賀海斌 張智勇 俞仲輝

胃癌是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，具有惡性程度高、發(fā)病率高及死亡率高等特點(diǎn)[1-2]。盡管近年來(lái)胃癌的診療水平已經(jīng)有了大幅提升，但是現(xiàn)階段胃癌患者的預(yù)后仍然不容樂(lè)觀[3-4]。近年來(lái)，胃癌基因靶向治療研究為胃癌患者帶來(lái)了新的曙光，其中長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA,lncRNA）是研究熱點(diǎn)之一[5-6]。lncRNA是一類長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸且不具有蛋白編碼能力的單鏈RNA[6]。研究表明，異常表達(dá)的lncRNA參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展[7]。如lncRNA NKX2-1-AS1在胃癌中的表達(dá)顯著上調(diào)，且NKX2-1-AS1通過(guò)激活SERPINE1/VEGFR-2通路促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移以及新生血管的形成[8]；lncRNA SNHG11通過(guò)激活Wnt/β-catenin通路促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和上皮間質(zhì)化[9]；lncRNA CCDC144NLAS1通過(guò)靶向作用于miR-143-3p/MAP3K7通路促進(jìn)胃癌發(fā)生、發(fā)展[10]。而值得注意的是，LINC00315為一條長(zhǎng)度為2 323 bp的lncRNA，基因位于21q22.3。研究發(fā)現(xiàn)：在乳腺癌患者中，LINC00315的拷貝數(shù)改變與其臨床特征相關(guān)[11]；LINC00315在卵巢癌化療耐藥性中起著重要作用[12]?；谶@些，本研究分析了LINC00315在胃癌中的表達(dá)情況，旨在探討其與胃癌患者臨床病理特征、預(yù)后的關(guān)系及其對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 胃癌患者和組織標(biāo)本 選取2018年1月1日—2019年12月31日在寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院接受手術(shù)治療并經(jīng)術(shù)后病理診斷確診的胃癌患者75例，收集每例患者的胃癌組織和對(duì)應(yīng)的癌旁組織?；颊咧心?9例，女26例；年齡26～78歲，中位年齡59歲。所有患者術(shù)前均未接受放療、化療等其他輔助治療。所有獲得的新鮮組織取得后均液氮冷凍，然后長(zhǎng)期保存在-80°C冰箱。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑 FBS和DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScript RT Reagent Kit）購(gòu)自日本TaKaRa公司；實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒（SYBR@Green Supermix）購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；LINC00315特異性引物（HQP006418）和內(nèi)參GAPDH引物（HQP006940）購(gòu)自廣州易錦生物技術(shù)有限公司；LINC00315小干擾RNA（siRNA）及siRNA陰性對(duì)照合成于上海Gene Pharma公司；MTT試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物科技發(fā)展有限公司；5-乙炔基-2-脫氧尿嘧啶（5-Ethynyl-2′-deoxyuridine,EdU）檢測(cè)試劑盒購(gòu)于廣州銳博生物技術(shù)有限公司；流式細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自上海碩嘉生物科技有限公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine?3000購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 胃癌細(xì)胞系NCI-N87、SGC-7901、AGS、HCG27和正常胃黏膜細(xì)胞GES-1均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。細(xì)胞置于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含10%FBS、1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液。細(xì)胞轉(zhuǎn)染按Lipofectamine?3000說(shuō)明書所示步驟進(jìn)行。先將待轉(zhuǎn)染細(xì)胞消化、離心、重懸、計(jì)數(shù)，然后將適宜數(shù)量的細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞融合度達(dá)到75%左右時(shí)，分別將LINC00315 siRNA、對(duì)照siRNA應(yīng)用Lipofectamine?3000對(duì)HCG27細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染（分別為干擾組、對(duì)照組），48 h后應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)其轉(zhuǎn)染效率，并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 胃癌組織、癌旁組織及胃癌細(xì)胞、胃黏膜細(xì)胞LINC00315表達(dá)水平檢測(cè) 采用qRT-PCR法。應(yīng)用Trizol提取組織和細(xì)胞總RNA，采用NanoDrop微量紫外分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）測(cè)定RNA的純度及濃度。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將1 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒檢測(cè)LINC000315的表達(dá)水平，GAPDH為內(nèi)參，每孔重復(fù)3次，上述操作均參照試劑盒說(shuō)明書上的步驟進(jìn)行，結(jié)果采用 2-ΔΔCt法進(jìn)行分析。

1.3.3 胃癌細(xì)胞活力檢測(cè) 采用MTT實(shí)驗(yàn)。將干擾組和對(duì)照組細(xì)胞接種于96孔板（1.5×104/孔），每組重復(fù)3個(gè)孔，培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入20 μl MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h后每孔加入150 μl的DMSO終止反應(yīng)。在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀上讀取490 nm處的光密度（OD）。每組的3個(gè)孔取平均值，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.3.4 胃癌細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 采用EdU細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。將干擾組和對(duì)照組細(xì)胞接種于96孔板（1×105/孔），每組重復(fù)3個(gè)孔，培養(yǎng)48 h后每孔加入100 μl EdU（50 μmol/L）培養(yǎng)基孵育2 h后棄去；PBS清洗2次后每孔加入50 μl細(xì)胞固定液，室溫孵育30 min后棄去。加入 50 μl甘氨酸（2 mg/ml），搖床孵育5 min后棄去；PBS清洗后加入 100 μl Triton X-100（0.5%）孵育10 min；加入 100 μl Apollo?染色反應(yīng)液，避光室溫孵育30 min后，加入100 μl聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）（0.5%）清洗2～3次；加入100 μl Hoechst 33342反應(yīng)液，避光室溫孵育30 min；100 μl PBS清洗1～3次后觀察、拍照。

1.3.5 胃癌細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)。細(xì)胞凋亡檢測(cè)按照細(xì)胞凋亡試劑盒說(shuō)明書步驟進(jìn)行。轉(zhuǎn)染48 h后，收集干擾組和對(duì)照組細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌后離心，棄掉上清液。用300 μl結(jié)合緩沖液重懸，然后分別加入5 μl藻紅蛋白標(biāo)記的重組人附件素V（PE Annexin V）試劑和 5 μl 7-氨基放線菌素 D（7-AAD）試劑，并置于避光條件下室溫孵育15 min。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，細(xì)胞凋亡擬合軟件分析數(shù)據(jù)。

1.4 觀察指標(biāo) （1）比較胃癌組織與癌旁組織LINC00315表達(dá)水平；（2）比較胃癌細(xì)胞、胃黏膜細(xì)胞LINC00315表達(dá)水平；（3）根據(jù)75例胃癌組織中LINC00315的中位表達(dá)水平，將患者分為L(zhǎng)INC00315高表達(dá)患者和低表達(dá)患者，分析LINC00315表達(dá)水平與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系；（4）應(yīng)用來(lái)自公共數(shù)據(jù)庫(kù) GEPIA（http://gepia.cancer-pku.cn）的TCGA數(shù)據(jù)分析LINC00315的表達(dá)水平對(duì)胃癌患者預(yù)后的影響；（5）比較干擾組和對(duì)照組細(xì)胞LINC00315表達(dá)水平、細(xì)胞活力、增殖能力；（6）比較干擾組和對(duì)照組細(xì)胞凋亡率。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0和Graphpad Prism 6統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，胃癌組織與癌旁組織比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)和構(gòu)成比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，生存曲線的比較采用log-rank檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織與癌旁組織LINC00315表達(dá)水平比較胃癌組織LINC00315表達(dá)水平高于癌旁組織（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 胃癌組織與癌旁組織LINC00315表達(dá)水平比較

2.2 胃癌細(xì)胞、胃黏膜細(xì)胞LINC00315表達(dá)水平比較胃癌 NCI-N87、SGC-7901、AGS、HCG27 細(xì) 胞LINC00315表達(dá)水平均高于胃黏膜GES-1細(xì)胞（均P＜0.05），見(jiàn)圖2。

圖2 胃癌細(xì)胞、胃黏膜細(xì)胞LINC00315表達(dá)水平比較

2.3 LINC00315表達(dá)水平與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系分析 根據(jù)75例胃癌組織中LINC00315的中位表達(dá)水平（4.22），將患者分為L(zhǎng)INC00315高表達(dá)患者39例和低表達(dá)患者36例。分析結(jié)果顯示：LINC00315表達(dá)水平與患者腫瘤大小及TNM分期有關(guān)（均P＜0.05），高表達(dá)患者腫瘤較大、TNM分期較晚；而與年齡、性別、分化程度、手術(shù)方式及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素?zé)o關(guān)（均P＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 LINC00315表達(dá)水平與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系分析[例（%）]

2.4 LINC00315表達(dá)水平對(duì)胃癌患者預(yù)后的影響TCGA數(shù)據(jù)分析LINC00315的表達(dá)水平對(duì)胃癌患者預(yù)后的影響，結(jié)果顯示：LINC00315高表達(dá)的胃癌患者總生存率、無(wú)病生存率均低于LINC00315低表達(dá)的胃癌患者（均P＜0.05），見(jiàn)圖3。

圖3 LINC00315高表達(dá)與低表達(dá)胃癌患者總生存曲線和無(wú)病生存曲線比較（a：總生存曲線；b：無(wú)病生存曲線）

2.5 干擾組和對(duì)照組細(xì)胞LINC00315表達(dá)水平、細(xì)胞活力、增殖能力比較 干擾組細(xì)胞LINC00315表達(dá)水平低于對(duì)照組（P＜0.05），見(jiàn)圖4。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：培養(yǎng)24、48、72 h后，干擾組細(xì)胞活力較對(duì)照組減弱（均P＜0.05），即敲低LINC00315的表達(dá)導(dǎo)致HCG27細(xì)胞活力明顯減弱，見(jiàn)圖5。EdU細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：干擾組細(xì)胞增殖能力較對(duì)照組減弱（均P＜0.05），即敲低LINC00315的表達(dá)導(dǎo)致HCG27細(xì)胞增殖能力明顯減弱，見(jiàn)圖6。

圖4 干擾組和對(duì)照組細(xì)胞LINC00315表達(dá)水平比較

圖5 干擾組和對(duì)照組細(xì)胞活力比較

圖6 干擾組和對(duì)照組EdU陽(yáng)性細(xì)胞率比較）

2.6 干擾組和對(duì)照組細(xì)胞凋亡率比較 干擾組細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照組（P＜0.05），即敲低LINC00315的表達(dá)導(dǎo)致HCG27細(xì)胞的凋亡率明顯升高，見(jiàn)圖7。

圖7 干擾組和對(duì)照組細(xì)胞凋亡率比較

3 討論

胃癌是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，具有較高的發(fā)生率和致死率。一直以來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者都在積極致力于研究如何提升胃癌的診療水平，而近年來(lái)以lncRNA為代表的胃癌靶向治療是研究熱點(diǎn)之一[13-14]。既往認(rèn)為，lncRNA是基因組轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的“噪音”，不具有生物學(xué)功能。而隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)lncRNA能夠參與細(xì)胞的X染色體沉默、基因組印記、基因轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾等多種重要的調(diào)控過(guò)程[15-17]。而研究也表明，異常表達(dá)的lncRNA與包括胃癌在內(nèi)的腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[18-22]。例如，Song等[18]研究發(fā)現(xiàn)lncRNA TMEM92-AS1能夠通過(guò)與YBX1蛋白的結(jié)合介導(dǎo)CCL5對(duì)胃癌發(fā)生、發(fā)展的調(diào)節(jié)作用；Ma等[19]研究發(fā)現(xiàn)lncRNA NEAT1在胃癌細(xì)胞中可作為BRG1蛋白的“支架”，從而調(diào)控GADD45A的表達(dá)量進(jìn)而影響胃癌的發(fā)生、發(fā)展；此外，Ma等[20]研究發(fā)現(xiàn)EGR1介導(dǎo)的LINC01503可通過(guò)表觀調(diào)控DUSP5/CDKN1A的表達(dá)水平從而調(diào)控胃癌細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展。由此可見(jiàn)，lncRNA在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中起著極其重要的作用。然而，LINC00315在胃癌中的表達(dá)情況報(bào)道鮮見(jiàn)。

本研究發(fā)現(xiàn)：LINC00315在胃癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)均明顯上調(diào)，并且高表達(dá)的LINC00315與胃癌較大的腫瘤體積和較晚的TNM分期有關(guān)。此外，LINC00315高表達(dá)的胃癌患者的總生存率和無(wú)病生存率與低表達(dá)患者相比明顯降低。上述結(jié)果提示，LINC00315可能是胃癌的促癌基因，且對(duì)判斷胃癌的惡性程度及患者預(yù)后具有一定的臨床參考價(jià)值。

在細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)中，本研究發(fā)現(xiàn)敲低胃癌細(xì)胞中LINC00315表達(dá)后，胃癌細(xì)胞活力和增殖能力均被明顯抑制，此外，細(xì)胞的凋亡率明顯增加。上述結(jié)果表明，LINC00315能夠增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的增殖能力，并能抑制胃癌細(xì)胞的凋亡。這一結(jié)果與在臨床病理特征分析中的發(fā)現(xiàn)，即高表達(dá)的LINC00315與胃癌較大的腫瘤體積和較晚的TNM分期有關(guān)，是相符的。筆者推測(cè)LINC00315可能通過(guò)上調(diào)細(xì)胞內(nèi)CDK4、Cyclin D1蛋白表達(dá)，加速細(xì)胞周期進(jìn)展，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖。然而，LINC00315在胃癌細(xì)胞中的其他生物學(xué)作用、其上下游調(diào)控因子還有待進(jìn)一步探究。

綜上，LINC00315在胃癌中表達(dá)上調(diào)，其與胃癌的腫瘤大小、TNM分期以及患者的預(yù)后密切相關(guān)；高表達(dá)的LINC00315可以促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、抑制胃癌細(xì)胞的凋亡。