王可妍，高俊杰，林文勇，王 丹，張春伶，牛振超，李益萍*，王肖龍*

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，國家中醫(yī)心血管病臨床醫(yī)學(xué)研究中心分中心，上海 201203；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院心血管病研究所，上海 201203)

急性心肌梗死是發(fā)病率和死亡率很高的主要心血管疾病之一，其干預(yù)的最佳治療手段是再灌注治療。然而，在再灌注過程中會導(dǎo)致額外的心肌損傷，即心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia/reperfusion injury,MIRI)[1-3]。治療MIRI的方法主要有機(jī)械性物理療法(低溫療法、遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)等)及藥物治療(心房利鈉肽、環(huán)孢霉素A等)，然而臨床試驗(yàn)并未證實(shí)其確切療效[4-6]。因此，MIRI成為研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。

MIRI發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，自噬在其病理過程中發(fā)揮重要作用[7]。N6-腺嘌呤(N6-methyladenosine，m6A)甲基化是RNA重要的表觀遺傳學(xué)修飾，m6A甲基化水平主要由甲基化酶如甲基化酶3 (methyltransferase-like 3,METTL3)和去甲基化酶如ALKBHB同源蛋白5 (alkylation repair homolog protein 5,ALKBH5)調(diào)控[8]。Song等[9]研究發(fā)現(xiàn)缺氧/復(fù)氧后 METTL3表達(dá)上調(diào)，m6A甲基化水平增加，進(jìn)而損害自噬通量，促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡，提示m6A甲基化修飾可能通過影響自噬從而參與MIRI的病理過程。

速效救心丸主要由川芎嗪、冰片組成。臨床發(fā)現(xiàn)其可顯著改善心肌梗死及心絞痛等癥狀[10-12]。本課題組預(yù)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)速效救心丸可以減少大鼠心肌梗死面積，改善心功能，從而減輕缺血再灌注損傷，并與自噬機(jī)制有關(guān)。本研究通過缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞模型，從表觀遺傳學(xué)與自噬角度深入探討速效救心丸對MIRI的保護(hù)作用，為其臨床運(yùn)用提供更加充分的理論依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞 大鼠心肌細(xì)胞H9c2細(xì)胞購自上海諾百生物科技有限公司。

1.2 試劑與藥物 速效救心丸(天津中新藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，批號617135)，其濃度的選擇基于前期基礎(chǔ)研究，分別用無水乙醇將速效救心丸及其有效成分川芎嗪、冰片稀釋溶解至50、100、25 mg/mL，與細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)使其給藥終質(zhì)量濃度為50、100、25 μg/mL。BCA蛋白濃度檢測試劑盒、SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒、蛋白Marker、CellTiter-LumiTMSteady發(fā)光法細(xì)胞活力檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號0701018181104、P0012AC、061418181119、C0069S)；DMEM高糖培養(yǎng)基(美國Corning公司，批號32320006)；PBS (上海昱都生物科技有限公司，批號AF29526788)；0.25% Trypsin-EDTA[賽默飛世爾科技(中國)有限公司，批號193154]；SYBR RT-qPCR Master Mix、RNA抽取試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司，批號Q341-02、7E552A1)；GoScriptTMReverse Transscription (美國Promega公司,批號0000389033)；ALKBH5(英國Abcam公司，批號ab195377)；GAPDH (美國Proteintech公司，批號051201)；二抗(合肥白鯊生物科技有限公司，批號69110200)；EpiQuik m6A RNA甲基化定量檢測試劑盒(美國Epigentek 公司，批號P-9005)。

1.3 儀器 超凈工作臺(珠海市再鑫儀器有限公司)；Forma311型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、StepOnePlus Real-Time PCR儀(美國Thermo公司)；SDS-PAGE電泳儀、濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad公司)；5430R型高速冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf公司)。

2 方法

2.1 缺氧/復(fù)氧模型的建立及復(fù)氧時(shí)間的確定 H9c2細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的高糖DMEM中，5% CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)至第3代后建立缺氧/復(fù)氧模型。更換培養(yǎng)基為低糖無血清的DMEM，在缺氧條件下(1% O2、94% N2、5% CO2)培養(yǎng)2 h后再復(fù)氧(95%空氣，5% CO2)，分別復(fù)氧0、2、4、6 h。

2.2 化學(xué)發(fā)光法檢測細(xì)胞活力 通過CellTiter-LumiTMSteady發(fā)光法細(xì)胞活力檢測試劑盒檢測不同復(fù)氧時(shí)間組的ATP水平來確定最佳復(fù)氧時(shí)間。使用滿足化學(xué)發(fā)光檢測條件的96孔板，之后進(jìn)行細(xì)胞鋪板，5% CO2，37 ℃，過夜培養(yǎng)。室溫平衡10 min，向每孔中加入發(fā)光法檢測試劑，室溫振蕩2 min，室溫孵育10 min，使發(fā)光信號趨于穩(wěn)定。使用具有檢測化學(xué)發(fā)光功能的多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測。

2.3 實(shí)驗(yàn)分組 H9c2細(xì)胞鋪板密度在30%～40%之間，隨機(jī)分為常氧組、缺復(fù)/復(fù)氧組、速效+缺氧/復(fù)氧組、川芎嗪+缺氧/復(fù)氧組、冰片+缺氧/復(fù)氧組，藥物預(yù)處理1 h之后進(jìn)行缺氧/復(fù)氧處理，待到規(guī)定時(shí)間后收集細(xì)胞mRNA和蛋白。

2.4 Western blot檢測ALKBH5的表達(dá) 提取各組細(xì)胞蛋白，BCA試劑盒蛋白定量后變性，上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉，加入ALKBH5一抗(1∶2 000)，4 ℃過夜孵育，洗膜后加入二抗(1∶10 000)，室溫孵育2 h，洗膜，顯影。

2.5 Human ALKBH5過表達(dá)慢病毒制備 根據(jù)ALKBH5(NM_017758.3)基因信息，針對CDS區(qū)進(jìn)行基因合成，并將其構(gòu)建入慢病毒表達(dá)載體骨架PDS085_pL-MCS(用NheI和AscI酶切)中，即獲得慢病毒表達(dá)載體pl-CMV-ALKBH5。

2.6 轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)分組 H9c2細(xì)胞鋪板密度在30%～40%之間，隨機(jī)分為空白轉(zhuǎn)染+常氧組、空白轉(zhuǎn)染+缺氧/復(fù)氧組、空白轉(zhuǎn)染+速效預(yù)處理+缺氧/復(fù)氧組、空白轉(zhuǎn)染+川芎嗪+缺氧/復(fù)氧組、空白轉(zhuǎn)染+冰片+缺氧/復(fù)氧組、ALKBH5過表達(dá)+缺氧/復(fù)氧組、ALKBH5過表達(dá)染+速效+缺氧/復(fù)氧組、ALKBH5過表達(dá)+川芎嗪+缺氧/復(fù)氧組、ALKBH5過表達(dá)+冰片+缺氧/復(fù)氧組。

2.7 慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞 從培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞，吸去舊培養(yǎng)基，將含病毒的培養(yǎng)液小心加入各孔中，放于CO2培養(yǎng)箱孵育4～6 h，吸去含病毒的培養(yǎng)液，PBS清洗細(xì)胞2～3次，最后加入適量培養(yǎng)液，過夜后觀察細(xì)胞狀態(tài)。

2.8 RT-qPCR檢測相關(guān)基因的表達(dá) 采用RT-qPCR法對相關(guān)基因表達(dá)進(jìn)行定量分析。用TRIzol試劑提取心肌細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA，SYBR Green PCR Master Mix Kit 用于量化RNA水平，以β-actin作為內(nèi)參，引物序列見表1。

表1 引物序列

2.9 比色法檢測m6A甲基化水平 提取樣品RNA，每次反應(yīng)的總RNA量可為100～300 ng，每個(gè)反應(yīng)的最佳量為200 ng。制備緩沖液與溶液，與RNA結(jié)合，捕獲m6A RNA，使用酶標(biāo)儀檢測信號，計(jì)算m6A的水平。

2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 25.0軟件進(jìn)行處理，符合正態(tài)性及方差齊性，組間比較采用單因素方差分析；不符合正態(tài)性和(或)方差齊性，組間比較使用非參數(shù)檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 H9c2細(xì)胞不同復(fù)氧時(shí)間對細(xì)胞活力的影響 如圖1所示，不同復(fù)氧時(shí)間組的細(xì)胞活力均低于常氧培養(yǎng)細(xì)胞(P<0.01)；其中復(fù)氧4 h可以較好的恢復(fù)細(xì)胞活力。因此后續(xù)缺氧/復(fù)氧模型均采取缺氧2 h，復(fù)氧4 h。

注：與同一復(fù)氧時(shí)間常氧組比較，**P<0.01。圖1 不同復(fù)氧時(shí)間心肌細(xì)胞活力

3.2 速效救心丸預(yù)處理對細(xì)胞狀態(tài)的影響 如圖2所示，常氧組細(xì)胞生長狀態(tài)良好，死亡細(xì)胞較少；與常氧組比較，缺氧/復(fù)氧組細(xì)胞死亡增加(P<0.01)；速效救心丸、川芎嗪及冰片預(yù)處理可減少缺氧/復(fù)氧后心肌細(xì)胞的死亡，促進(jìn)增殖(P<0.01)。

3.3 速效救心丸預(yù)處理對缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞ALKBH5表達(dá)的影響 如圖3所示，與常氧組比較，缺氧/復(fù)氧組細(xì)胞去甲基化酶ALKBH5的mRNA和蛋白表達(dá)升高，其中mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與缺氧/復(fù)氧組比較，速效救心丸及其有效成分川芎嗪、冰片預(yù)處理均可增加缺氧/復(fù)氧后心肌細(xì)胞ALKBH5 mRNA 和蛋白表達(dá)(P<0.01)。

3.4 速效救心丸預(yù)處理及ALKBH5過表達(dá)對缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞m6A甲基化水平的影響 如圖4所示，與缺氧/復(fù)氧組比較，速效救心丸及其有效成分川芎嗪、冰片預(yù)處理可降低m6A水平(P<0.01)，ALKBH5過表達(dá)處理后也可下調(diào)m6A水平(P<0.01)。

注：與常氧組比較，**P<0.01；與缺氧/復(fù)氧組比較，##P<0.01。圖2 速效救心丸對缺氧/復(fù)氧后心肌細(xì)胞的影響

注：與常氧組比較，*P<0.05；與缺氧/復(fù)氧組比較，##P<0.01。圖3 速效救心丸對ALKBH5表達(dá)的影響

3.5 速效救心丸預(yù)處理及ALKBH5過表達(dá)對缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞活力的影響 如圖5所示，與缺氧/復(fù)氧組比較，速效救心丸及其有效成分川芎嗪、冰片預(yù)處理可提高缺氧/復(fù)氧后心肌細(xì)胞的活力(P<0.01)；與缺氧/復(fù)氧組比較，ALKBH5過表達(dá)處理也可增加心肌細(xì)胞活力(P<0.01)。

3.6 速效救心丸預(yù)處理及ALKBH5過表達(dá)對缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞自噬的影響 如圖6所示，與常氧組比較，缺氧/復(fù)氧組心肌細(xì)胞GSK3β、Atg5、Beclin1、P62 mRNA表達(dá)均升高(P<0.01)，mTORmRNA表達(dá)降低(P<0.01)；與缺氧/復(fù)氧組比較，速效救心丸及其有效成分川芎嗪、冰片預(yù)處理可抑制GSK3β、Atg5、Beclin-1、P62 mRNA表達(dá)(P<0.01)，促進(jìn)mTORmRNA表達(dá)(P<0.01)；與缺氧/復(fù)氧組比較，ALKBH5過表達(dá)也可抑制GSK3β、Atg5、Beclin-1、P62 mRNA表達(dá)，促進(jìn)mTORmRNA表達(dá)(P<0.01)。

4 討論

在心肌缺血再灌注過程中，自噬被明顯激活，超過一定水平時(shí)會導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙，從而發(fā)生自噬性細(xì)胞死亡[13-14]，因此，抑制過度自噬可能成為治療MIRI的一個(gè)有效靶點(diǎn)。參與自噬調(diào)控的經(jīng)典信號通路之一是GSK3β/mTOR通路，一些關(guān)鍵蛋白可直接或間接反映自噬過程[15-16]。Beclin 1是自噬起始階段的關(guān)鍵調(diào)控分子，調(diào)控早期自噬小體的形成。微管相關(guān)蛋白輕鏈3蛋白(microtubulerassociated protein light chain 3 protein,LC3)是Beclin1蛋白的關(guān)鍵下游因子，是檢測自噬發(fā)生的標(biāo)志性蛋白。Atg5也參與自噬體的形成[17-20]。P62的主要功能是將被降解的細(xì)胞器運(yùn)輸至成熟的自噬體[21]。隨著對表觀遺傳學(xué)的深入研究發(fā)現(xiàn)，m6A修飾與自噬密切相關(guān)。

注：與空白轉(zhuǎn)染+常氧組比較，**P<0.01；與空白轉(zhuǎn)染+缺氧/復(fù)氧組比較，##P<0.01；與ALKBH5過表達(dá)+缺氧/復(fù)氧組比較，&&P<0.01。圖4 速效救心丸與ALKBH5過表達(dá)對心肌細(xì)胞m6A甲基化水平的影響

注：與空白轉(zhuǎn)染+常氧組比較，**P<0.01；與空白轉(zhuǎn)染+缺氧/復(fù)氧組比較，##P<0.01；與ALKBH5過表達(dá)+缺氧/復(fù)氧組比較，&&P<0.01。圖5 速效救心丸與ALKBH5過表達(dá)對心肌細(xì)胞活力的影響

注：與空白轉(zhuǎn)染+常氧組比較，**P<0.01；與空白轉(zhuǎn)染+缺氧/復(fù)氧組比較，##P<0.01；與ALKBH5過表達(dá)+缺氧/復(fù)氧組比較，&&P<0.01。圖6 速效救心丸與ALKBH5過表達(dá)對心肌細(xì)胞自噬的影響

本課題組發(fā)現(xiàn)，速效救心丸及其有效成分川芎嗪、冰片可有效改善缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞損傷；缺氧/復(fù)氧后心肌細(xì)胞去甲基化酶ALKBH5 mRNA表達(dá)略增加，蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而速效救心丸及其有效成分川芎嗪、冰片預(yù)處理可增加去甲基化酶ALKBH5的表達(dá)，下調(diào)m6A甲基化水平；抑制GSK3β、Beclin-1、Atg5、P62的表達(dá)，增加mTOR的表達(dá)。采用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)使去甲基化酶ALKBH5過表達(dá)，ALKBH5過表達(dá)后缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞m6A甲基化水平下降、細(xì)胞活力增加，GSK3β、Beclin-1、Atg5、P62的表達(dá)下降，mTOR的表達(dá)增加，表明速效救心丸可能通過ALKBH5/m6A途徑抑制過度自噬從而減輕缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞損傷。此外，本課題組發(fā)現(xiàn)速效救心丸拮抗缺血再灌注損傷的作用優(yōu)于單體川芎，弱于單體冰片，提示速效救心丸減緩缺血再灌注損傷主要是通過冰片發(fā)揮作用，其用量較少，且在藥物服用安全范圍內(nèi)，故對人體無害。

然而，本實(shí)驗(yàn)并未在蛋白層次上探索自噬相關(guān)指標(biāo)的變化，其中LC3相對mRNA表達(dá)結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故在以后的研究中應(yīng)通過Western blot等技術(shù)來深入對自噬通路的研究。另外，應(yīng)增加干擾ALKBH5表達(dá)后對缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞的影響，以期為速效救心丸治療MIRI提供更加充足的證據(jù)。MIRI目前尚無有效的治療方法，但研究發(fā)現(xiàn)我國傳統(tǒng)中藥，如五參順脈膠囊、三七總皂苷等通過抑制過度自噬減輕缺血再灌注損傷[22-25]，未來需要更多相關(guān)研究來推動我國傳統(tǒng)中醫(yī)藥衛(wèi)生事業(yè)的發(fā)展。