何 兵，田 吉，楊世艷

(1.西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，四川 瀘州 646000；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，四川 瀘州 646000)

白苞蒿ArtemisialactifloraWall.為菊科蒿屬多年生草本植物，又名白花蒿，主要分布于我國秦嶺以南各省區(qū)[1]，常見于山坡、路旁、林緣，是中藥劉寄奴的基原植物之一[2]，以全草入藥，性甘、微苦，平，具有清熱、解毒、止咳等功效，主要用于治療慢性肝炎、肝硬化、腎炎等癥[3]，主要成分為有機(jī)酸類和黃酮類[4-6]。其中有機(jī)酸具有較強(qiáng)的抗菌、抗炎、抗氧化等生物活性[7]，而黃酮抗病毒、抗氧化、清除自由基等活性較強(qiáng)[8]。關(guān)于白苞蒿成分的含量測定較少，僅有1篇報(bào)道涉及槲皮素[9]。為了進(jìn)一步完善和提高白苞蒿質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本實(shí)驗(yàn)采用一測多評法同時(shí)測定該藥材中富馬酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C、紫槲皮苷、異牡荊苷、異槲皮苷的的含量。

1 材料

1.1 儀器 P680高效液相色譜儀(美國戴安公司)；LC2030高效液相色譜儀(日本島津公司)；MS105DU型電子天平(瑞士Mettler -Toledo公司)；AS7240A型超聲波清洗器(240 W，40 kHz，天津奧特賽恩斯儀器有限公司)；Direct-Q3型超純水系統(tǒng)(美國密理博公司)。Lubex Kromasil C18、AkzoNobel Kromasil C18、Dikma Inspire C18、Dikma Plastil C18、Dikma Diamonsil(2) C18、Dikma Silversil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。

1.2 試劑與藥物 富馬酸(批號F016-120615，純度98.58%)、綠原酸(批號A0022-19030620，純度99.39%)、隱綠原酸(批號A0024-19032403，純度99.07%)、紫槲皮苷(批號A0103-19010210，純度99.47%)、異牡荊苷(批號A0681-19051405，純度99.02%)、異槲皮苷(批號A0439-19051005，純度99.74%)、異綠原酸A(批號A0025-19032601，純度99.82%)、異綠原酸C(批號A0027-19031603，純度99.65%)對照品均購于成都曼斯特生物科技有限公司。白苞蒿于2019年4、6、8、10、12月采自四川瀘州龍馬潭區(qū)，經(jīng)西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院何兵副研究員鑒定為菊科蒿屬植物白苞蒿ArtemisiaLactfloraWall.，60 ℃烘干，粉碎，過3號篩。乙腈、甲醇為色譜純；其余試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Lubex Kromasil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相乙腈(A)-0.1%磷酸(B)，梯度洗脫(0～30 min，5%～30%A；30～31 min，30%～5%A；31～35 min，5%A)；體積流量1.0 mL/min；柱溫40 ℃；檢測波長0～11 min，209 nm(富馬酸)，11～35 min，326 nm(綠原酸、隱綠原酸、紫槲皮苷、異牡荊苷、異槲皮苷、異綠原酸A、異綠原酸C)；進(jìn)樣量10 μL，色譜圖見圖1。由此可知，在該條件下各成分分離度良好。

1.富馬酸 2.綠原酸 3.隱綠原酸 4.紫槲皮苷 5.異牡荊苷 6.異槲皮苷 7.異綠原酸A 8.異綠原酸C1.fumaric acid 2.chlorogenic acid 3.cryptochlorogenic acid 4.rutin 5.isovitexin 6.isoquercitrin 7.isochlorogenic acid A 8.isochlorogenic acid C圖1 各成分HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取各對照品適量，加75%甲醇制成分別含富馬酸2.095 mg/mL、綠原酸5.953 mg/mL、隱綠原酸0.461 mg/mL、紫槲皮苷3.490 mg/mL、異牡荊苷2.126 mg/mL、異槲皮苷0.492 mg/mL、異綠原酸A 3.387 mg/mL、異綠原酸C 2.432 mg/mL的貯備液，分別吸取0.5 mL，置于10 mL量瓶中，75%甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度分別為0.105、0.298、0.023、0.175、0.106、0.025、0.169、0.122 mg/mL的溶液，即得避光低溫保存。

2.2.2 供試品溶液 取藥材粉末(過3號篩)約1.0 g，精密稱定，置于100 mL錐形瓶中，加25 mL 75%甲醇，超聲處理45 min，取出，放冷至室溫，75%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，0.45 μm濾膜過濾，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 精密量取“2.2.1”項(xiàng)下貯備液0.1、0.2、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0 mL，置于 10 mL量瓶中，加75%甲醇稀釋至刻度，在“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，各成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行回歸，另取“2.2.1”項(xiàng)下對照品溶液，75%甲醇逐級稀釋，分別以信噪比3∶1、10∶1為檢測限、定量限，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.3.2 精密度試驗(yàn) 取“2.2.1”項(xiàng)下對照品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6次，測得富馬酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C、紫槲皮苷、異牡荊苷、異槲皮苷峰面積RSD分別為0.31%、0.25%、0.79%、0.55%、0.63%、0.74%、0.52%、0.60%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，室溫放置，于0、4、8、12、24、48 h在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得富馬酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C、紫槲皮苷、異牡荊苷、異槲皮苷峰面積RSD分別為0.81%、0.63%、1.06%、0.95%、1.02%、1.70%、1.17%、1.56%，表明溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取采于8月的藥材適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得富馬酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C、紫槲皮苷、異牡荊苷、異槲皮苷含量RSD分別為1.12%、0.93%、1.49%、0.99%、1.08%、1.57%、1.22%、1.55%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取各成分含量已知的藥材9份，每份0.5 g，將其分成3組，每組3份，精密加入含富馬酸1.625 mg/mL、綠原酸4.253 mg/mL、隱綠原酸0.205 mg/mL、紫槲皮苷1.735 mg/mL、異牡荊苷1.416 mg/mL、異槲皮苷0.238 mg/mL、異綠原酸A 2.469 mg/mL、異綠原酸C 1.647 mg/mL的對照品溶液0.50、0.75、1.00 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率。結(jié)果，富馬酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C、紫槲皮苷、異牡荊苷、異槲皮苷平均加樣回收率分別為98.46%、98.22%、97.25%、97.78%、97.90%、97.34%、98.15%、98.03%，RSD分別為1.03%、1.13%、1.79%、1.65%、1.52%、1.85%、1.25%、1.40%。

2.4 相對校正因子計(jì)算

2.4.1 斜率校正法 參考文獻(xiàn)[10]報(bào)道，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線公式A=a·C+b，C=(A-b)/a=A/a-b/a，當(dāng)a/b>100時(shí)b/a可忽略不計(jì)，即C=A/a，則相對校正因子fi/s可直接以斜率之比計(jì)，即fi/s=ai/as。待測成分i濃度為Ci=Ai/ai=Ai/(as·fi/s)，其中as為內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率，ai為待測成分標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率，結(jié)果見表2。

2.4.2 多點(diǎn)校正法 參考文獻(xiàn)[11]報(bào)道，校正因子fi/s計(jì)算公式為fi/s=fi/fs=(Ai/Ci)/(As/Cs)，待測成分i濃度為Ci=Ai/[fi/s×(As/Cs)]，其中Ai和Ci分別為待測成分峰面積、濃度，As、Cs分別為內(nèi)標(biāo)峰面積和濃度，結(jié)果見表2。

表2 各成分相對校正因子(內(nèi)標(biāo)綠原酸)Tab.2 Relative correlation factors for various constituents (with chlorogenic acid as an internal standard)

2.4.2 不同儀器和色譜柱考察 考察不同實(shí)驗(yàn)室、色譜儀(Dionex P680、Shimadzu LC2030)、色譜柱(Lubex Kromasil C18、AkzoNobel Kromasil C18、Dikma Inspire C18、Dikma Plastil C18，均為250 mm×4.6 mm，5 μm)對相對校正因子的影響，結(jié)果見表3，可知不同儀器和不同色譜柱對相對校正因子無明顯影響(RSD<3%)。

表3 不同儀器、色譜柱對相對校正因子的影響Tab.3 Effects of different instruments and columns on relutive corection factors

2.5 色譜峰定位 采用相對保留時(shí)間[12-15]對色譜峰進(jìn)行定位，結(jié)果見表4。雖然該方法對保留時(shí)間靠前的色譜峰定位較準(zhǔn)確，但隨著保留時(shí)間延長，其預(yù)測值與實(shí)測值之間的相對誤差越來越大，有些甚至超過±6%，并且兩者往往相差近2 min，此時(shí)很難準(zhǔn)確定位。

王龍星等[16]發(fā)現(xiàn)，在相同色譜條件下即使采用不同儀器和色譜柱，各成分保留時(shí)間之間也存在線性關(guān)系，根據(jù)此原理，以Dionex Lubex Kromasil所得保留時(shí)間為橫坐標(biāo)(X)，其他儀器、色譜柱所得保留時(shí)間為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，測得其R2分別為0.999 0、0.999 3、0.999 8、0.999 3、0.999 3、0.999 9、0.999 4、0.999 4、0.999 7，表明所有數(shù)據(jù)點(diǎn)幾乎都落在標(biāo)準(zhǔn)曲線上，即不論采用2個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)還是8個(gè)，所得校正曲線基本重合，其結(jié)果也相差不大。由于本實(shí)驗(yàn)采用一測多評法時(shí)其他色譜峰未定位確認(rèn)，故無法采用多個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)繪制校正曲線，故在色譜圖中前后各取一點(diǎn)，如以內(nèi)標(biāo)綠原酸與另1種常見、易辨認(rèn)、對照品易獲取的紫槲皮苷進(jìn)行兩點(diǎn)校正，同法繪制校正曲線，再以Dionex Lubex Kromasil所得標(biāo)準(zhǔn)保留時(shí)間代入校正方程，即可計(jì)算各成分預(yù)測出峰時(shí)間，從而實(shí)現(xiàn)快速指認(rèn)定位，結(jié)果見表5。

采用兩點(diǎn)校正時(shí)即使采用不同儀器、色譜柱，隨著保留時(shí)間延長預(yù)測值與實(shí)測值之間的相對誤差仍很低，即預(yù)測值與實(shí)際值非常接近，可實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)定位，但其唯一不足是保留時(shí)間靠前的色譜峰(特別是10 min以內(nèi)者)在未納入兩點(diǎn)校正其預(yù)測實(shí)測保留時(shí)間之間相對誤差較高，故可利用表4相對保留時(shí)間來預(yù)測[17]，即兩點(diǎn)校正適合保留時(shí)間靠后的色譜峰，而相對保留時(shí)間校正適合保留時(shí)間靠前者，兩者結(jié)合，所有峰均可獲得準(zhǔn)確的預(yù)測值。若該色譜峰附近還有其他色譜峰干擾定位，則可再根據(jù)各成分紫外吸收光譜、整體峰形、峰面積占比進(jìn)一步準(zhǔn)確定位。

表4 相對保留時(shí)間定位色譜峰Tab.4 Location of chromatographic peaks by relative retention time

2.6 樣品含量測定 精密吸取對照品、供試品溶液各10 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，分別采用外標(biāo)法、標(biāo)準(zhǔn)曲線法、一測多評法(斜率校正、多點(diǎn)校正、單點(diǎn)校正)計(jì)算含量，結(jié)果見表6。由此可知，各方法所得結(jié)果之間的RSD<2%；3種校正手段所得結(jié)果與外標(biāo)法之間的相對誤差絕對值<2%，通過t檢驗(yàn)可知其差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；不同采收期藥材所含成分含量不同，在10月最高。另外，采用單點(diǎn)校正一測多評法時(shí)，各成分含量測定結(jié)果與外標(biāo)法一致。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇 采用二極管陣列檢測器在200～380 nm掃描白苞蒿中各成分的紫外吸收，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)富馬酸在209 nm有最大吸收，綠原酸類在326 nm左右有最大吸收，而紫槲皮苷、異槲皮苷類黃酮在256、355 nm左右有最大吸收，異牡荊苷在271、338 nm有最大吸收。異牡荊苷在326、338 nm檢測，峰高差異不大，顧異牡荊苷可采用326 nm檢測。由于紫槲皮苷和異牡荊苷峰挨得很近，無法切換波長，顧紫槲皮苷仍以326 nm檢測，同時(shí)異槲皮苷再換波長也無意義。為避免過多的切換波長，除富馬酸采用209 nm外，其余成分均以326 nm檢測。

3.2 單點(diǎn)校正的優(yōu)勢 校正因子的準(zhǔn)確計(jì)算直接影響一測多評的準(zhǔn)確性，它是一測多評推廣應(yīng)用的關(guān)鍵。校正因子的計(jì)算常用的是多點(diǎn)校正[18-21]和斜率校正[22-23]。不論是多點(diǎn)校正還是斜率校正，與外標(biāo)法或標(biāo)準(zhǔn)曲線法結(jié)果相近但不一致。而單點(diǎn)校正是從多點(diǎn)校正和斜率校正演變而來，直接以外標(biāo)法濃度點(diǎn)的單點(diǎn)斜率之比作為校正因子，計(jì)算更為快捷，其結(jié)果與外標(biāo)法完全一致。單點(diǎn)校正完全等同于外標(biāo)法，外標(biāo)法適用的地方，單點(diǎn)校正即適用，否認(rèn)單點(diǎn)校正也就是否認(rèn)外標(biāo)法。

3.3 不同定位方法的優(yōu)缺點(diǎn) 一測多評推廣應(yīng)用的另一關(guān)鍵在于色譜峰的準(zhǔn)確定位，定位不準(zhǔn)就會出現(xiàn)所測成分非待測成分。本文詳述了兩點(diǎn)校正法用于定位色譜峰的方法，其特別適用于保留時(shí)間靠后的色譜峰定位，其相對誤差普遍小于1.2%。兩點(diǎn)校正法唯一的缺陷在于當(dāng)保留時(shí)間太過靠前的色譜峰在未納入校正方程時(shí)，其相對誤差較大，從而導(dǎo)致定位不準(zhǔn)。但保留時(shí)間靠前的色譜峰剛好是相對保留時(shí)間定位的優(yōu)勢。故一測多評的定位若結(jié)合相對保留時(shí)間和兩點(diǎn)校正法，以相對保留時(shí)間定位10 min以內(nèi)的色譜峰，以兩點(diǎn)校正定位10 min以后的色譜峰，二者結(jié)合所有待測成分色譜峰均可實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)定位(相對誤差<2%)，其特別適合相鄰色譜峰眾多、峰高批間差異較大、色譜峰紫外吸收相近或儀器無法檢測紫外吸收的色譜峰定位。

表5 兩點(diǎn)校正定位色譜峰Tab.5 Location of chromatographic peaks by two-point correction

表6 各成分含量測定結(jié)果(mg/g，n=3)Tab.6 Results of content determination of various constituents (mg/g，n=3)

3.4 一測多評在白苞蒿質(zhì)控中的優(yōu)勢 白苞蒿生態(tài)適應(yīng)性較強(qiáng)，分布較為廣泛，具有較高的藥用價(jià)值。在《全國中草藥匯編》、《中藥大辭典》、《中華本草》等均有收載。目前白苞蒿未收載入《中國藥典》一部，但在2020年版《中國藥典》中，白苞蒿為中藥劉寄奴的基原植物之一[2]，白苞蒿有著優(yōu)良的應(yīng)用開發(fā)潛力。本研究采用HPLC-QAMS同時(shí)測定了不同采收期白苞蒿所含的8種主要活性成分的含量。為進(jìn)一步完善和提高白苞蒿的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)，該法具有一定的推廣應(yīng)用價(jià)值。