劉 煒，劉 紅

（海南師范大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，?？?71158）

DNA與藥物分子相互作用的研究有助于了解藥物的作用機(jī)理，并更有效地指導(dǎo)新藥設(shè)計(jì)，以DNA作為藥物作用靶是有效的新興的藥物篩選和新藥設(shè)計(jì)手段［1－3］.

牡荊素屬于黃酮苷類化合物，存在于山楂、牡荊、竹葉等植物中，主要用于治療心血管疾病，也是防癌抗腫瘤的天然藥物成分，具有較強(qiáng)的抗氧化、抗癌、抗病毒的藥理活性，生物活性測定中對人類癌細(xì)胞顯示了廣泛的細(xì)胞毒作用.本論文主要通過紫外吸收光譜法、熒光光譜法和黏度法研究牡荊素與DNA的相互作用，該研究將有助于揭示牡荊素的抗癌機(jī)理.

圖1 牡荊素結(jié)構(gòu)式Fig.1 The structure of vitexin

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

TU－1901紫外可見分光光度計(jì)（普析通用，北京），PHS－25型p H計(jì)（上海雷磁），日立F－4500熒光分光光度儀（日本）.

DNA貯備液：稱取0.1 g的鯡魚精DNA（Sigma公司）以二次蒸餾水定容于100 m L的容量瓶中，由在260 nm處的吸光度（ε＝6600 L·mol－1·cm－1）確定其濃度，冰箱中冷藏.

牡荊素（中檢所，純度≥99.8%）貯備液：稱取一定量的牡荊素，以乙醇定容至100 mL的容量瓶中配制成濃度為10－3mol／L，置于0至4℃下保存.

緩沖溶液：用鹽酸滴加到0.1 mol／L的Tris（三羥甲基氨基甲烷）中，在p H計(jì)上調(diào)成p H7.4的緩沖溶液.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

在10 m L的比色管中依次加入1 m L p H7.4的緩沖溶液、小檗堿、DNA溶液，以及不同量的牡荊素工作溶液，定容、搖勻，進(jìn)行熒光光譜的測定.熒光激發(fā)波長定為358 nm，熒光發(fā)射峰位為532 nm，狹縫寬均為5 nm.

在10 m L的比色管中依次加入1 m L p H7.4的緩沖溶液、牡荊素工作溶液和不同量的DNA溶液，定容、搖勻，以試劑空白為參比，進(jìn)行紫外吸收光譜的測定.

2 結(jié)果與討論

2.1 牡荊素對DNA紫外吸收光譜的影響

圖2為牡荊素對DNA紫外吸收光譜的影響.

圖2 牡荊素對DNA紫外吸收光譜的影響Fig.2 The UV absorption spectra of DNA in the presence of vitexin

從圖2中可以看出，DNA在257 nm處有一最大紫外吸收峰，連續(xù)加入牡荊素后，其吸收度持續(xù)增強(qiáng)，表明牡荊素與DNA發(fā)生了反應(yīng).由于DNA在257 nm處的吸收峰來自于其堿基對，因此表明牡荊素與DNA的堿基對發(fā)生了結(jié)合.

2.2 DNA對牡荊素紫外吸收光譜的影響

圖3為DNA對牡荊素紫外吸收光譜的影響，由圖3可以看出，牡荊素在220 nm及274 nm處各有一紫外吸收峰，DNA的加入導(dǎo)致兩處吸收峰的吸光度明顯降低，同時(shí)紫外吸收峰明顯紅移（274 nm→279 nm）.由于藥物與DNA大致有3種結(jié)合模式：靜電式、嵌入式和溝槽式，其中靜電式結(jié)合不會(huì)發(fā)生藥物吸收峰的紅移或藍(lán)移；如果小分子與DNA是通過嵌入式鍵合，DNA的加入會(huì)引起藥物分子的紫外吸收峰發(fā)生紅移，溝槽式則發(fā)生藍(lán)移［4－6］.因此，可判斷葒草苷與DNA為嵌入式結(jié)合.

圖3 DNA對牡荊素紫外吸收光譜的影響Fig.3 The UV absorption spectra of vitexin in the presence of DNA

2.3 牡荊素對BR－DNA體系熒光光譜的影響

鹽酸小檗堿（BR）可作為熒光探針研究小分子化合物與DNA的相互作用，當(dāng)藥物小分子插入到DNA雙螺旋中時(shí)，可與小檗堿發(fā)生競爭結(jié)合DNA的反應(yīng)，將小檗堿從雙螺旋中擠出，從而熒光強(qiáng)度降低［4－5］.連續(xù)向小檗堿－DNA體系中加入不同量的牡荊素，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示.小檗堿－DNA體系在532 nm處有一顯著熒光發(fā)射峰，隨著牡荊素的連續(xù)加入，其熒光強(qiáng)度持續(xù)下降，說明牡荊素對小檗堿－DNA體系發(fā)生了熒光猝滅作用.

圖4 牡荊素對小檗堿－DNA體系熒光發(fā)射光譜的影響Fig.4 The fluorescence emission spectra of BR－DNA in the presence of vitexin

2.4 熒光猝滅方式的判斷

由動(dòng)態(tài)猝滅Stern－Volmer 方程：F0／F＝1＋Kqτ0c＝1＋Ksvc（1）［7］，根據(jù)牡荊素對BRDNA的猝滅光譜所得熒光強(qiáng)度計(jì)算得F0／F－1，按式（1）對c作線性回歸（圖5），求得在298 K時(shí)，牡荊素對BR－DNA的Stern－Volmer猝滅常數(shù)Ksv為5.785×103L／mol（相關(guān)系數(shù)為0.9647），則其雙分子速率常數(shù)Kq為5.785×1011L·mol－1·s－1，遠(yuǎn)大于各猝滅劑對生物大分子最大擴(kuò)散控制的碰撞猝滅常數(shù)2.0×1010L·mol－1·s－1［8］，因此牡荊素對BR－DNA的熒光猝滅不是動(dòng)態(tài)猝滅所引起，而是因?yàn)樾纬蓮?fù)合物所產(chǎn)生的靜態(tài)猝滅.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，牡荊素與DNA是以嵌入方式結(jié)合，導(dǎo)致小檗堿被擠出DNA雙螺旋，從而發(fā)生熒光猝滅.

圖5 牡荊素與BR－DNA反應(yīng)的stern－volmer方程Fig.5 Stern－Volmer curves for the binding of vitexin to BR－DNA at 298 K

2.5 牡荊素與DNA的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)由靜態(tài)猝滅公式

由式（2）分別作出不同溫度下牡荊素－DNA體系的關(guān)系圖.結(jié)果如圖6，通過外推截距和斜率可求出25℃和40℃牡荊素與DNA之間的結(jié)合常數(shù)分別為1.156×105L·mol－1和1.885×104L·mol－1，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)分別為1.336 3和1.061 5.

2.6 牡荊素與DNA結(jié)合反應(yīng)的熱力學(xué)性質(zhì)及作用力的影響

根據(jù)熱力學(xué)公式可以計(jì)算藥物小分子與生物大分子作用間的有關(guān)熱力學(xué)參數(shù)［10－11］：

根據(jù)熱力學(xué)參數(shù)可以簡單判斷其相互作用類型：ΔH＞0及ΔS＞0為疏水作用，ΔH＜0及ΔS＞0為靜電作用，ΔH＜0及ΔS＜0為氫鍵或者范德華作用［12－15］.

根據(jù)牡荊素與DNA的結(jié)合常數(shù)K1（298 K）＝1.156×105L·mol－1，K2（313 K）＝1.885×104L·mol－1，按式（3）～（5）可以求得二者結(jié)合過程的熱力學(xué)參數(shù)：

由此可初步判斷牡荊素與DNA主要是以氫鍵或者范德華作用力結(jié)合.

圖6 牡荊素與DNA反應(yīng)的lg［（F 0－F）／F］～lg c關(guān)系圖Fig.6 The plot of lg［（F 0－F）／F］vs lg c of the reaction between vitexin and DNA

圖7 牡荊素對DNA相對黏度的影響Fig.7 The effect of vitexin on the relative viscosity

2.7 牡荊素與DNA反應(yīng)的黏度研究

當(dāng)藥物分子以嵌入的方式與DNA結(jié)合，DNA雙螺旋變長，粘度增加［12，16］.向固定濃度的DNA溶液中加入不同量的牡荊素，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果，按下式計(jì)算相對粘度：η＝（t－t0）／t0.式中t0為空白溶液流經(jīng)毛細(xì)管所需時(shí)間，t為含不同量牡荊素的DNA溶液流經(jīng)毛細(xì)管所需時(shí)間，以（η／η0）1／3對結(jié)合比率r（cvitexin／cDNA）作圖，η0為未加入牡荊素時(shí)DNA的粘度［12］，如圖7所示.隨著牡荊素濃度的增大，DNA相對粘度逐漸增大，由此可知牡荊素與DNA以嵌入方式結(jié)合，結(jié)果與熒光、紫外光譜結(jié)果相吻合.

3 結(jié)論

本文利用熒光光譜法和紫外吸收光譜法研究了牡荊素與DNA相互作用的機(jī)理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，牡荊素與DNA主要通過氫鍵或者范德華作用力以嵌入模式結(jié)合，從而阻止了細(xì)胞中DNA的復(fù)制，這可能是牡荊素具有較強(qiáng)抗癌活性的原因之一.25℃和40℃兩個(gè)不同溫度下下牡荊素與DNA之間的結(jié)合常數(shù)分別為1.156×105和1.885×104L·mol－1，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)分別為1.3363和1.0615.

［1］ 吳會(huì)靈，楊芃原，張重杰，等.小分子與核酸相互作用的研究進(jìn)展［J］.分析化學(xué)，2004，32（9）：1256－1261.

［2］ Janjua N K，Siddiqa A，Yaqub A，et al.Spectrophotometric analysis of flavonoid－dna binding interactions at physiological conditions［J］.Spectrochim Acta A，2009，74：1135－1137.

［3］ Zhou J L，Qian Z M，Luo Y D，et al.Screening and mechanism study of components targeting DNA from the Chinese herb Lonicera japonica by liquid chromatography／mass spectrometry and fluorescence spectroscopy［J］.Biomed Chromatogr，2008，22：1164－1172.

［4］ 劉 煒，張瓊梅，畢和平.硫酸長春堿與DNA相互作用的機(jī)理研究［J］.海南師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2010，23（4）：403－406.

［5］ 沈景山，孫丹丹，付連春，等.熒光光譜法研究抗癌藥物與DNA的相互作用［J］.光譜學(xué)與光譜分析，2005，25（2）：232－234.

［6］ Li N，Ma Y，Yang C，et al.Interaction of anticancer drug，mitoxantrone with DNA analyzed by electrochemical and spectroscopic methods［J］.Biophys Chem，2005，116：199－205.

［7］ 鄧勝國，鄧澤元，范亞葦，等.荷葉中紫云英苷和DNA相互作用的光譜學(xué)研究［J］.光譜學(xué)與光譜分析，2010，30（2）：476－480.

［8］ Kandagal P B，Seetharamappa J，Shaikh S M T，et al.Bind－ing of trazodone hydrochloride with human serum albumin：A spectroscopic study［J］.J Photochem Photobiol A，2007，185：239－244.

［9］ Kandagal P B，Ashoka S，Seetharamappa J，et al.Study of the interaction of an anticancer drug with human and bovine serum albumin：Spectroscopic approach［J］.J Pharmaceutical and Biomedical Anal，2006，41：393－399.

［10］ 劉 煒，張瓊梅，史載鋒，等.酒石酸長春質(zhì)堿與DNA相互作用的光譜研究［J］.華中師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2011，45（4）：595－598

［11］ Zhao N，Wang X M，Pan H Z，et al.Spectroscopic studies on the interaction between tryptophan－erbium（III）complex and herring sperm DNA［J］.Spectrochim Acta A，2010，75：1435－1442.

［12］ 劉 煒，張瓊梅.巖白菜素與DNA相互作用的光譜研究［J］.海南師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2011，24（2）：177－179.

［13］ Bi S，Zhang H，Qiao C，et al.Studies of interaction of emodin and DNA in the presence of ethidium bromide by spectroscopic method［J］.Spectrochim Acta A，2008，69：123－129.

［14］ Yuan J L，Liu H，Kang X，et al.Characteristics of the isomeric flavonoids apigenin and genistein binding to hemoglobin by spectroscopic methods［J］.J Mol Struct，2008，891：333－339.

［15］ Lu Y，Lv J，Zhang G S，et al.Interaction of an anthracycline disaccharide with ctDNA：Investigation by spectroscopic technique and modeling studies［J］.Spectrochim Acta A，2010，75：1511－1515.

［16］ Bhat I H，Tabassum S.Synthesis of new piperazine derived Cu（II）／Zn（II）metal complexes，their DNA binding studies，electrochemistry and anti－microbial activity：validation for specific recognition of Zn（II）complex to DNA helix by interaction with thymine base［J］.Spectrochim Acta A，2009，72：1026－1033.