董 敏，徐 敏，陳一源

(遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，貴州 遵義 563000)

多囊卵巢綜合癥是(polycystic ovary syndrome,PCOS)育齡女性常見的排卵障礙，50%的PCOS患者同時(shí)伴有不孕，是一種復(fù)雜的多基因疾病，且會(huì)受到遺傳和環(huán)境的影響，包括生活方式、飲食等。PCOS發(fā)病可能與下丘腦-垂體-卵巢軸紊亂、高雄激素血癥、高胰島素血癥、胰島素抵抗、肥胖甚至是機(jī)體炎癥相關(guān)[1]。有中醫(yī)學(xué)者認(rèn)為PCOS的病機(jī)主要是來自于脾腎虧虛，肝經(jīng)郁火、脾腎兩虛會(huì)導(dǎo)致痰血、痰濕，因此肝氣郁結(jié)、脾腎虧虛是PCOS之本，痰血、痰濕是本病之標(biāo)，痰血、痰濕日久可能引起濁毒[2-3]。也有學(xué)者認(rèn)為腎虛所導(dǎo)致的氣血失調(diào)，使卵子不能排出、卵巢增大，同時(shí)腎虛會(huì)引起痰血、痰濕，導(dǎo)致胰島素抵抗、高雄激素血癥等內(nèi)分泌紊亂，同時(shí)引起患者肥胖、月經(jīng)不調(diào)，嚴(yán)重者不孕[4]。近來有文獻(xiàn)表明葛根素在對(duì)抗高雄激素、脂代謝異常、胰島素抵抗、氧化應(yīng)激方面有較好療效[5]，但其機(jī)制尚不明確。Guo等[6]發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)Toll樣受體4(TLR4)使TLR4/NF-κB信號(hào)通路下調(diào)，可以抑制PCOS大鼠炎癥反應(yīng)，從而改善PCOS大鼠的胰島素抵抗。郭亞東等[7]發(fā)現(xiàn)葛根素可以下調(diào)肥胖型高血壓患者血管內(nèi)皮細(xì)胞的TLR4/NF-κB信號(hào)，從而保護(hù)血管內(nèi)皮。本文旨在探討葛根素對(duì)PCOS模型大鼠糖代謝的影響，同時(shí)對(duì)TLR4/NF-κB信號(hào)通路是否參與葛根素對(duì)PCOS的治療進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 100只健康雌性SD大鼠，7周齡，210～230 g，購自中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，將大鼠飼養(yǎng)于清潔級(jí)動(dòng)物房，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK(滬)2019-0003。

1.2 試劑與藥物 脫氫表雄酮(DHEA)(美國Sigma公司，批號(hào)709549)；鹽酸二甲雙胍片(中美上海施貴寶制藥有限公司，批號(hào)1210010)；葛根素注射液(成都平原藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H20054815，批號(hào)111034-201901)。大鼠血清中促黃體生成素(LH)ELISA試劑盒(貨號(hào)Q69170)、睪酮(T)ELISA試劑盒(貨號(hào)Q06415)、卵泡刺激素(FSH)ELISA試劑盒(貨號(hào)Q60687)(美國R&D公司)；白細(xì)胞介素6(IL-6)ELISA試劑盒(貨號(hào)ab2018113)、C反應(yīng)蛋白(CRP)ELISA試劑盒(貨號(hào)ab256398)、腫瘤壞死因子(TNF-α)ELISA試劑盒(貨號(hào)ab46070)、HE染色試劑盒(貨號(hào)ab143166)(英國Abcam公司)；葡萄糖檢測(cè)試劑盒(上海浩然生物科技有限公司，批號(hào)910202)；RT-qPCR試劑盒(日本TaKaRa公司，AK3001)；Trizol(美國Invitrogen公司，批號(hào)10296028)。

1.3 儀器 冷動(dòng)離心機(jī)(美國Thermo公司)；Gel Doc 2000型凝膠電泳儀(美國Bio-Rad公司)；PCR儀(德國Biometra公司)；光學(xué)顯微鏡(德國Leica公司)；酶標(biāo)儀(美國BioTek公司)。

1.4 模型建立 取80只大鼠根據(jù)文獻(xiàn)[8]方法進(jìn)行PCOS模型構(gòu)建。配制0.6 g/kg的DHEA，每次注射前用0.2 mL大豆油稀釋后注射于大鼠頸背部皮下，每天1次。20 d后，取大鼠1個(gè)動(dòng)情周期(一般連續(xù)4 d)的陰道涂片，于光學(xué)顯微鏡下觀察，若觀察到陰道上皮在此周期內(nèi)持續(xù)大量角化且無核視為模型構(gòu)建成功。

1.5 PCOS模型大鼠分組及干預(yù) 將最終建模成功的60只大鼠，隨機(jī)分為模型組、二甲雙胍組、二甲雙胍+葛根素組，每組20只。根據(jù)人鼠藥物劑量換算出大鼠所需藥量。二甲雙胍組灌胃給予二甲雙胍粉末(270 mg/kg)，每次灌胃前用生理鹽水溶解；二甲雙胍+葛根素組在二甲雙胍組基礎(chǔ)上腹腔注射100 mg/kg葛根素注射液；模型組腹腔注射等容量生理鹽水，連續(xù)給藥4周，即7個(gè)動(dòng)情周期[5]，另選取20只未造模大鼠作為對(duì)照組。

1.6 監(jiān)測(cè)指標(biāo) 給藥4周后，禁食24 h，記錄大鼠體質(zhì)量，異氟烷氣體吸入麻醉大鼠后，取腹主動(dòng)脈血，離心后取血清。葡萄糖試劑盒檢測(cè)大鼠空腹血糖(FBG)，放射免疫法測(cè)量空腹胰島素(FINS)，并計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)值(IR)[8]，公式為IR=(FBG× FINS)/22.5。第1次取血后立即灌胃給予葡萄糖，2 h后抽取尾靜脈血，檢測(cè)餐后2 h血糖(2 h PBG)。按ELISA試劑盒檢測(cè)大鼠血清中LH、T、FSH、IL-6、CRP和TNF-α水平。此外，取大鼠卵巢組織，去掉表面脂肪組織后，用4%多聚甲醛固定，乙醇逐級(jí)脫水，用石蠟進(jìn)行包埋，切片厚度5 μm，最后進(jìn)行HE染色，并置于顯微鏡下觀察組織形態(tài)。

1.7 RT-qPCR檢測(cè)TLR4、NF-κB及ox-LDL的mRNA表達(dá) 使用Trizol試劑盒提取卵巢組織勻漿中的總RNA，鑒定純度和完整性。用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，見表1，按試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，95 ℃ 30 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增完成后進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳40 min，用Gel Doc 2000型凝膠電泳進(jìn)行成像和分析。GAPDH作為內(nèi)參，根據(jù)灰度值計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。

表1 大鼠TLR4、NF-κB及ox-LDL引物序列Tab.1 Primer sequences of TLR4,NF-κB and ox-LDL in rats

2 結(jié)果

2.1 葛根素對(duì)PCOS大鼠體質(zhì)量的影響 如表2所示，模型組大鼠體質(zhì)量高于對(duì)照組(P<0.05)；二甲雙胍組和二甲雙胍聯(lián)合葛根素組體質(zhì)量低于模型組(P<0.05)，且和對(duì)照組大鼠比較無顯著差異(P>0.05)；二甲雙胍組和二甲雙胍聯(lián)合葛根素組大鼠體質(zhì)量比較無顯著差異(P>0.05)。

表2 各組大鼠體質(zhì)量Tab.2 Body weights of rats in each

2.2 葛根素對(duì)PCOS大鼠血清性激素水平的影響 如表3所示，與對(duì)照組比較，模型組和二甲雙胍組大鼠FSH降低(P<0.05)，LH、T水平升高(P<0.05)；與模型組比較，二甲雙胍組和二甲雙胍+葛根素組大鼠FSH水平均升高(P<0.05)，LH、T水平均降低(P<0.05)，且二甲雙胍+葛根素組大鼠作用更顯著(P<0.05)。

表3 各組大鼠血清性激素水平Tab.3 Serum levels of sex hormones of rats in each

2.3 葛根素對(duì)PCOS大鼠血糖水平和胰島素抵抗的影響 如表4所示，模型組大鼠FBG、2 h PBG、FINS水平及IR均高于對(duì)照組(P<0.05)；二甲雙胍組和二甲雙胍+葛根素組大鼠FBG、2 h PBG、FINS水平及IR均低于模型組(P<0.05)；二甲雙胍+葛根素組FINS水平和IR低于二甲雙胍組(P<0.05)。

表4 各組大鼠血糖水平和胰島素抵抗Tab.4 Blood sugar levels and IR of rats in each

2.4 葛根素對(duì)PCOS大鼠卵巢組織病理形態(tài)變化的影響 如圖1A所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞層數(shù)較少，表面可見大小不等囊泡；二甲雙胍組顆粒細(xì)胞形態(tài)完整，排列稍亂，可見少許囊泡；而二甲雙胍組+葛根素組與對(duì)照組大鼠形態(tài)相似，顆粒細(xì)胞排列整齊且形態(tài)完整，無囊泡。對(duì)囊泡數(shù)目(圖1B)及顆粒細(xì)胞層(圖1C)統(tǒng)計(jì)分析顯示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠卵巢囊泡數(shù)目增加(P<0.01)顆粒細(xì)胞層厚度減少(P<0.01)；與模型組比較，二甲雙胍組和二甲雙胍+葛根素組大鼠囊泡數(shù)目均減少(P<0.05，P<0.01)，顆粒細(xì)胞層厚度均增加(P<0.05，P<0.01)，且二甲雙胍+葛根素組作用更顯著(P<0.05)。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；與二甲雙胍組比較，△P<0.05。圖1 各組大鼠卵巢形態(tài)病理形態(tài)變化Fig.1 Morphological and pathological changes of rat ovary in each

2.5 葛根素對(duì)PCOS大鼠炎性因子水平的影響 如表5所示，與對(duì)照組比較，模型組和二甲雙胍組大鼠血清IL-6、TNF-α和CRP水平均升高(P<0.05)；與模型組比較，二甲雙胍組和二甲雙胍+葛根素組大鼠血清IL-6、TNF-α和CRP水平均降低(P<0.05)；二甲雙胍+葛根素組大鼠血清IL-6、TNF-α和CRP水平低于二甲雙胍組(P<0.05)。

表5 各組大鼠炎性因子水平Tab.5 Inflammation factors levels of rats in each

2.6 葛根素對(duì)PCOS大鼠卵巢組織TLR4、NF-κB、ox-LDLmRNA表達(dá)的影響 如表6、圖2所示，與對(duì)照組比較，模型組和二甲雙胍組大鼠卵巢組織TLR4、NF-κB、ox-LDL表達(dá)均升高(P<0.05)；與模型組比較，二甲雙胍組和二甲雙胍+葛根素組大鼠卵巢組織TLR4、NF-κB、ox-LDL表達(dá)均降低(P<0.05)；二甲雙胍+葛根素組大鼠卵巢組織TLR4、NF-κB、ox-LDL表達(dá)低于二甲雙胍組(P<0.05)。

表6 各組大鼠卵巢組織TLR4、NF-κB、ox-LDL mRNA表達(dá)Tab.6 mRNA expressions of TLR4,NF-κB and ox-LDL in ovarian tissues of rats in each

圖2 各組大鼠TLR4、NF-κB及ox-LDL mRNA表達(dá)圖Fig.2 mRNA expressions of TLR4,NF-κB and ox-LDL of rats in each group

3 討論

多囊卵巢綜合癥(PCOS)是生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域臨床治療和研究的熱點(diǎn)、難點(diǎn)。LH的過量分泌會(huì)刺激卵巢分泌雄激素，雄激素的分泌過量和FSH的分泌過少，會(huì)卵泡發(fā)育受限，最終導(dǎo)致PCOS[9]。肥胖也與PCOS的發(fā)病相關(guān)，PCOS患者脂肪功能異常，脂肪組織分泌的瘦素會(huì)影響機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性，從而導(dǎo)致胰島素抵抗，血糖失調(diào)，促進(jìn)PCOS發(fā)展[10]。此外，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)PCOS患者卵巢組織中，存在淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)，認(rèn)為PCOS可能是一種慢性炎癥?；颊哐褐蠺NF-α、CRP、IL-6水平均升高，而炎癥因子異常加重患者胰島素抵抗，導(dǎo)致卵泡發(fā)育障礙[11]。本研究擬從體質(zhì)量、性激素水平、胰島素抵抗、炎癥因子水平這幾個(gè)方面探索治療PCOS的靶點(diǎn)。本研究通過DHEA皮下注射建立PCOS大鼠模型，與對(duì)照組大鼠比較，PCOS大鼠體質(zhì)量增加，F(xiàn)SH水平降低，LH、T水平升高，從血糖和胰島素水平來看，PCOS大鼠FBG、2 h PBG、FINS、IR水平均升高，炎性因子IL-6、TNF-α、CRP水平也升高，同時(shí)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞層數(shù)減少，表面可見大小不等囊泡，說明PCOS大鼠模型建立成功。

二甲雙胍是常見的2型糖尿病口服藥，也被用于PCOS的治療。研究表明，接受二甲雙胍治療后，PCOS患者胰島素敏感性提高，血清T、LH水平降低，F(xiàn)SH水平升高[12]。另有針對(duì)肥胖PCOS患者的研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用二甲雙胍后患者FINS水平下降，月經(jīng)周期改善，血清T水平下降[13]。姜曉琳等[14]發(fā)現(xiàn)二甲雙胍用于PCOS大鼠，可以降低大鼠血清炎癥因子水平。本研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍治療組大鼠體質(zhì)量下降，F(xiàn)SH水平升高，LH、T水平降低，血糖和胰島素水平均降低，同時(shí)炎性因子水平也降低，與文獻(xiàn)結(jié)果一致。

葛根素是從葛根中提取的異黃酮類衍生物，在臨床應(yīng)用已超過十年。葛根素被證明可以降低血脂、胰島素抵抗和雄激素水平[15-16]。本研究聯(lián)合葛根素注射液和二甲雙胍用于治療PCOS大鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)治療后PCOS大鼠體質(zhì)量、性激素水平、胰島素抵抗、血糖水平均下降，且對(duì)降低LH、T水平，降低囊泡數(shù)量，提高顆粒細(xì)胞層厚度和改善FINS、IR作用更顯著，說明葛根素對(duì)改善卵巢形態(tài)有明顯作用。炎癥反應(yīng)中，TLR4激活后，通過IL-1受體的相關(guān)激酶家族成員及磷酸化激活TGF-β活化酶，進(jìn)一步激活NF-κB的上游抑制蛋白，并使IκB磷酸化降解，導(dǎo)致NF-κB p65入核，誘導(dǎo)炎癥因子的表達(dá)[17]。近來研究發(fā)現(xiàn)TLR4廣泛存在于組織和細(xì)胞中，TLR4激活可促進(jìn)胰島素抵抗，因此調(diào)節(jié)TLR4可以改善胰島素功能[6]。Guo等[6]研究發(fā)現(xiàn)PCOS胰島素抵抗大鼠血清中TLR4表達(dá)升高，且TLR4/NF-κB通路被激活。PCOS是一種慢性低級(jí)別炎癥，尤其是伴隨著胰島素抵抗的患者，其體內(nèi)IL-6、TNF-α表達(dá)增加。葛根素可以通過抑制NF-κB，抑制CRP、IL-6、TNF-α的表達(dá)，從而發(fā)揮保護(hù)糖尿病大鼠腎臟的作用[18]。雷凱雄等[19]發(fā)現(xiàn)葛根素能通過下調(diào)NF-κB和TGF-β抑制肝纖維化的發(fā)展。本研究中，葛根素和二甲雙胍聯(lián)用組對(duì)LH、T、FINS、IR、IL-6、TNF-α水平的改善作用均優(yōu)于二甲雙胍單獨(dú)使用組，同時(shí)聯(lián)用組TLR4、NF-κB和ox-LDL表達(dá)低于單獨(dú)使用二甲雙胍組，說明葛根素有可能通過調(diào)控TLR4/NF-κB通路，以降低PCOS大鼠炎癥因子水平，從而達(dá)到治療PCOS、促進(jìn)排卵的目的。另外ox-LDL也可以與TLR4結(jié)合，并激活NF-κB，促進(jìn)炎性因子產(chǎn)生[20]，本研究中聯(lián)用組比單獨(dú)使用二甲雙胍組PCOS大鼠體內(nèi)ox-LDLmRNA表達(dá)更低。以上結(jié)果表明，葛根素和二甲雙胍聯(lián)用能加強(qiáng)二甲雙胍的抗炎、降糖、降胰島素作用，而這一作用可能是通過TLR4/NF-κB通路實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，葛根素作為一種代謝快、毒性小、價(jià)格低的藥物，可以降低PCOS大鼠血糖水平、胰島素抵抗、性激素水平、炎性因子水平和ox-LDL表達(dá)，其可能是通過調(diào)控TLR4/NF-κB通路實(shí)現(xiàn)的。