齊大明，劉天亮，楊林林*，董誠明*，高啟國，徐曉麗，李江華

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，河南 鄭州 450046；2.呼吸疾病診療與新藥研發(fā)河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450046；3.河南省道地藥材生態(tài)種植工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450046；4.河南太龍藥業(yè)股份有限公司，河南 鄭州 450001)

金銀花是忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThunb.的花蕾或帶初開的花。具有清熱解毒，疏散風(fēng)熱的功效，近年來因需求量不斷增加，種植面積也日益擴(kuò)大。金銀花的采收周期很長，可從5月采收到10月，但是采收時(shí)間不連續(xù)。產(chǎn)地根據(jù)采收的時(shí)間分為四個(gè)茬次，第一茬花包含在整個(gè)5月中，第二茬花在 6月中旬至7月上旬，第三茬花在7月下旬至8月上旬，第四茬花在9月上中旬，也有部分可延續(xù)至10月[1]。四個(gè)茬次的金銀花外觀性狀及品質(zhì)間存在差異，關(guān)于金銀花成分動態(tài)變化的研究不少，但大多只研究綠原酸和木犀草苷，未對外觀性狀進(jìn)行觀察[2-3]。

“辨狀論質(zhì)”是以藥材的外觀性狀為基礎(chǔ)，以長期的臨床用藥經(jīng)驗(yàn)為指導(dǎo)，而探索出藥材的外觀性狀與其內(nèi)在品質(zhì)的聯(lián)系規(guī)律[4-5]。謝宗萬、金世元等提出的“辨狀論質(zhì)”、“五象七原”等理論,也表明藥材在“形、色、氣、味”等外觀性狀上所表達(dá)的固定特征與其內(nèi)在品質(zhì)具有一定的聯(lián)系[6-7]。而中藥材的品質(zhì)及臨床療效的物質(zhì)基礎(chǔ)是化學(xué)成分[8]。中藥材外觀性狀可作為中藥真?zhèn)蝺?yōu)劣判斷的依據(jù)。歷來被公認(rèn)為品質(zhì)佳的金銀花具有花條長、無開放花朵、骨茬硬、垂而不倒；色澤佳、質(zhì)地純，味濃清香；花冠厚，質(zhì)稍硬，握之有頂手感的特點(diǎn)[9]。金銀花花蕾長度與木犀草苷含量具有聯(lián)系，褐變、上部直徑與綠原酸含量具有顯著相關(guān)性[10-11]。而金銀花外觀性狀與其它活性成分的相關(guān)性研究頗少。

本實(shí)驗(yàn)對豫金1號和四季花兩主品種不同茬次金銀花的外觀性狀進(jìn)行觀察，采用指紋圖譜對金銀花中15種化學(xué)成分進(jìn)行動態(tài)分析，全面剖析年不同茬次金銀花性狀與成分的動態(tài)變化，并將兩不同品種金銀花從前端膨大處分開，對比頭尾成分差異。為金銀花的“辨狀論質(zhì)”提供理論依據(jù)，亦能為優(yōu)良忍冬品種的定向選育提供理論支持。

1 材料

1.1 儀器 Waters 2695高效液相色譜儀(美國Waters公司)；BS-224S電子天平、MS105DU型半微量天平(瑞士Mettler Toledo公司)；KQ-500DV超聲波清洗機(jī)(昆山舒美超聲儀器有限公司)。

1.2 試劑與藥物 綠原酸(批號140322)對照品購自中國食品藥品檢定研究院；香豆酸(批號wkq17110212)、蘆丁(wkq16101104)、新綠原酸(wkq18030107)、獐牙菜苷(wkq18042610)、異綠原酸A(wkq18041207)、異綠原酸C(wkq18050905)、異綠原酸B(wkq19012301)對照品均購于成都維克奇生物科技有限公司；斷馬錢子酸(批號DST190719-136)、異槲皮苷(DST191012-006)、忍冬苷(DST190708-048)對照品均購于成都德思特生物科技有限公司；斷氧化馬錢子苷(批號P27N8L49194)、木犀草苷(Y26A9H59973)均購于上海源葉生物科技有限公司；咖啡酸(批號MUST-16060613)、莫諾苷(MUST-15102911)對照品均購于成都曼斯特生物科技有限公司，純度均大于98%。甲酸、甲醇、乙腈為色譜純，購于美國Thermo Fisher Scientific公司；甲醇為分析純(天津富宇精細(xì)化工有限公司)；水為純化水。

藥材采自封丘縣城關(guān)鎮(zhèn)、黃德鎮(zhèn)2塊試驗(yàn)田，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)董誠明教授鑒定為忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThunb.的花蕾，采用五點(diǎn)采樣法進(jìn)行采樣，每個(gè)樣點(diǎn)選取6株，采集后統(tǒng)一采用梯度烘干法進(jìn)行烘干，具體信息見表1，外觀性狀見圖1。

表1 金銀花信息Tab.1 Information of Lonicerae japonica Flos

圖1 金銀花外觀性狀Fig.1 Appearance and morphology of Lonicerae japonica Flos

2 方法

2.1 外觀性狀描述及特征指數(shù)測定 每組藥材隨機(jī)分成3份，每份再隨機(jī)抽出100株，測定花蕾長度、上部膨大處直徑與長度，計(jì)算平均值。采用種子千粒重法，在每組樣品中隨機(jī)數(shù)3組1 000株，稱定質(zhì)量，取平均值。

2.2 HPLC指紋圖譜建立

2.2.1 色譜條件 Symmetry C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動相乙腈(A)-0.2%甲酸(B)，梯度洗脫(0～10 min，8%～9%A；10～15 min，9%A；15～20 min，9%～10%A；20～25 min，10%～11%A；25～30 min，11%～14%A；30～50 min，14%～16%A；50～60 min，16%～20%A；60～65 min，20%～22%A；65～70 min，22%～24%A；70～80 min，24%～40%A)；體積流量0.6 mL/min；柱溫38 ℃；檢測波長245 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.2.2 溶液制備

2.2.2.1 對照品溶液 精密稱取香豆酸、新綠原酸、莫諾苷、綠原酸、斷馬錢子酸、咖啡酸、當(dāng)藥苷、斷氧化馬錢苷、蘆丁、異槲皮素、木犀草苷、忍冬苷、異綠原酸 B、異綠原酸 A、異綠原酸 C對照品適量，50%甲醇溶解，制成質(zhì)量濃度分別為 0.570、0.252、0.966、0.480、0.460、0.420、0.825、0.550、0.954、0.271、0.373、0.284、0.448、0.430、0.672 mg/mL的貯備液，分別精密量取200 μL混合，即得。

2.2.2.2 供試品溶液 精密稱取藥材粉末1 g(過4號篩)，置于具塞錐形瓶中，加入50%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取30 min，冷卻后以50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，即得。

2.3 含量測定

2.3.1 線性關(guān)系考察 50%甲醇制成各成分質(zhì)量濃度分別為綠原酸27.19、54.38、108.75、174.00、217.50、435.00 μg/mL，異綠原酸A 27.81、55.63、111.25、178.00、222.50、445.00 μg/mL，異綠原酸C 27.66、55.31、110.63、177.00、221.25、442.50 μg/mL，木犀草苷23.50、47.00、94.00、122.00、188.00 μg/mL。以對照品質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)(Y)，峰面積為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行回歸，結(jié)果見表2，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.3.2 精密度試驗(yàn) 取“2.3.1”項(xiàng)下對照品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6次，測得綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C、木犀草苷峰面積RSD為0.53%、1.01%、0.21%、0.57%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取豫金1號一茬粉末6份，按“2.2.2”項(xiàng)制備供試品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，峰面積RSD為0.77%、1.00%、0.20%、0.55%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液(豫金1號一茬)，于0、2、4、8、16、24 h在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，峰面積RSD依次為0.72%、0.94%、0.28%、0.61%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已測定含量的豫金1號一茬粉末6份，每份0.5 g，精密加入綠原酸14.35 mg、異綠原酸A 4.45 mg、442.50 μg/mL異綠原酸C溶液1.5 mL、188.00 μg/mL木犀草苷溶液1.6 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率。結(jié)果，綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C、木犀草苷平均加樣回收率分別為98.57%、97.35%、96.73%、98.77%，RSD分別為1.50%、1.99%、2.08%、2.27%。

2.4 頭尾成分差異研究 將2個(gè)品種頭部和尾部按圖1截?cái)嗵幏珠_，分別打粉(過4號篩)，按“2.2”項(xiàng)下方法測定各成分含量。

3 結(jié)果

3.1 不同茬次金銀花性狀差異 一茬與四茬金銀花的體型較二、三茬偏大，不同茬次金銀花千花重存在差異，一、四茬千花重較大，二三茬小；金銀花總長度及前端膨大處長度差異不明顯，豫金1號膨大處寬度間存在差異，一、四茬較二、三茬大。一、四茬花的體型大，這是因?yàn)榛ɡ僭谥仓晟仙L的時(shí)間較長，二、三茬花期位于夏季，溫度高，植株生長較快，大多是隔一天一采花，而一、四茬花期則分別位于春秋兩季，溫度偏低，采花時(shí)間間隔會偏長點(diǎn)，花蕾在植株上生長的時(shí)間就相對偏長一點(diǎn)，而且春秋之際的晝夜溫差較大，更有利于營養(yǎng)物質(zhì)的積累。見表3。

表3 不同茬次金銀花性狀特征常數(shù)Tab.3 Constants of morphological characteristics for different varieties of Lonicerae japonica Flos at yearly different blooming

3.2 各成分含量動態(tài)變化 HPLC指紋圖譜見圖2。

注：a～h為豫金1號四茬、豫金1號三茬、豫金1號二茬、豫金1號一茬、四季花四茬、四季花三茬、四季花二茬、四季花一茬。1.香豆酸 2.新綠原酸 3.莫諾苷 4.綠原酸 5.斷馬錢子酸 6.咖啡酸 7.當(dāng)藥苷 8.斷氧化馬錢子苷 9.蘆丁 10.異槲皮素 11.木犀草苷 12.忍冬苷 13.異綠原酸B 14.異綠原酸A 15.異綠原酸C1.cumalic acid 2.neochlorogenic acid 3.morroniside 4.chlorogenic acid 5.secologaninsaeure 6.caffeic acid 7.sweroside 8.secoxyloganin 9.troxerutin 10.isoquercetin 11.cynaroside 12.xylostein 13.isochlorogenic acid B 14.isochlorogenic acid A 15.isochlorogenic acid C圖2 金銀花HPLC指紋圖譜(A)和對照品圖譜(B)Fig.2 HPLC fingerprints for Lonicerae japonica Flos (A) and chromagtograms of reference substances (B)

圖3顯示，綠原酸含量呈緩慢下降趨勢，斷馬錢子酸、異綠原酸A變化趨勢有所差別，其他5種有機(jī)酸類成分含量基本都呈先緩慢上升后下降的趨勢；3種環(huán)烯醚萜苷類成分含量也呈現(xiàn)出二茬達(dá)到最高后緩慢降低的趨勢；木犀草苷含量呈先下降后緩慢上升的趨勢。

圖3 不同茬次金銀花成分含量動態(tài)變化Fig.3 Dynamic changes in component contents of Lonicerae japonica Flos at yearly different blooming time

3.3 不同茬次金銀花含量測定 表4顯示，不同茬次金銀花中綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C、木犀草苷含量均存在顯著差異(P<0.05)，綠原酸含量呈逐漸降低的趨勢，異綠原酸A、異綠原酸C含量呈先升后降的趨勢，木犀草苷含量呈現(xiàn)先降后升的趨勢，并且2個(gè)品種均是這種情況。

3.4 相關(guān)性分析 表5顯示，千花重與咖啡酸、當(dāng)藥苷含量呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與木犀草苷含量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，金銀花總長度、膨大處長度與當(dāng)藥苷含量均呈顯著性負(fù)相關(guān)(P<0.05)。

表4 不同茬次金銀花含量測定結(jié)果Tab.4 Results of content determination of different varieties of Lonicerae japonica Flos at yearly different blooming

表5 金銀花性狀特征與成分含量相關(guān)性Tab.5 Correlations between morphological characteristics and component contents of Lonicerae japonica Flos

次生代謝產(chǎn)物間存在相互轉(zhuǎn)化的關(guān)系，故對15種成分進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果見表6。

表6 各成分之間相關(guān)系數(shù)Tab.6 Correlations coefficients among various constituents

3.5 金銀花頭部與尾部成分的差異性分析 圖4、表7顯示，1號峰(香豆酸)尾部含量是頭部的2～3倍，3號峰(莫諾苷)尾部含量是頭部的6～7倍；9號峰(蘆丁)頭部含量是尾部的近3倍，11號峰(木犀草苷)頭部含量是尾部的10倍以上，尾部中11號峰(木犀草苷)極少；其它已知成分之間的差異性不顯著。

注：a～d為豫金1號尾部、豫金1號頭部、四季花尾部、四季花頭部。1.香豆酸 2.新綠原酸 3.莫諾苷 4.綠原酸 5.斷馬錢子酸 6.咖啡酸 7.當(dāng)藥苷 8.斷氧化馬錢子苷 9.蘆丁 10.異槲皮素 11.木犀草苷 12.忍冬苷 13.異綠原酸B 14.異綠原酸A 15.異綠原酸C1.cumalic acid 2.neochlorogenic acid 3.morroniside 4.chlorogenic acid 5.secologaninsaeure 6.caffeic acid 7.sweroside 8.secoxyloganin 9.troxerutin 10.isoquercetin 11.cynaroside 12.xylostein 13.isochlorogenic acid B 14.isochlorogenic acid A 15.isochlorogenic acid C圖4 不同品種金銀花頭部和尾部HPLC 指紋圖譜Fig.4 HPLC fingerprints for heads and tails of different varieties of Lonicerae japonica Flos

表7 不同品種金銀花頭部和尾部成分峰面積Tab.7 Peak areas for heads and tails of different varieties of Lonicerae japonica Flos

4 討論

金銀花的主要活性成分有有機(jī)酸類、黃酮類、環(huán)烯醚萜苷類等，金銀花中有機(jī)酸類具有抗炎及抗氧化活性[12]，而在各茬次金銀花中有機(jī)酸類成分一、二茬較高；黃酮類成分木犀草苷在抗病毒、抗腫瘤等方面具有功效[13-15]，而一、四茬的金銀花中木犀草苷含量較高；環(huán)烯醚萜苷具有保肝利膽的作用[16]，而二茬金銀花中環(huán)烯醚萜苷類最高。金銀花在自然狀態(tài)下應(yīng)包含開花期和成果期，但現(xiàn)有栽培模式通過適當(dāng)?shù)男藜羰沟媒疸y花的產(chǎn)量及采收周期都得到極大提升，那往后茬次的金銀花就是新栽培模式下的衍生物，在不是金銀花育蕾的時(shí)期讓它又再一次育蕾，雖然它還是金銀花(基因不變)，但是各茬次間的環(huán)境差異大，也就造成不同茬次金銀花間成分的差異，故各茬次間金銀花的臨床應(yīng)用還應(yīng)再細(xì)化。產(chǎn)地調(diào)研中發(fā)現(xiàn)市場多認(rèn)為一、四茬花品質(zhì)較佳，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)地存在部分金銀花木犀草苷低于藥典標(biāo)準(zhǔn)的情況，而一、四茬花的木犀草苷含量相對偏高。

中醫(yī)藥向來提倡中藥材優(yōu)質(zhì)優(yōu)型，因外觀性狀在一定程度上確能反映出內(nèi)在成分含量，如甘草根皮顏色與成分含量的相關(guān)性[17]，巴戟天中的糖類與根直徑的關(guān)聯(lián)性[18]，地黃的非菊花心部位地黃苷A明顯高于菊花心部位等[19]。金銀花亦是如此，金銀花木犀草苷主要存在于頭部膨大處，而莫諾苷含量尾部比頭部高。

此外金銀花加工方式簡單，烘干的中藥飲片外型與原花蕾外型并無大差別，故而優(yōu)質(zhì)優(yōu)形亦能為金銀花新品種定向培育提供一定的科學(xué)依據(jù)，產(chǎn)地調(diào)研發(fā)現(xiàn)豫金1號是最初發(fā)現(xiàn)它較其它金銀花的花蕾和葉子偏大，后芽變選育出這一新品種。而實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明木犀草苷基本存在于花蕾頭部膨大處，如使金銀花的木犀草苷含量高可以選頭部較大的忍冬植株進(jìn)行定向培育。本研究中不同茬次金銀花中成分含量的差異可為其全程質(zhì)控及臨床精準(zhǔn)用藥提供參考；金銀花的外觀性狀和活性成分的相關(guān)性及花蕾頭尾的成分差異可為金銀花辨狀論質(zhì)及品種的定向選育提供理論支持。