陳彬羽 沈凱譽 高文倉

免疫療法被認為是21世紀腫瘤學治療領域最重要的發(fā)現(xiàn)，2018年度諾貝爾生理或醫(yī)學獎頒給了因發(fā)現(xiàn)腫瘤負性免疫調節(jié)抑制治療方法的2位科學家，使得免疫療法成為當前腫瘤學最活躍的研究領域。嵌合抗原受體 T細胞（chimeric antigen receptor T cell,CAR-T）免疫療法作為腫瘤免疫治療的重要組成部分，主要用于血液腫瘤，但用于實體性腫瘤，尤其是肺癌，目前還在探索階段。為此，本文對目前CAR-T免疫療法在肺癌中的應用研究進展作一綜述，為進一步實驗研究及臨床研究提供參考依據(jù)。

1 CAR-T的結構和功能

CAR-T免疫療法通過基因工程技術將靶向腫瘤抗原的抗原嵌合受體（chimeric antigen receptor,CAR）引入到自體或異體T細胞內，使T細胞表達靶向腫瘤抗原的CAR，從而特異性識別腫瘤抗原，清除癌細胞，達到臨床緩解甚至根治腫瘤的目的，是一種過繼性免疫治療方法。CAR由細胞外抗原結合區(qū)、鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)和細胞內信號轉導區(qū)4部分組成[1]（圖1），起著識別腫瘤相關抗原、細胞內信號轉導、活化T細胞的作用[2-3]（圖2）。CAR-T被廣泛用于血液系統(tǒng)腫瘤的治療。如針對CD19靶點的CAR-T可以顯著緩解甚至治愈易復發(fā)性和難治性B淋巴細胞腫瘤，臨床數(shù)據(jù)顯示完全緩解率達68%～93%[4]。在CD19表達較低的急性B淋巴細胞白血病及非霍奇金淋巴瘤則較常表達CD20[5]、CD22[6]等靶點，這種同時靶向雙靶點的雙特異性CAR-T細胞的出現(xiàn)，克服了單靶點治療的局限性[7]。隨著研究的進展，許多其他的作用靶點也先后被發(fā)現(xiàn)，如 CD83[8]、CD47[9]、CD126[10]等。

圖1 CAR結構

圖2 CAR功能

2 CAR-T治療肺癌的靶點選擇

CAR-T治療肺癌的研究仍處于早期探索階段，根據(jù)不斷發(fā)現(xiàn)的特異性靶點調整CAR-T結構，現(xiàn)已取得了一些進展。臨床試驗中非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）等實體瘤的靶向抗原見表1。

表1 臨床試驗中NSCLC等實體瘤的靶向抗原

2.1 表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR） EGFR是一種糖蛋白受體，活化的EGFR可通過信號轉導刺激磷脂酰肌醇激酶-AKT-雷帕霉素靶蛋白-（phosphatidylinositide-AKT-mammalian target of rapamycin,PI3K-AKT-mTOR）、信號傳導及轉錄激活蛋白（signal transducer and activator of transcription,STAT）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）等通路，最終導致細胞增殖和癌變[11]。在NSCLC中，大多數(shù)的EGFR突變與腫瘤增殖、轉移有關[12]，目前除可用EGFR-TKI酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor,TKI）方案治療外[13]，也可以用以EGFR為靶點的CAR-T浸潤腫瘤組織。2017年寧波腫瘤醫(yī)院的一項Ⅰ期臨床試驗（NCT03182816）對9例晚期復發(fā)/難治性EGFR陽性NSCLC患者輸注CAR-T后，6例患者病情穩(wěn)定，2例患者病情惡化，1例患者表現(xiàn)出部分反應并持續(xù)了13個月以上。該研究評估了此療法具可行性和安全性[14]。此外有研究發(fā)現(xiàn)：NSCLC患者腫瘤部位趨化因子CXC配體13[chemokine（C-X-C motif）ligand 13,CXCL13]高表達，可與T細胞上表達的趨化因子CXC受體5（C-X-C chemokine receptor type 5,CXCR5）結合。通過設計表達EGFR和CXCR5的CAR-T，證明EGFR-CXCR5-CART具有與EGFR-CAR-T相似的殺傷活性，且添加CXCR5可促進T細胞遷移，為NSCLC患者的治療提供了新途徑[15]。因此，抗EGFR-CAR-T治療EGFR陽性肺癌患者是有一定療效的，但其安全性和治療效果仍需經過更多的臨床研究來評估。

2.2 間皮素（mesothelin,MSLN） MSLN是一種細胞表面糖蛋白，在正常組織中低表達，在大多數(shù)卵巢癌、胰腺癌、肺癌及惡性間皮瘤等惡性腫瘤中過度表達[16-17]，是一種較為理想的CAR-T治療靶點。多項臨床前和臨床研究發(fā)現(xiàn)：MSLN參與腫瘤的惡性轉化，并與腫瘤的侵襲性有明確的關聯(lián)，導致腫瘤細胞侵襲局部組織并最終轉移[18]。Zhao等[19]設計了靶向MSLN的第3代CAR-T（在細胞膜上表達M28z10T蛋白），表達M28z10的T細胞對MSLN陽性肺癌細胞株的抗腫瘤作用增強并延長T細胞的作用時間，在肺癌患者來源的異種移植物中顯示出較強的抗腫瘤活性。中山大學第一附屬醫(yī)院2017年注冊的一項Ⅰ期臨床試驗（NCT03198546）將可分泌人類IL-7和趨化因子配體19（chemokine ligand 19,CCL19）（簡稱7×19）的CART注入表達MSLN的晚期實體瘤患者血液中，其中1例患者在抗MSLN-（7×19）-CAR-T治療靜脈輸注后的第240天腫瘤幾乎完全消失[20]。美國國立衛(wèi)生研究院臨床中心（NCT01583686）靶向MSLN的CAR-T治療肺癌轉移后腫瘤，15例參與研究，發(fā)生貧血1例，淋巴細胞計數(shù)減少2例，PLT減少1例，可見MSLN-CAR-T免疫療法的安全性有待提高，此試驗也因進展緩慢于2019年終止。近年來，研究者利用基因工程對CAR-T的結構進行優(yōu)化，如上海瑞金醫(yī)院進行的mRNA工程化MSLN-CAR-T的臨床試驗（NCT04981691）、美國紀念斯隆-凱特琳癌癥中心進行的含抗程序性細胞死亡蛋白1成分的MSLN-CAR-T的臨床試驗（NCT04577326）等正在招聘中。

2.3 黏蛋白（mucoprotein,MUC1） MUC1是一種高分子量（＞200 kD）糖蛋白，通常在腫瘤組織中高表達，正常組織中低表達。研究發(fā)現(xiàn)：MUC1在肺癌中高表達，且在多個肺癌組織中被發(fā)現(xiàn)異常糖基化，幫助癌細胞轉移擴散，并與NSCLC患者較差的總生存率相關[21]。中山大學第一附屬醫(yī)院腫瘤團隊構建了靶向包括MUC1在內的多種第3代CAR-T，其抗癌功能已通過多種體外和體內實驗驗證，正在招募個體，就MUC1-CAR-T免疫療法對晚期難治性實體瘤患者的安全性、耐受性和初步療效首先進行測試（NCT03198052），將 MUN1聯(lián)合其他靶點共同治療肺癌。如Wei等[22]設計了前列腺干細胞抗原（prostate stem cell antigen,PSCA）和MUC1雙重定向的CAR-T，可以有效抑制異種移植小鼠的NSCLC腫瘤生長。此外，一項使用MUC1-CAR-T聯(lián)合敲除程序性死亡因子-1（programmed death 1,PD-1）治療晚期NSCLC的Ⅰ/Ⅱ期臨床研究（NCT03525782）正在進行，以評估此種療法的安全性和有效性。因此，聯(lián)合使用靶向MUC1和其他靶點的CAR-T可能協(xié)同作用于肺癌的療效，但聯(lián)合靶點的選擇和治療方案的安全性還需更多的臨床實驗進行研究和完善。

2.4 黑色素瘤抗原（melanoma antigen,MAGE） MAGE家族屬于腫瘤-睪丸抗原（cancer testis antigen,CTA）中的1個亞家族，其中MAGE-A1是細胞表面抗原，由主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）分子呈遞，介導黑色素瘤細胞的細胞毒性T細胞識別[23-24]。Fanipakdel等[25]對101例肺癌患者的樣本進行了橫斷面研究，發(fā)現(xiàn)MAGE-A1在肺腺癌中更常見，可能為潛在的癌癥生物標志物。Mao等[26]設計了一種新型MAGE-A1-CAR-T（mCAR-T），這種mCART對體內外所有MAGE-A1陽性的肺腺癌細胞系、腫瘤模型均有顯著抑瘤效果。目前，華盛頓大學癌癥協(xié)會進行靶向MAGE-A1的CAR-T的Ⅰ期臨床試驗（NCT04639245）正在招募中。針對靶向MAGE-A4、MAGE-A3/A6、MAGE-A10的CAR-T對肺癌等實體瘤的療效與安全性的臨床試驗也正在進行（NCT02592577、NCT05129280、NCT03139370）。

隨著越來越多的分化抗原被發(fā)現(xiàn)在肺癌組織中高度表達，靶向對應抗原的CAR-T也被設計出來，如CD56-CAR-T[27]、 CD47-CAR-T[9]、 B7-H3-CAR-T[28]、CD126-CAR-T[10]等已被證明能在肺癌模型中殺傷和抑制癌細胞，其中利用B7-H3-CAR-T免疫治療癌癥的臨床試驗（NCT03198052）也正在進行中。雖然一些T細胞參數(shù)仍然可以優(yōu)化，但成功使用CAR-T治療實體腫瘤已被證明是具有挑戰(zhàn)性的，腫瘤內在機制和相關的腫瘤微環(huán)境在抑制抗腫瘤反應中同樣具有重要作用。

3 CAR-T治療肺癌面臨的問題及展望

3.1 突破腫瘤微環(huán)境的干擾 在治療中，相較于血液系統(tǒng)腫瘤，實體腫瘤還存在腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment,TME）和細胞外機制（extracellular matrix,ECM）對CAR-T的干擾。隨著腫瘤進展，TME會產生相應變化，如產生免疫檢查點抑制CAR-T，導致療效不佳，甚至出現(xiàn)嚴重反應。而免疫檢查點抑制微環(huán)境是引起T細胞耗竭和影響CAR-T免疫應答能力的重要因素。

PD-1和細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4,CTLA-4）是TME中有效抑制T細胞功能的免疫檢查點。PD-1是免疫反應的協(xié)同抑制因子，可以與程序性死亡配體-1（programmed cell death protein 1,PD-L1）結合減少PD-1陽性細胞的增殖，抑制它們分泌細胞因子并誘導細胞凋亡[29]。Takada等[30]證明PD-L1與肺癌中的男性、吸煙、癌癥晚期、血管浸潤、鱗狀細胞癌組織學和野生型EGFR基因突變呈正相關?？筆D1/PD-L1單克隆抗體通過阻斷PD1/PD-L1信號通路，可增強細胞毒性T細胞的殺傷作用[31]。有研究者通過基因編輯設計了1個共表達PD-1的CAR-T，通過產生PD-1抗體，來輔助化療后獲得完全緩解的患者，增強療效[32]。Pai等[33]開發(fā)了一種針對檢查點CTLA-4的抗CTLA-4雙可變域免疫球蛋白，可消耗腫瘤浸潤性而非組織駐留性的調節(jié)性T細胞，在保證抗腫瘤功效的同時，降低腫瘤患者的免疫相關不良事件。因此，選擇合適的免疫檢查點，構建共表達這些免疫相關因子的CAR-T，可很大程度改善TME對CAR-T的干擾。

3.2 細胞因子釋放綜合征（cytokine release syndrome,CRS） CAR-T免疫療法雖然有顯著的靶向優(yōu)勢，但由于CAR-T作用的持久性和無法輕易逆轉而產生的免疫激活，會導致急性全身性炎癥反應，甚至危及生命。CRS可以是輕度的，也可以進展為嚴重低血壓、毛細血管滲漏和缺氧，涉及多個臟器功能障礙等重度疾病。輕度CRS患者可對癥治療，對于重度患者，研究表明，托珠單抗是治療嚴重或危及生命的CRS的有效方法，可迅速緩解癥狀[34]，早期使用還可降低CRS的發(fā)生率。Hong等[35]對81例患者進行了2種不同治療途徑以評估可能誘發(fā)CRS的臨床特征，研究發(fā)現(xiàn)CAR-T組的細胞因子，如IL-6（由激活的巨噬細胞和單核細胞釋放）、IL-2、IL-10和γ干擾素IFN-γ的增加更為顯著，提示IL-6可能是CRS的主要驅動因素；控制IL-6等細胞因子的產生和釋放，可能會降低CRS的發(fā)生率。研究者同樣也觀察到血清粒細胞巨噬細胞刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GMCSF）水平、鐵蛋白、CRP指標等異常，但目前還未有早期檢測指標來預測患者是否會發(fā)生嚴重的CRS，這也是今后深入研究的方向。

為解決CAR-T免疫療法造成的不良事件，提高安全性，研究者運用基因編輯技術對CAR結構進行優(yōu)化改良。Mishra等[10]發(fā)現(xiàn)靶向CD126的CAR-T與可溶性白細胞介素 6受體（soluble interleukin 6 receptor，sIL-6R）的結合可以減輕細胞因子釋放綜合征，表達CD126的CAR-T為許多毒性風險低的腫瘤提供了新的治療靶點。Chu等[36]使用慢病毒轉導產生抗異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate,FITC）的 CAR-T，在體外，抗FITC-CAR-T的選擇性激活和增殖嚴格依賴于葉酸-FITC和葉酸受體表達靶細胞的共存，并且可通過葉酸-FITC開關進行劑量滴定，有效控制CART治療過程中機體產生的過度免疫，提高CAR-T的反應性和安全性。

綜上所述，CAR-T免疫療法已進入飛速發(fā)展階段，但在實體瘤方面進展緩慢。肺癌的靶點如EGFR、MSLN、MUC1、MAGE等被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，但大部分停留在基礎研究階段。T細胞、腫瘤細胞和腫瘤微環(huán)境間存在相互作用，可誘導免疫抑制，最終抑制抗腫瘤反應。而CAR-T脫靶所產生的毒性，也是如今此種免疫療法安全性問題的關注重點。改進給藥方式、尋找更加準確優(yōu)質的靶點、利用基因工程優(yōu)化CAR-T的結構、確定CRS的預測因素等可能有助于解決這些問題。有理由相信，CAR-T免疫療法將會給廣大的肺癌患者帶來生存上的獲益。