陳彬羽 沈凱譽(yù) 高文倉

免疫療法被認(rèn)為是21世紀(jì)腫瘤學(xué)治療領(lǐng)域最重要的發(fā)現(xiàn)，2018年度諾貝爾生理或醫(yī)學(xué)獎頒給了因發(fā)現(xiàn)腫瘤負(fù)性免疫調(diào)節(jié)抑制治療方法的2位科學(xué)家，使得免疫療法成為當(dāng)前腫瘤學(xué)最活躍的研究領(lǐng)域。嵌合抗原受體 T細(xì)胞（chimeric antigen receptor T cell,CAR-T）免疫療法作為腫瘤免疫治療的重要組成部分，主要用于血液腫瘤，但用于實(shí)體性腫瘤，尤其是肺癌，目前還在探索階段。為此，本文對目前CAR-T免疫療法在肺癌中的應(yīng)用研究進(jìn)展作一綜述，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究及臨床研究提供參考依據(jù)。

1 CAR-T的結(jié)構(gòu)和功能

CAR-T免疫療法通過基因工程技術(shù)將靶向腫瘤抗原的抗原嵌合受體（chimeric antigen receptor,CAR）引入到自體或異體T細(xì)胞內(nèi)，使T細(xì)胞表達(dá)靶向腫瘤抗原的CAR，從而特異性識別腫瘤抗原，清除癌細(xì)胞，達(dá)到臨床緩解甚至根治腫瘤的目的，是一種過繼性免疫治療方法。CAR由細(xì)胞外抗原結(jié)合區(qū)、鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)和細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)4部分組成[1]（圖1），起著識別腫瘤相關(guān)抗原、細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、活化T細(xì)胞的作用[2-3]（圖2）。CAR-T被廣泛用于血液系統(tǒng)腫瘤的治療。如針對CD19靶點(diǎn)的CAR-T可以顯著緩解甚至治愈易復(fù)發(fā)性和難治性B淋巴細(xì)胞腫瘤，臨床數(shù)據(jù)顯示完全緩解率達(dá)68%～93%[4]。在CD19表達(dá)較低的急性B淋巴細(xì)胞白血病及非霍奇金淋巴瘤則較常表達(dá)CD20[5]、CD22[6]等靶點(diǎn)，這種同時靶向雙靶點(diǎn)的雙特異性CAR-T細(xì)胞的出現(xiàn)，克服了單靶點(diǎn)治療的局限性[7]。隨著研究的進(jìn)展，許多其他的作用靶點(diǎn)也先后被發(fā)現(xiàn)，如 CD83[8]、CD47[9]、CD126[10]等。

圖1 CAR結(jié)構(gòu)

圖2 CAR功能

2 CAR-T治療肺癌的靶點(diǎn)選擇

CAR-T治療肺癌的研究仍處于早期探索階段，根據(jù)不斷發(fā)現(xiàn)的特異性靶點(diǎn)調(diào)整CAR-T結(jié)構(gòu)，現(xiàn)已取得了一些進(jìn)展。臨床試驗(yàn)中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）等實(shí)體瘤的靶向抗原見表1。

表1 臨床試驗(yàn)中NSCLC等實(shí)體瘤的靶向抗原

2.1 表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR） EGFR是一種糖蛋白受體，活化的EGFR可通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)刺激磷脂酰肌醇激酶-AKT-雷帕霉素靶蛋白-（phosphatidylinositide-AKT-mammalian target of rapamycin,PI3K-AKT-mTOR）、信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白（signal transducer and activator of transcription,STAT）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）等通路，最終導(dǎo)致細(xì)胞增殖和癌變[11]。在NSCLC中，大多數(shù)的EGFR突變與腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移有關(guān)[12]，目前除可用EGFR-TKI酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor,TKI）方案治療外[13]，也可以用以EGFR為靶點(diǎn)的CAR-T浸潤腫瘤組織。2017年寧波腫瘤醫(yī)院的一項(xiàng)Ⅰ期臨床試驗(yàn)（NCT03182816）對9例晚期復(fù)發(fā)/難治性EGFR陽性NSCLC患者輸注CAR-T后，6例患者病情穩(wěn)定，2例患者病情惡化，1例患者表現(xiàn)出部分反應(yīng)并持續(xù)了13個月以上。該研究評估了此療法具可行性和安全性[14]。此外有研究發(fā)現(xiàn)：NSCLC患者腫瘤部位趨化因子CXC配體13[chemokine（C-X-C motif）ligand 13,CXCL13]高表達(dá)，可與T細(xì)胞上表達(dá)的趨化因子CXC受體5（C-X-C chemokine receptor type 5,CXCR5）結(jié)合。通過設(shè)計表達(dá)EGFR和CXCR5的CAR-T，證明EGFR-CXCR5-CART具有與EGFR-CAR-T相似的殺傷活性，且添加CXCR5可促進(jìn)T細(xì)胞遷移，為NSCLC患者的治療提供了新途徑[15]。因此，抗EGFR-CAR-T治療EGFR陽性肺癌患者是有一定療效的，但其安全性和治療效果仍需經(jīng)過更多的臨床研究來評估。

2.2 間皮素（mesothelin,MSLN） MSLN是一種細(xì)胞表面糖蛋白，在正常組織中低表達(dá)，在大多數(shù)卵巢癌、胰腺癌、肺癌及惡性間皮瘤等惡性腫瘤中過度表達(dá)[16-17]，是一種較為理想的CAR-T治療靶點(diǎn)。多項(xiàng)臨床前和臨床研究發(fā)現(xiàn)：MSLN參與腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化，并與腫瘤的侵襲性有明確的關(guān)聯(lián)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞侵襲局部組織并最終轉(zhuǎn)移[18]。Zhao等[19]設(shè)計了靶向MSLN的第3代CAR-T（在細(xì)胞膜上表達(dá)M28z10T蛋白），表達(dá)M28z10的T細(xì)胞對MSLN陽性肺癌細(xì)胞株的抗腫瘤作用增強(qiáng)并延長T細(xì)胞的作用時間，在肺癌患者來源的異種移植物中顯示出較強(qiáng)的抗腫瘤活性。中山大學(xué)第一附屬醫(yī)院2017年注冊的一項(xiàng)Ⅰ期臨床試驗(yàn)（NCT03198546）將可分泌人類IL-7和趨化因子配體19（chemokine ligand 19,CCL19）（簡稱7×19）的CART注入表達(dá)MSLN的晚期實(shí)體瘤患者血液中，其中1例患者在抗MSLN-（7×19）-CAR-T治療靜脈輸注后的第240天腫瘤幾乎完全消失[20]。美國國立衛(wèi)生研究院臨床中心（NCT01583686）靶向MSLN的CAR-T治療肺癌轉(zhuǎn)移后腫瘤，15例參與研究，發(fā)生貧血1例，淋巴細(xì)胞計數(shù)減少2例，PLT減少1例，可見MSLN-CAR-T免疫療法的安全性有待提高，此試驗(yàn)也因進(jìn)展緩慢于2019年終止。近年來，研究者利用基因工程對CAR-T的結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化，如上海瑞金醫(yī)院進(jìn)行的mRNA工程化MSLN-CAR-T的臨床試驗(yàn)（NCT04981691）、美國紀(jì)念斯隆-凱特琳癌癥中心進(jìn)行的含抗程序性細(xì)胞死亡蛋白1成分的MSLN-CAR-T的臨床試驗(yàn)（NCT04577326）等正在招聘中。

2.3 黏蛋白（mucoprotein,MUC1） MUC1是一種高分子量（＞200 kD）糖蛋白，通常在腫瘤組織中高表達(dá)，正常組織中低表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)：MUC1在肺癌中高表達(dá)，且在多個肺癌組織中被發(fā)現(xiàn)異常糖基化，幫助癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移擴(kuò)散，并與NSCLC患者較差的總生存率相關(guān)[21]。中山大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了靶向包括MUC1在內(nèi)的多種第3代CAR-T，其抗癌功能已通過多種體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，正在招募個體，就MUC1-CAR-T免疫療法對晚期難治性實(shí)體瘤患者的安全性、耐受性和初步療效首先進(jìn)行測試（NCT03198052），將 MUN1聯(lián)合其他靶點(diǎn)共同治療肺癌。如Wei等[22]設(shè)計了前列腺干細(xì)胞抗原（prostate stem cell antigen,PSCA）和MUC1雙重定向的CAR-T，可以有效抑制異種移植小鼠的NSCLC腫瘤生長。此外，一項(xiàng)使用MUC1-CAR-T聯(lián)合敲除程序性死亡因子-1（programmed death 1,PD-1）治療晚期NSCLC的Ⅰ/Ⅱ期臨床研究（NCT03525782）正在進(jìn)行，以評估此種療法的安全性和有效性。因此，聯(lián)合使用靶向MUC1和其他靶點(diǎn)的CAR-T可能協(xié)同作用于肺癌的療效，但聯(lián)合靶點(diǎn)的選擇和治療方案的安全性還需更多的臨床實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究和完善。

2.4 黑色素瘤抗原（melanoma antigen,MAGE） MAGE家族屬于腫瘤-睪丸抗原（cancer testis antigen,CTA）中的1個亞家族，其中MAGE-A1是細(xì)胞表面抗原，由主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）分子呈遞，介導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性T細(xì)胞識別[23-24]。Fanipakdel等[25]對101例肺癌患者的樣本進(jìn)行了橫斷面研究，發(fā)現(xiàn)MAGE-A1在肺腺癌中更常見，可能為潛在的癌癥生物標(biāo)志物。Mao等[26]設(shè)計了一種新型MAGE-A1-CAR-T（mCAR-T），這種mCART對體內(nèi)外所有MAGE-A1陽性的肺腺癌細(xì)胞系、腫瘤模型均有顯著抑瘤效果。目前，華盛頓大學(xué)癌癥協(xié)會進(jìn)行靶向MAGE-A1的CAR-T的Ⅰ期臨床試驗(yàn)（NCT04639245）正在招募中。針對靶向MAGE-A4、MAGE-A3/A6、MAGE-A10的CAR-T對肺癌等實(shí)體瘤的療效與安全性的臨床試驗(yàn)也正在進(jìn)行（NCT02592577、NCT05129280、NCT03139370）。

隨著越來越多的分化抗原被發(fā)現(xiàn)在肺癌組織中高度表達(dá)，靶向?qū)?yīng)抗原的CAR-T也被設(shè)計出來，如CD56-CAR-T[27]、 CD47-CAR-T[9]、 B7-H3-CAR-T[28]、CD126-CAR-T[10]等已被證明能在肺癌模型中殺傷和抑制癌細(xì)胞，其中利用B7-H3-CAR-T免疫治療癌癥的臨床試驗(yàn)（NCT03198052）也正在進(jìn)行中。雖然一些T細(xì)胞參數(shù)仍然可以優(yōu)化，但成功使用CAR-T治療實(shí)體腫瘤已被證明是具有挑戰(zhàn)性的，腫瘤內(nèi)在機(jī)制和相關(guān)的腫瘤微環(huán)境在抑制抗腫瘤反應(yīng)中同樣具有重要作用。

3 CAR-T治療肺癌面臨的問題及展望

3.1 突破腫瘤微環(huán)境的干擾 在治療中，相較于血液系統(tǒng)腫瘤，實(shí)體腫瘤還存在腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment,TME）和細(xì)胞外機(jī)制（extracellular matrix,ECM）對CAR-T的干擾。隨著腫瘤進(jìn)展，TME會產(chǎn)生相應(yīng)變化，如產(chǎn)生免疫檢查點(diǎn)抑制CAR-T，導(dǎo)致療效不佳，甚至出現(xiàn)嚴(yán)重反應(yīng)。而免疫檢查點(diǎn)抑制微環(huán)境是引起T細(xì)胞耗竭和影響CAR-T免疫應(yīng)答能力的重要因素。

PD-1和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4,CTLA-4）是TME中有效抑制T細(xì)胞功能的免疫檢查點(diǎn)。PD-1是免疫反應(yīng)的協(xié)同抑制因子，可以與程序性死亡配體-1（programmed cell death protein 1,PD-L1）結(jié)合減少PD-1陽性細(xì)胞的增殖，抑制它們分泌細(xì)胞因子并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[29]。Takada等[30]證明PD-L1與肺癌中的男性、吸煙、癌癥晚期、血管浸潤、鱗狀細(xì)胞癌組織學(xué)和野生型EGFR基因突變呈正相關(guān)。抗PD1/PD-L1單克隆抗體通過阻斷PD1/PD-L1信號通路，可增強(qiáng)細(xì)胞毒性T細(xì)胞的殺傷作用[31]。有研究者通過基因編輯設(shè)計了1個共表達(dá)PD-1的CAR-T，通過產(chǎn)生PD-1抗體，來輔助化療后獲得完全緩解的患者，增強(qiáng)療效[32]。Pai等[33]開發(fā)了一種針對檢查點(diǎn)CTLA-4的抗CTLA-4雙可變域免疫球蛋白，可消耗腫瘤浸潤性而非組織駐留性的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，在保證抗腫瘤功效的同時，降低腫瘤患者的免疫相關(guān)不良事件。因此，選擇合適的免疫檢查點(diǎn)，構(gòu)建共表達(dá)這些免疫相關(guān)因子的CAR-T，可很大程度改善TME對CAR-T的干擾。

3.2 細(xì)胞因子釋放綜合征（cytokine release syndrome,CRS） CAR-T免疫療法雖然有顯著的靶向優(yōu)勢，但由于CAR-T作用的持久性和無法輕易逆轉(zhuǎn)而產(chǎn)生的免疫激活，會導(dǎo)致急性全身性炎癥反應(yīng)，甚至危及生命。CRS可以是輕度的，也可以進(jìn)展為嚴(yán)重低血壓、毛細(xì)血管滲漏和缺氧，涉及多個臟器功能障礙等重度疾病。輕度CRS患者可對癥治療，對于重度患者，研究表明，托珠單抗是治療嚴(yán)重或危及生命的CRS的有效方法，可迅速緩解癥狀[34]，早期使用還可降低CRS的發(fā)生率。Hong等[35]對81例患者進(jìn)行了2種不同治療途徑以評估可能誘發(fā)CRS的臨床特征，研究發(fā)現(xiàn)CAR-T組的細(xì)胞因子，如IL-6（由激活的巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞釋放）、IL-2、IL-10和γ干擾素IFN-γ的增加更為顯著，提示IL-6可能是CRS的主要驅(qū)動因素；控制IL-6等細(xì)胞因子的產(chǎn)生和釋放，可能會降低CRS的發(fā)生率。研究者同樣也觀察到血清粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GMCSF）水平、鐵蛋白、CRP指標(biāo)等異常，但目前還未有早期檢測指標(biāo)來預(yù)測患者是否會發(fā)生嚴(yán)重的CRS，這也是今后深入研究的方向。

為解決CAR-T免疫療法造成的不良事件，提高安全性，研究者運(yùn)用基因編輯技術(shù)對CAR結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化改良。Mishra等[10]發(fā)現(xiàn)靶向CD126的CAR-T與可溶性白細(xì)胞介素 6受體（soluble interleukin 6 receptor，sIL-6R）的結(jié)合可以減輕細(xì)胞因子釋放綜合征，表達(dá)CD126的CAR-T為許多毒性風(fēng)險低的腫瘤提供了新的治療靶點(diǎn)。Chu等[36]使用慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生抗異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate,FITC）的 CAR-T，在體外，抗FITC-CAR-T的選擇性激活和增殖嚴(yán)格依賴于葉酸-FITC和葉酸受體表達(dá)靶細(xì)胞的共存，并且可通過葉酸-FITC開關(guān)進(jìn)行劑量滴定，有效控制CART治療過程中機(jī)體產(chǎn)生的過度免疫，提高CAR-T的反應(yīng)性和安全性。

綜上所述，CAR-T免疫療法已進(jìn)入飛速發(fā)展階段，但在實(shí)體瘤方面進(jìn)展緩慢。肺癌的靶點(diǎn)如EGFR、MSLN、MUC1、MAGE等被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，但大部分停留在基礎(chǔ)研究階段。T細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境間存在相互作用，可誘導(dǎo)免疫抑制，最終抑制抗腫瘤反應(yīng)。而CAR-T脫靶所產(chǎn)生的毒性，也是如今此種免疫療法安全性問題的關(guān)注重點(diǎn)。改進(jìn)給藥方式、尋找更加準(zhǔn)確優(yōu)質(zhì)的靶點(diǎn)、利用基因工程優(yōu)化CAR-T的結(jié)構(gòu)、確定CRS的預(yù)測因素等可能有助于解決這些問題。有理由相信，CAR-T免疫療法將會給廣大的肺癌患者帶來生存上的獲益。