/J小鼠72只，雄性DBA/2小鼠30只，BALB/c小鼠6只，均為8周齡，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)自北京科宇動(dòng)物養(yǎng)殖中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(京)2018-0010。

1.2 藥物 菟絲子12 g，川續(xù)斷、桑寄生、阿膠、川芎各6 g，當(dāng)歸9 g，藥材均購(gòu)自上海市同仁堂藥業(yè)股份有限公司。除阿膠外，其余藥材加水浸泡30 min，武火煎煮30 min，取藥液200 mL過濾，再次加水文火煎煮30 min，取藥液200 mL過濾；兩次藥液合并煎煮，阿膠烊化混入藥液，制成含生藥1 g/mL濃煎液，4 ℃保存?zhèn)溆谩５厍型?荷蘭Abbott Biologicals B.V.公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20170221，規(guī)格10 mg)。

1.3 試劑 小鼠γ干擾素(interferon-γ，IFN-γ)、白細(xì)胞介素-4(interleukin-4，IL-4)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(批號(hào)C12592、C3021，美國(guó)Cygnus公司)；大鼠抗小鼠CD4+、CD8+單抗(批號(hào)PAB16751、PAB16420，美國(guó)AbD Serotec公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào)RR047 A，日本TaKaRa公司)；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)試劑盒(批號(hào)WE0129-DBI，北京百奧萊博科技有限公司)；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量分析試劑盒(批號(hào)QPBCA-1KT，美國(guó)Thermo公司)；大鼠抗小鼠腫瘤壞死因子受體I型(tumor necrosis factor receptor type I，TNFR1)、Fas相關(guān)死亡域蛋白(Fas-related death domain protein，F(xiàn)ADD)、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(B lymphocyte tumor-2 gene，Bcl-2)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-8(containing aspartate proteolytic enzyme-8，caspase8)一抗(批號(hào)ab231925、ab119059、ab218123、ab25901，英國(guó)Abcam公司)；辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記IgG二抗(批號(hào)23-72101，武漢艾迪抗生物科技有限公司)。

2 方法

2.1 分組和模型制備 72只雌性CBA/J小鼠按照體質(zhì)量隨機(jī)分組法分為正常組、模型組、西藥組、高劑量組、低劑量組和聯(lián)合組，每組12只。除正常組外，其余各組制備腎虛血瘀型復(fù)發(fā)性流產(chǎn)小鼠模型[5]，灌胃0.2 mL羥基脲，同時(shí)皮下注射12 μL腎上腺素，連續(xù)1周；正常組小鼠灌胃0.2 mL超純水，皮下注射12 μL生理鹽水，連續(xù)1周。1周后正常組雌鼠與BALB/C雄鼠按2∶1比例合籠飼養(yǎng)，其余各組雌鼠與DBA/2雄鼠按2∶1比例合籠飼養(yǎng)1～2 d，合籠次日清晨檢出陰栓或陰道分泌物將其涂片見精子則記為孕1 d。

2.2 給藥方法 按照人與小鼠間的等效劑量換算[6]，小鼠灌胃地屈孕酮臨床等效劑量為3.6 g/kg，補(bǔ)腎活血湯劑量臨床等效劑量為100 g/kg。自孕1 d開始，西藥組灌胃36 μg/10 g地屈孕酮片水溶劑，高、低劑量組灌胃200、100 g/kg補(bǔ)腎活血湯，聯(lián)合組同時(shí)灌胃200 g/kg補(bǔ)腎活血湯和3.6 g/kg地屈孕酮片水溶劑，正常組和模型組灌胃等量生理鹽水，每天1次，連續(xù)14 d。

2.3 胚胎丟失率計(jì)算 孕15 d后處死各組小鼠，剖腹取子宮組織，統(tǒng)計(jì)丟失胚胎數(shù)和正常胚胎數(shù)，正常胚胎呈大小均一的串珠狀，胚胎中間見紅色條索狀胎盤，丟失胚胎呈黑色或紫褐色，大小不均一，部分胚胎萎縮。計(jì)算胚胎丟失率為丟失胚胎數(shù)占總胚胎數(shù)的比例。

2.4 組織取材 冰上縱向剖開子宮組織，剝離胚胎后，取部分子宮組織，稱定質(zhì)量后剪碎，按照1∶9比例加入磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)，立即勻漿，4 ℃預(yù)冷離心機(jī)，12 000 r/min離心10 min(離心半徑10 cm)，取勻漿上清液，于-80 ℃保存?zhèn)溆?。取部分子宮組織，置于40%中性甲醛中固定48 h備用。剝離蛻膜組織，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5 子宮組織病理學(xué) 取40%中性甲醛中固定的子宮組織，常規(guī)石蠟包埋，制作厚度為4 μm的連續(xù)切片，每只小鼠取5張切片，切片經(jīng)脫蠟，酒精水化后進(jìn)行常規(guī)蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色，封片劑封片，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍攝圖片。

2.6 子宮組織中CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞檢測(cè) 每只小鼠取5張切片，脫蠟至水，3% H2O2室溫孵育7 min，PBS洗滌，96 ℃孵育10 min，滴加山羊血清，室溫孵育30 min，滴加大鼠抗小鼠CD4+、CD8+單抗(PBS代替一抗為陰性對(duì)照)，4 ℃過夜，滴加生物素標(biāo)記兔抗大鼠IgG單抗，37 ℃孵育25 min，PBS洗滌3次，每次5 min，滴加辣根或氧化物酶標(biāo)記親和素，37 ℃孵育25 min，PBS洗滌3次，每次5 min，二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色，流水終止。脫水、透明后中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍攝圖片，棕色或棕褐色染色為陽(yáng)性細(xì)胞，每張切片取5個(gè)隨機(jī)視野，計(jì)數(shù)CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)，取平均值。

2.7 子宮組織中IFN-γ、IL-4水平檢測(cè) 取子宮組織勻漿上清液，采用ELISA法[7]檢測(cè)IFN-γ、IL-4水平，按照試劑盒說明書操作，檢測(cè)570 nm波長(zhǎng)處吸光度值，根據(jù)吸光度-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)樣本水平。

2.8 蛻膜組織中TNFR1、FADD、Bcl-2、caspase8 mRNA檢測(cè) 取蛻膜組織，Trizol法[8]提取總RNA，酶標(biāo)儀檢測(cè)260 nm和280 nm波長(zhǎng)處吸光度(absorbance，A)值，A260/A280在1.6～1.8之間為合格，計(jì)算RNA純度。將RNA逆轉(zhuǎn)錄獲得互補(bǔ)鏈cDNA，SYBR Green熒光定量試劑盒進(jìn)行RT-qPCR，25 μL反應(yīng)體系為SYBR Premix Ex Taq 13.5 μL，10 μmol/L正反向引物各0.5 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 8.5 μL；反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性90 s；95 ℃變性20 s，57 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，重復(fù)40個(gè)循環(huán)；采用2-△△CT法[9]計(jì)算目的基因相對(duì)內(nèi)參β肌動(dòng)蛋白(β-actin)表達(dá)量，引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列見表1。

表1 引物序列

2.9 蛻膜組織中TNFR1、FADD、Bcl-2、caspase8蛋白表達(dá)檢測(cè) 取蛻膜組織，于液氮中研磨后轉(zhuǎn)至離心管，加入0.5 mL細(xì)胞裂解液于冰上裂解25 min，沸水水浴10 min變性，12 000 r/min離心15 min(離心半徑10 cm)，取上清進(jìn)行BCA蛋白總量檢測(cè)。取40 μg蛋白與等量Loading buffer混勻，進(jìn)行SDS-PAGE，電壓80 V至指示劑進(jìn)入分離膠，120 V電泳至結(jié)束，電轉(zhuǎn)儀將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，封閉液室溫封閉2 h，Tris鹽酸吐溫緩沖液(Tris-Hcl tween hydrochloride buffer，TBST)洗滌3次，每次10 min，加入一抗TNFR1(1∶200)，F(xiàn)ADD(1∶300)，Bcl-2(1∶300)，caspase8(1∶500)，4 ℃過夜，TBST洗滌3次，每次10 min，加入相應(yīng)的稀釋二抗(1∶2 000)，室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，每次10 min，加入電化學(xué)發(fā)光法顯影、定影，凝膠成像系統(tǒng)掃描拍照，Image J圖像分析軟件分析條帶灰度值，目的蛋白與內(nèi)參β-actin灰度值的比值表示蛋白相對(duì)表達(dá)量。

3 結(jié)果

3.1 補(bǔ)腎活血方對(duì)小鼠胚胎丟失率的影響 正常組、西藥組、高劑量組和聯(lián)合組均造模成功(妊娠10只)，模型組和低劑量組造模成功9只。如表2所示，與正常組比較，模型組小鼠胚胎丟失率升高(P<0.05)；與模型組比較，各給藥組胚胎丟失率均降低(P<0.05)，并且聯(lián)合組<西藥組<高劑量組<低劑量組。

表2 各組胚胎丟失率比較

3.2 補(bǔ)腎活血方對(duì)小鼠子宮組織病理學(xué)改變的影響 如圖1所示，正常組小鼠子宮組織細(xì)胞無明顯異常，細(xì)胞核深染清晰；模型組小鼠子宮組織細(xì)胞核染色較淺，呈現(xiàn)邊聚、碎裂情況；各給藥組細(xì)胞核邊聚和碎裂現(xiàn)象減少，結(jié)構(gòu)清晰，其中聯(lián)合組改善最為明顯。

注：黑色箭頭指示細(xì)胞核碎裂，綠色箭頭指示細(xì)胞核邊聚。圖1 各組小鼠子宮組織病理學(xué)(HE，×400)

3.3 補(bǔ)腎活血方對(duì)小鼠子宮組織免疫微環(huán)境的影響 如表3、圖2～3所示，與正常組比較，模型組小鼠子宮組織IFN-γ、CD4+、IFN-γ/IL-4、CD4+/CD8+水平均升高(P<0.05)，IL-4、CD8+水平均降低(P<0.05)；與模型組比較，各給藥組小鼠子宮組織IFN-γ、CD4+、IFN-γ/IL-4、CD4+/CD8+水平均降低(P<0.05)，并且聯(lián)合組<西藥組和高劑量組<低劑量組；與模型組比較，各給藥組小鼠子宮組織IL-4、CD8+水平均升高(P<0.05)，并且聯(lián)合組>西藥組和高劑量組>低劑量組；西藥組和高劑量組比較，小鼠子宮組織IFN-γ、IL-4、CD4+、CD8+、IFN-γ/IL-4、CD4+/CD8+水平無明顯變化(P>0.05)。

表3 各組小鼠子宮組織中IFN-γ/IL-4、CD4+/CD8+水平

注：黑色箭頭指示CD4+T淋巴細(xì)胞。圖2 各組小鼠子宮組織CD4+免疫組化染色圖(×400)

注：黑色箭頭指示CD8+T淋巴細(xì)胞。圖3 各組小鼠子宮組織CD8+免疫組化染色圖(×400)

3.4 補(bǔ)腎活血方對(duì)小鼠蛻膜組織中TNFR1、FADD、Bcl-2、caspase8 mRNA表達(dá)的影響 如表4所示，與正常組比較，模型組小鼠蛻膜組織中TNFR1、FADD、caspase8 mRNA表達(dá)升高(P<0.05)，Bcl-2 mRNA表達(dá)降低(P<0.05)；與模型組比較，各給藥組小鼠蛻膜組織中TNFR1、FADD、caspase8 mRNA表達(dá)均降低(P<0.05)，Bcl-2 mRNA表達(dá)升高(P<0.05)，其中聯(lián)合組TNFR1、FADD、caspase8 mRNA表達(dá)最低，且Bcl-2 mRNA表達(dá)最高。

表4 各組小鼠蛻膜組織中TNFR1、FADD、Bcl-2、caspase8 mRNA表達(dá)

3.5 補(bǔ)腎活血方對(duì)小鼠蛻膜組織中TNFR1、FADD、Bcl-2、caspase8蛋白表達(dá)的影響 如圖4～5所示，與正常組比較，模型組小鼠蛻膜組織中TNFR1、FADD、caspase8蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)降低(P<0.05)；與模型組比較，各給藥組小鼠蛻膜組織中TNFR1、FADD、caspase8蛋白表達(dá)均降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，其中聯(lián)合組小鼠蛻膜組織中TNFR1、FADD、caspase8蛋白表達(dá)最低，且Bcl-2蛋白表達(dá)最高(P<0.05)。

圖4 各組小鼠蛻膜組織中TNFR1、FADD、Bcl-2、caspase8蛋白條帶圖

注：與正常組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05；與西藥組比較，$P<0.05；與高劑量組比較，△P<0.05；與低劑量組比較，▲P<0.05。圖5 各組小鼠蛻膜組織中TNFR1、FADD、Bcl-2、caspase8蛋白表達(dá)柱狀圖

4 討論

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)病因復(fù)雜，除遺傳、解剖、內(nèi)分泌等臨床常見因素外，多數(shù)與免疫因素有關(guān)[10-11]。母體免疫系統(tǒng)對(duì)胚胎抗原的保護(hù)性免疫耐受，是維持妊娠序貫正常進(jìn)行的前提條件，子宮免疫微環(huán)境異常改變可導(dǎo)致胚胎植入異常，最終導(dǎo)致流產(chǎn)發(fā)生[12]。臨床常用地屈孕酮、黃體酮等藥物治療，但療效仍不理想[13]。本研究結(jié)果顯示，補(bǔ)腎活血方輔助常規(guī)西藥可有效改善腎虛血瘀型復(fù)發(fā)性流產(chǎn)小鼠子宮免疫微環(huán)境，促進(jìn)胚胎植入，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)TNFR1信號(hào)通路有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎活血方聯(lián)合西藥可有效降低胚胎丟失率、子宮組織IFN-γ/IL-4、CD4+/CD8+水平，提示補(bǔ)腎活血方輔助常規(guī)西藥可有效促進(jìn)腎虛血瘀型復(fù)發(fā)性流產(chǎn)小鼠胚胎植入，增強(qiáng)母體對(duì)胚胎的免疫耐受程度?！吨T病源候論》提出本病為氣血兩虛、沖任不固、胎失榮養(yǎng)所致，其中腎虛血瘀是導(dǎo)致滑胎的關(guān)鍵因素，其后在多種中醫(yī)著作中均有提出[14-15]。補(bǔ)腎活血方以補(bǔ)腎安胎經(jīng)典方壽胎丸為主，配伍“治一切胎氣不安”之養(yǎng)血活血安胎方芎歸湯為輔。補(bǔ)腎活血方中菟絲子補(bǔ)腎益精，固攝沖任，重用為君；桑寄生、續(xù)斷補(bǔ)益肝腎，養(yǎng)血安胎為臣；阿膠補(bǔ)血為佐；當(dāng)歸養(yǎng)血活血，川芎理氣行滯為使，諸藥合用共奏補(bǔ)腎活血、益氣安胎之功效。馮曉玲等[16]臨床應(yīng)用補(bǔ)腎活血方治療復(fù)發(fā)性流產(chǎn)發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)癥狀明顯改善，為妊娠提供良好母體內(nèi)環(huán)境。Th1細(xì)胞屬于攻擊性細(xì)胞，可分泌IFN-γ，誘導(dǎo)免疫排斥發(fā)生，IL-4由Th2細(xì)胞分泌，主要誘導(dǎo)免疫耐受[17]。CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞亞群同樣是調(diào)節(jié)機(jī)體免疫耐受的細(xì)胞群之一，前者具有細(xì)胞毒性作用，后者具有負(fù)性調(diào)節(jié)作用[18]。補(bǔ)腎活血方中多種中草藥活性成分聯(lián)合地屈孕酮能夠更好的調(diào)節(jié)子宮免疫微環(huán)境，降低流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎活血方聯(lián)合西藥可下調(diào)蛻膜組織中TNFR1、FADD、caspase8 mRNA和蛋白表達(dá)，上調(diào)Bcl-2表達(dá)。TNFR1主要表達(dá)于蛻膜組織，F(xiàn)ADD表達(dá)于滋養(yǎng)層，臨床研究顯示[19]，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者TNFR1和FADD表達(dá)均異常升高，可導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷，致使胚胎失養(yǎng)而流產(chǎn)。TNFR1與腫瘤壞死因子結(jié)合后，前者發(fā)生多聚化反應(yīng)從而激活caspase8，啟動(dòng)凋亡信號(hào)通路[20]。Bcl-2是TNFR1信號(hào)通路下游的抗凋亡因子，其表達(dá)量升高可修復(fù)受損線粒體從而抑制細(xì)胞凋亡[21]。本研究中補(bǔ)腎活血方可輔助地屈孕酮抑制TNFR1信號(hào)通路激活，從而改善胚胎植入局部環(huán)境穩(wěn)定，促進(jìn)胚胎植入。