李婷婷，王 淼，王 欣，黃曉婧，孔衛(wèi)東，曾 楨，劉 莉*

(1.成都市藥品檢驗(yàn)研究院，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中藥材質(zhì)量監(jiān)測(cè)評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610045；2.成都市農(nóng)業(yè)質(zhì)量監(jiān)測(cè)中心，四川 成都 610041)

風(fēng)熱感冒顆粒由板藍(lán)根、連翹、薄荷、荊芥穗、桑葉、蘆根、牛蒡子、菊花、苦杏仁、桑枝、六神曲11味藥材制成，具有清溫解毒、宜肺利咽之功效，常用于治療風(fēng)熱感冒、鼻塞、頭痛、咳嗽、多痰等癥[1]，該制劑現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)主要是《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第一冊(cè)，但僅有性狀、制劑通則檢查項(xiàng)，無(wú)含量測(cè)定項(xiàng)?，F(xiàn)有文獻(xiàn)[2-5]也主要集中于牛蒡子苷、連翹苷、苦杏仁苷、綠原酸等成分的含量測(cè)定，不能從整體上控制風(fēng)熱感冒顆粒內(nèi)在質(zhì)量。

現(xiàn)代藥理研究表明，(R,S)-告依春、新綠原酸、綠原酸、苦杏仁苷、隱綠原酸、連翹酯苷I、連翹酯苷A、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、連翹苷、牛蒡苷、牛蒡苷元為風(fēng)熱感冒顆?；钚猿煞諿6-14]。因此，本實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)[15-18]，將建立UPLC法同時(shí)測(cè)定風(fēng)熱感冒顆粒中上述13種成分的含量，以期更全面、科學(xué)、快速地控制該制劑質(zhì)量。

1 材料

1.1 儀器 Waters Acquity H Class超高效液相色譜儀(美國(guó)沃特世科技公司)；XPE26(0.001 mg)、ME204E電子天平(0.1 mg)(瑞士梅特勒-托利多公司)；SK250H超聲儀(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)。

1.2 試劑與藥物 (R,S)-告依春(批號(hào)111753-201706，純度100.0%)、綠原酸(批號(hào)110753-201817，純度96.8%)、苦杏仁苷(批號(hào)110820-201808，純度88.2%)、連翹酯苷A(批號(hào)111810-201707，純度97.2%)、連翹苷(批號(hào)110821-201816，純度95.1%)、牛蒡苷(批號(hào)110819-201812，純度95.0%)對(duì)照品均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；新綠原酸(批號(hào)19042305，純度≥98%)對(duì)照品由成都普菲德生物技術(shù)有限公司提供；隱綠原酸(批號(hào)MUST-20042403，純度99.07%)、連翹酯苷I(批號(hào)MUST-20041612，純度98.26%)、異綠原酸B(批號(hào)MUST-20031602，純度99.05%)、異綠原酸C(批號(hào)MUST-20031603，純度99.84%)、牛蒡苷元(批號(hào)MUST-19060509，純度99.62%)對(duì)照品均由成都曼斯特生物科技有限公司提供；異綠原酸A(批號(hào)ST03860120，純度≥98.0%)對(duì)照品由上海詩(shī)丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司提供。風(fēng)熱感冒顆粒共12批(A企業(yè)，批號(hào)S1；B企業(yè)，批號(hào)S2、S3；C企業(yè)，批號(hào)S4、S5；D企業(yè)，批號(hào)S6；E企業(yè)，批號(hào)S7；F企業(yè)，批號(hào)S8；G企業(yè)，批號(hào)S9；H企業(yè)，批號(hào)S10、S11；I企業(yè)，批號(hào)S12)。甲醇、乙腈、磷酸為色譜純；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Waters Acquity UPLC Hss T3色譜柱(150 mm×2.1 mm，1.8 μm)；流動(dòng)相乙腈(A)-0.01%磷酸(B)，梯度洗脫(0～5 min，5%A；5～10 min，5%～11%A；10～11 min，11%～12.5%A；11～20 min，12.5%～19%A；20～30 min，19%～28%A；30～35 min，28%～31%A；35～40 min，31%～40%A；40～45 min，40%A)；體積流量0.5 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)0～4 min 240 nm，4～9.2 min 327 nm，9.2～11.5 min 207 nm，11.5～26 min 327 nm，26～45 min 227 nm。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取各對(duì)照品適量，甲醇溶解，搖勻，濾過(guò)，即得[各成分質(zhì)量濃度分別為(R,S)-告依春541.00 μg/mL、新綠原酸502.94 μg/mL、綠原酸630.17 μg/mL、苦杏仁苷452.02 μg/mL、隱綠原酸571.34 μg/mL、連翹酯苷I 548.68 μg/mL、連翹酯苷A 719.09 μg/mL、異綠原酸B 520.61 μg/mL、異綠原酸A 618.38 μg/mL、異綠原酸C 504.79 μg/mL、連翹苷505.84 μg/mL、牛蒡苷1 040.44 μg/mL、牛蒡苷元626.51 μg/mL]。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取本品5.0 g，置于錐形瓶中，精密加入25 mL甲醇，稱定質(zhì)量，超聲提取30 min，放冷，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按處方比例，制備缺板藍(lán)根、菊花、苦杏仁、連翹、牛蒡子、桑葉、桑枝的陰性樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性考察 精密吸取對(duì)照品、供試品、陰性樣品溶液適量，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣1 μL 測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1。由此可知，各成分色譜峰峰形良好，陰性無(wú)干擾。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 精密量取對(duì)照品溶液適量，甲醇稀釋成系列質(zhì)量濃度，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，結(jié)果見(jiàn)表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一份對(duì)照品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得(R,S)-告依春、新綠原酸、綠原酸、苦杏仁苷、隱綠原酸、連翹酯苷I、連翹酯苷A、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、連翹苷、牛蒡苷、牛蒡苷元峰面積RSD分別為1.38%、1.42%、1.41%、1.31%、1.37%、1.47%、1.47%、1.29%、1.48%、1.48%、1.40%、1.41%、1.47%，表明儀器精密度良好。

1.(R，S)-告依春 2.新綠原酸 3.綠原酸 4.苦杏仁苷 5.隱綠原酸 6.連翹酯苷I 7.連翹酯苷A 8.異綠原酸B 9.異綠原酸A 10.異綠原酸C 11.連翹苷 12.牛蒡苷 13.牛蒡苷元1.(R,S)-epigoitrin 2.neochlorogenic acid 3.chlorogenic acid 4.amygdalin 5.cryptochlorogenic acid 6.forsythoside I 7.forsythoside A 8.isochlorogenic acid A 9.isochlorogenic acid B 10.isochlorogenic acid C 11.forsythin 12.arctiin 13.arctigen圖1 各成分UPLC色譜圖Fig.1 UPLC chromatograms of various constituents

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一份供試品溶液，于0、4、8、12、16、24 h在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得(R,S)-告依春、新綠原酸、綠原酸、苦杏仁苷、隱綠原酸、連翹酯苷I、連翹酯苷A、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、連翹苷、牛蒡苷、牛蒡苷元峰面積RSD分別為2.58%、2.19%、2.18%、2.08%、1.31%、1.38%、1.95%、1.76%、1.69%、1.86%、2.02%、2.25%、2.42%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得(R,S)-告依春、新綠原酸、綠原酸、苦杏仁苷、隱綠原酸、連翹酯苷I、連翹酯苷A、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、連翹苷、牛蒡苷、牛蒡苷元含量RSD分別為2.05%、1.62%、2.28%、2.72%、1.85%、2.75%、1.10%、1.98%、1.84%、1.79%、1.51%、1.85%、1.72%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取各成分含量已知的本品(批號(hào)20190101)粉末約2.5 g，共9份，每3份為1組，分別按50%、100%、150%水平精密加入對(duì)照品溶液適量，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，(R,S)-告依春、新綠原酸、綠原酸、苦杏仁苷、隱綠原酸、連翹酯苷I、連翹酯苷A、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、連翹苷、牛蒡苷、牛蒡苷元平均加樣回收率分別為96.14%、99.11%、99.46%，103.52%、99.87%、100.73%、100.33%、97.65%、97.89%、98.69%、95.42%、101.19%、100.25%，RSD分別為2.29%、1.41%、2.89%、2.33%、1.50%、2.25%、1.59%、1.98%、2.05%、2.01%、2.89%、2.39%、2.75%。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.5 樣品含量測(cè)定 取12批樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量(其中樣品S10、S11中牛蒡苷含量超出標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍，故再分別精密量取1 mL至10 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，重新進(jìn)行計(jì)算)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各成分含量測(cè)定結(jié)果(mg/g，n=3)Tab.2 Results of content determination of various constituents (mg/g，n=3)

3 討論

3.1 提取方法篩選 本實(shí)驗(yàn)考察了不同提取方式(回流、超聲)、提取溶劑、提取溶劑體積、提取時(shí)間對(duì)各成分提取率的影響，最終確定為25 mL甲醇超聲提取30 min。

3.2 流動(dòng)相系統(tǒng)篩選 由于風(fēng)熱感冒顆粒藥味較多，各成分化學(xué)性質(zhì)相差較大，故采用梯度洗脫。再考察了乙腈-磷酸、甲醇-磷酸流動(dòng)相(磷酸體積分?jǐn)?shù)為0.01%、0.02%、0.03%)，發(fā)現(xiàn)乙腈-0.01%磷酸洗脫時(shí)各成分色譜峰峰形對(duì)稱，分離較好。

3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)篩選 由于各成分紫外光譜差異較大，不能在同一波長(zhǎng)下測(cè)定，為了兼顧其最大吸收波長(zhǎng)，提高靈敏度，減少干擾，選擇240、327、207、227 nm波長(zhǎng)切換模式。

3.4 含量分析 表2顯示，不同批次風(fēng)熱感冒顆粒中各成分含量存在較大差異，以(R,S)-告依春、連翹酯苷A、牛蒡苷更明顯，可能與原藥材產(chǎn)地、采收季節(jié)、企業(yè)生產(chǎn)工藝等因素有關(guān)。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立UPLC法同時(shí)測(cè)定風(fēng)熱感冒顆粒中(R,S)-告依春、新綠原酸、綠原酸、苦杏仁苷、隱綠原酸、連翹酯苷I、連翹酯苷A、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、連翹苷、牛蒡苷、牛蒡苷元的含量，該方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，可為更全面科學(xué)地評(píng)價(jià)和控制該制劑質(zhì)量提供依據(jù)。