鐘立萍 謝旦立 樓永良

非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）是一種常見(jiàn)的慢性肝病，與肥胖、高脂血癥和代謝綜合征等疾病密切相關(guān)[1]，全球發(fā)病率約為25.2%[2]。非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis,NASH）是NAFLD嚴(yán)重病理類型之一，臨床資料顯示，多達(dá)1/3的NASH患者可能發(fā)展為晚期纖維化、肝硬化和肝細(xì)胞癌，需要進(jìn)行肝移植治療[3-4]。因此，闡明NASH炎癥進(jìn)展的潛在機(jī)制，對(duì)疾病研究及診療具有重要意義。本研究通過(guò)高脂飲食喂飼野生型C57BL/6小鼠和遺傳易感型肝特異性PTEN基因缺失（liver-specific PTEN deficiency,PtenCKO）小鼠構(gòu)建NAFLD模型，研究不同處理小鼠組織病理、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells,Tregs）的免疫調(diào)節(jié)作用和腸道菌群特征，以期為NASH診治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6周齡雄性C57BL/6野生型（wild type,WT）小鼠購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0005]，PtenCKO小鼠購(gòu)自南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所[許可證號(hào)：SCXK（蘇）2018-0008]，為C57BL/6背景，均由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)于SPF環(huán)境。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均通過(guò)溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批（批準(zhǔn)編號(hào)：2019-0266）。

1.1.2 主要試劑 IMDM細(xì)胞培養(yǎng)基、1000×β-mercaptoethanol購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；FBS購(gòu)自中國(guó)浙江天杭生物公司；4%多聚甲醛固定液（4%PFA）購(gòu)自中國(guó)北京索萊寶公司；冷凍包埋劑購(gòu)自日本SAKURA公司；Live/Dead可固定死細(xì)胞熒光抗體、eBioscience破膜試劑盒含固定/通透液、eBioscience Perm/Wash?洗滌緩沖液購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；ChamQ qPCR SYBR Green Master Mix購(gòu)自中國(guó)南京諾唯贊公司；Percoll細(xì)胞分離液購(gòu)自美國(guó)GE公司；流式熒光抗體：抗鼠-CD4-AF488、CD8-PE/Cy7、FoxP3-PE購(gòu)自美國(guó)Biolegend公司；鼠D-乳酸（D-Lactate,D-LA）ELISA試劑盒購(gòu)自中國(guó)上海源葉生物公司；Trizol RNA提取試劑盒、糞便基因組提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Omega Bio-Tek公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自中國(guó)大連TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物建模及標(biāo)本采集 實(shí)驗(yàn)小鼠分為PtenCKO高脂飲食組（PtenCKO HFD）、PtenCKO正常飲食組（PtenCKO NCD）、野生型高脂飲食組（WT HFD）和野生型正常飲食組（WT NCD），每組8只，給予相同量的標(biāo)準(zhǔn)飼料或60%高脂飼料（中國(guó)江蘇協(xié)同生物公司）。造模10周，期間小鼠自由飲食、飲水。

1.2.2 標(biāo)本采集 （1）糞便標(biāo)本采集：造模結(jié)束前2天采集4組小鼠糞便，采集后及時(shí)提取或立即-80℃凍存?zhèn)溆谩＃?）血漿標(biāo)本采集：實(shí)驗(yàn)前1天晚上小鼠禁食不禁水。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天稱取小鼠體質(zhì)量，異氟烷麻醉后眼球采血，收集于含有EDTA抗凝劑的離心管，提取血漿，-80℃凍存?zhèn)溆?。?）組織標(biāo)本采集：小鼠頸椎脫臼處死，手術(shù)剪剪取整個(gè)肝，記錄肝臟的一般情況，相機(jī)拍照。記錄肝濕質(zhì)量，計(jì)算肝重指數(shù)，肝重指數(shù)=肝濕質(zhì)量/體質(zhì)量×100%。剪取一部分肝左葉固定于4%PFA，剩余部分肝臟組織置于10%IMDM培養(yǎng)基中。根據(jù)解剖標(biāo)記（自回盲瓣近端5 cm處取材）剪取小鼠回腸組織，一部分回腸組織固定于4%PFA，剩余部分回腸組織-80℃凍存?zhèn)溆?。沿腸系膜收集腸系膜淋巴結(jié)并置于10%IMDM培養(yǎng)基中備用。

1.2.3 肝臟、回腸病理觀察 石蠟切片HE染色后，觀察肝細(xì)胞脂肪變、氣球樣變和小葉內(nèi)炎癥及小腸組織黏膜的結(jié)構(gòu)變化；冷凍切片油紅O染色后，觀察肝臟脂肪變。

1.2.4 回腸組織緊密連接蛋白mRNA轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)采用熒光定量PCR法。按照Trizol RNA提取試劑盒方法提取回腸組織總mRNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒方法逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）基因?yàn)閮?nèi)參。ZO-1 引物序列：F-5′-AGGACACCAAAGCATGTGAG-3′，R-5′-GGCATTCCTGCTGGTTACA-3′；Claudin-1：F-5′-TGCCCCAGTGGAAGATTTACT-3′，R-5′-CTTTGCGAAACGCAGGACAT-3′；GAPDH：F-5′-CGTGCCGCCTGGAGAAACCTG-3′，R-5′-AGAGTGGGAGTTGCTGTTGAAGTCG-3′。引物由中國(guó)上海桑尼生物科技有限公司合成。

1.2.5 腸道屏障指標(biāo)D-LA濃度檢測(cè) 采用ELISA法。按照鼠D-LA ELISA試劑盒方法檢測(cè)各組小鼠血漿D-LA濃度。

1.2.6 腸道菌群分析 按照糞便基因組提取試劑盒方法提取4組小鼠糞便樣本基因組DNA。用特異性引物擴(kuò)增16S rDNA的V3-V4區(qū)域并委托中國(guó)杭州晶佰生物科技有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序。引物由中國(guó)上海桑尼生物科技有限公司合成，引物序列：F-5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′，R-5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′。數(shù)據(jù)處理：（1）稀釋曲線分析。對(duì)所有樣本序列進(jìn)行隨機(jī)抽樣，以抽取到的序列數(shù)與它們所能代表的OTU數(shù)目構(gòu)建稀釋曲線，用于說(shuō)明樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)是否足以反映菌群的多樣性。（2）α多樣性分析。測(cè)定Chao1指數(shù)、PD Whole tree指數(shù)等豐度指數(shù)，值越大，表明豐度越高；測(cè)定Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)等多樣性指標(biāo)，值越大，表明多樣性越高。（3）β多樣性分析。進(jìn)行PCoA主坐標(biāo)分析。使用QIIME軟件制作PCoA圖表，選取貢獻(xiàn)率最大的主坐標(biāo)組合進(jìn)行作圖，通過(guò)測(cè)定坐標(biāo)軸中各樣本間距離分析菌群差異性。距離越近，表示菌群差異性較小，相反則差異性較大。（4）菌群組成分析。根據(jù)OTU分析結(jié)果，得到各樣品在各分類水平上（門、屬）的物種組成比例。（5）組間菌群差異分析。進(jìn)行物種LEfSe差異分析，以線性判別分析（linear discriminant analysis,LDA）效應(yīng)量來(lái)估算每個(gè)物種豐度對(duì)差異效果影響的大小。

1.2.7 單個(gè)核細(xì)胞分離與免疫細(xì)胞Tregs檢測(cè) （1）單個(gè)核細(xì)胞分離：采用密度梯度離心法，取新鮮肝參考文獻(xiàn)[5]方法分離肝臟單個(gè)核細(xì)胞。將腸系膜淋巴結(jié)研磨后過(guò)濾，離心（4 ℃，1 500 r/min，5 min）棄上清液，IMDM培養(yǎng)基重懸，分離得到腸系膜淋巴結(jié)（mesenteric lymph nodes，MLNs）單個(gè)核細(xì)胞懸液。（2）免疫細(xì)胞Tregs檢測(cè)：采用流式細(xì)胞術(shù)。根據(jù)牛鮑計(jì)數(shù)板細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，按1×106個(gè)/孔的細(xì)胞數(shù)在96孔尖底板中鋪板，棄上清液后染色；用流式染色緩沖液按1∶400配制流式熒光抗體（CD4-AF488、CD8-PE/Cy7、Live/Dead），50 μl/孔加至尖底板，避光染色20 min；加入200 μl/孔流式染色緩沖液終止染色，并用200 μl/孔流式染色緩沖液重復(fù)洗滌2次，用100 μl固定/通透液重懸，4℃避光破膜過(guò)夜；加入200 μl 1×eBioscience Perm/Wash?洗滌緩沖液終止，并重復(fù)洗滌2次；用洗滌緩沖液按1∶200配制流式熒光抗體（FoxP3-PE），50 μl/孔加至尖底板，冰上避光染色2 h，再重復(fù)洗滌2次。重懸后流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Graphpad Prism 7.0進(jìn)行圖形制作和分析。流式數(shù)據(jù)通過(guò)BD FACS AriaⅡ流式細(xì)胞儀采集，采用Flowjo V10軟件分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）；不符合正態(tài)分布的以M（P25，P75）表示，采用非參數(shù)檢驗(yàn)（Kruskal-Wallis）法進(jìn)行多重比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠肝臟外觀及組織病理學(xué)觀察 與其他3組肝臟相比，PtenCKO HFD組小鼠肝臟體積明顯增大，邊緣厚且鈍，顆粒粗糙，表面和切面有油膩感，色澤黃白色（圖1a，見(jiàn)插頁(yè)）。與正常飲食組相比，高脂飲食組小鼠肝濕質(zhì)量顯著增加（P＜0.05）（圖1b，見(jiàn)插頁(yè)），PtenCKO HFD組肝重指數(shù)高于其他3組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）（圖1c，見(jiàn)插頁(yè)）。病理染色顯示：高脂飲食組小鼠肝臟脂肪變的程度和炎性浸潤(rùn)程度均較正常飲食組增加，其中PtenCKO HFD組可見(jiàn)彌漫性、大顆粒狀紅色脂滴堆積，且部分融合呈片狀，匯管區(qū)清晰可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（圖1d，見(jiàn)插頁(yè)）。這些結(jié)果表明：高脂飲食明顯加快了PtenCKO小鼠肝損傷病程。

圖1 不同飲食對(duì)小鼠肝臟組織病理的影響（a：肝臟外觀；b：肝濕質(zhì)量；c：肝重指數(shù)；d：肝組織HE及油紅O染色，×20）

2.2 4組小鼠腸黏膜組織病理觀察及腸黏膜通透性指標(biāo)變化的分析 病理染色顯示：正常飲食組中，WT NCD組小腸黏膜結(jié)構(gòu)完整，絨毛表面細(xì)胞排列整齊、緊密，無(wú)充血、水腫改變；PtenCKO NCD組小腸黏膜結(jié)構(gòu)較為完整，但微絨毛表面細(xì)胞排列混亂，并伴有充血、水腫現(xiàn)象。高脂飲食組小鼠均有不同程度的小腸黏膜水腫，并伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，微絨毛間隙增寬，部分伴有微絨毛變短、斷裂并伴有充血、水腫現(xiàn)象（圖2a，見(jiàn)插頁(yè)）。定量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：與WT NCD組相比，WT HFD組回腸ZO-1和Claudin-1相對(duì)表達(dá)量均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），相比其他3組，PtenCKO HFD組ZO-1表達(dá)異常增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）（圖2b，見(jiàn)插頁(yè)）。與WT NCD組相比，其他3組小鼠D-LA濃度均有不同程度升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）（圖2c，見(jiàn)插頁(yè)）。這些結(jié)果表明：高脂飲食導(dǎo)致小鼠腸黏膜屏障受損并伴有腸組織炎癥。

圖2 4組小鼠腸黏膜組織病理及腸黏膜通透性指標(biāo)的變化（a：小腸組織HE染色，×20；b：緊密連接蛋白相對(duì)表達(dá)量；c：血漿D-LA濃度）

2.3 小鼠腸道菌群組成及多樣性的變化 稀釋曲線分析顯示：各組小鼠的稀釋性曲線逐漸趨向平坦，更多的序列數(shù)只會(huì)產(chǎn)生少量的OTU，表明本次測(cè)序基本能夠真實(shí)反映樣本中的微生物情況（圖3a，見(jiàn)插頁(yè)）。α多樣性分析顯示：正常飲食組腸道菌群的豐度和多樣性均高于高脂飲食組，其中，PtenCKO HFD組小鼠腸道菌群的豐度和多樣性均最低（圖3b，見(jiàn)插頁(yè)）。PCoA主坐標(biāo)分析顯示：高脂飲食組的WT和PtenCKO小鼠兩組間直線距離較近，菌群構(gòu)成較為相似；正常飲食組的WT和PtenCKO小鼠兩組間直線距離較遠(yuǎn)，菌群構(gòu)成存在差異性（圖3c，見(jiàn)插頁(yè)）。物種注釋和分析顯示：在門分類水平上，各組小鼠主要腸道菌均為擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門，其中擬桿菌門和厚壁菌門是各組小鼠的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌門（圖3d，見(jiàn)插頁(yè)）。在屬分類水平上，相比WT NCD組，WT HFD組和PtenCKO HFD組Bacteroides屬、Alloprevotella屬、Alistipes屬豐度增高，Barnesiella屬、Odoribacter屬豐度下降；WT NCD組Akkermansia屬豐度高于其他3組（圖3e，見(jiàn)插頁(yè)）。對(duì)腸道菌群的LEfSe分析顯示：PtenCKO HFD組與WT HFD組菌群構(gòu)成較為相似，PtenCKO NCD組和WT NCD組小鼠腸道菌群構(gòu)成不同；高脂飲食主要引起B(yǎng)acteroides屬、Parabacteoides屬、Enterococcus屬、Enterorhabdus屬、Desulfovibrionaceae屬、Escherichia屬和Escherichia-Shigella屬等腸道致病菌和條件致病菌豐度增加，而Lactobacillus屬、Butyricicoccus屬等腸道有益菌豐度降低（圖3f，見(jiàn)插頁(yè)）?？梢?jiàn)，飲食和遺傳缺陷對(duì)小鼠腸道菌群存在不同程度的影響，高脂飲食對(duì)腸道菌群的構(gòu)成影響更為顯著。

圖3 不同飲食對(duì)小鼠腸道菌群變化的影響（a：稀釋曲線圖；b：Chao1指數(shù)，PD Whole tree指數(shù)，Shannon指數(shù)，Simpson指數(shù)；c：PCoA主坐標(biāo)分析圖；d：門水平；e：屬水平；f：LEfSe分析圖）

2.4 小鼠肝臟、腸系膜淋巴結(jié)免疫細(xì)胞Tregs變化分析 經(jīng)過(guò)10周的高脂飲食，與WT NCD組相比，WT HFD組肝臟免疫細(xì)胞Tregs下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與PtenCKO NCD組相比，PtenCKO HFD組肝臟免疫細(xì)胞Tregs上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與WT小鼠比較，PtenCKO小鼠肝臟免疫細(xì)胞Tregs升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖4a，見(jiàn)插頁(yè)）。與其他3組相比，PtenCKO HFD組腸系膜淋巴結(jié)免疫細(xì)胞Tregs細(xì)胞比例上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）（圖4b，見(jiàn)插頁(yè)）。

圖4 不同飲食對(duì)小鼠肝臟和腸系膜淋巴結(jié)Tregs細(xì)胞變化的影響（a：肝臟Tregs細(xì)胞流式圖及百分比；b：腸系膜淋巴結(jié)Tregs細(xì)胞流式圖及百分比）

3 討論

NASH是NAFLD的進(jìn)行性表現(xiàn)，持續(xù)炎癥刺激使NASH向肝纖維化發(fā)展，是肝硬化及肝癌的重要危險(xiǎn)因素，目前尚未出臺(tái)有效的治療方案及藥物用于治療NASH[6]。研究顯示：患有肥胖相關(guān)的脂肪肝人群存在PTEN表達(dá)下降的現(xiàn)象[7]。PtenCKO小鼠在遺傳和基因表達(dá)上都是NASH研究較為理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型[8]。本研究對(duì)PtenCKO轉(zhuǎn)基因鼠肝臟進(jìn)行了病理染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：PtenCKO小鼠即使正常飲食也伴有典型的NASH表現(xiàn)，高脂飲食下，NASH癥狀加重，個(gè)別小鼠伴有輕度的纖維化。

NASH的發(fā)生、發(fā)展與免疫病理、腸道屏障受損及腸道菌群失調(diào)等因素密切相關(guān)[9]。本研究發(fā)現(xiàn)：高脂飲食組的小鼠腸組織發(fā)生不同程度的病理改變，D-LA升高，ZO-1、Claudin-1的相對(duì)表達(dá)量發(fā)生變化。Xu等[10]發(fā)現(xiàn)：WT小鼠在高脂飲食下，緊密連接蛋白ZO-1、Claudin-1的mRNA下降，提示腸黏膜屏障損傷；與本研究發(fā)現(xiàn)的高脂飲食下PtenCKO小鼠緊密連接蛋白ZO-1的mRNA表達(dá)水平異常升高的結(jié)果不一致，需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探討。也有研究顯示：ZO-1在肝癌患者中的表達(dá)水平較健康人群升高[11]，而PtenCKO小鼠最終將自發(fā)發(fā)展為肝癌[12]。D-LA是腸道細(xì)菌的代謝產(chǎn)物，當(dāng)腸道屏障受損而導(dǎo)致腸黏膜屏障通透性增加時(shí)，D-LA活性增高，提示腸道屏障完整性的缺失可能推動(dòng)了肝臟炎癥和NASH病程進(jìn)展。腸道菌群易受膳食影響。本研究發(fā)現(xiàn)：高脂飲食對(duì)腸道菌群影響顯著，小鼠腸道菌群豐度及多樣性均減少。LEfSe分析顯示：高脂飲食主要引起B(yǎng)acteroides屬、Parabacteoides屬、Enterococcus屬、Enterorhabdus屬、Desulfovibrionaceae屬、Escherichia屬和Escherichia-Shigella屬等腸道致病菌和條件致病菌豐度增加，而Lactobacillus屬、Butyricicoccus屬等腸道有益菌豐度降低。與WT小鼠相比，高脂飲食下PtenCKO小鼠Alloprevotella屬增加，Odoribacter屬降低。研究顯示：Prevotellacea 科[13]、Odoribacter屬[14]在NASH患者中豐度較低。Alloprevotella屬隸屬于Prevotellaceae科，Prevotellaceae科主要為琥珀酸產(chǎn)生菌，Odoribacter屬主要為琥珀酸消耗菌，均與腸道琥珀酸代謝相關(guān)；在體內(nèi)琥珀酸濃度受肥胖、糖耐量受損等影響，琥珀酸濃度失衡是機(jī)體缺氧和炎癥下局部應(yīng)激和免疫危險(xiǎn)的代謝信號(hào)。此外，腸道內(nèi)的產(chǎn)短鏈脂肪酸菌，如產(chǎn)丁酸梭菌屬等可以增加和輔助Tregs細(xì)胞的歸巢和分化，對(duì)維持免疫穩(wěn)態(tài)具有重要作用[15]。可見(jiàn)，高脂飲食會(huì)降低腸道有益菌豐度，增加有害菌豐度，造成菌群失調(diào)，免疫功能紊亂，加劇病程。

PTEN具有維持Tregs細(xì)胞穩(wěn)定的作用。研究顯示：PTEN缺失或抑制等情況下，Tregs細(xì)胞具有促進(jìn)脂肪酸氧化磷酸化的作用，F(xiàn)oxP3是維持和控制Tregs發(fā)育和功能的主要轉(zhuǎn)錄因子之一，可以促使Tregs對(duì)脂肪酸的利用，防止脂質(zhì)毒性[16]。本研究發(fā)現(xiàn)：高脂飲食下，PtenCKO小鼠肝損傷嚴(yán)重，病理表型為嚴(yán)重NASH，其肝臟及腸系膜淋巴結(jié)Tregs細(xì)胞比例較野生型明顯升高。與Wang等[17]發(fā)現(xiàn)膽堿蛋氨酸缺乏和高脂飼料同時(shí)喂食下NASH小鼠肝臟Tregs細(xì)胞比例增高的結(jié)果一致。WT小鼠因?yàn)榘Y狀輕微，病理表型為單純性脂肪變性，肝臟免疫細(xì)胞Tregs比例下降，但趨勢(shì)不明顯，這可能與本研究造模時(shí)間較短有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)CD8+T細(xì)胞百分比在PtenCKO小鼠肝臟和腸系膜淋巴結(jié)中趨勢(shì)變化不一致，尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

綜上，本研究綜合運(yùn)用PtenCKO小鼠及高脂造模證實(shí)高脂飲食會(huì)加重PtenCKO小鼠的肝損傷，腸黏膜屏障受損，免疫細(xì)胞Tregs比例失衡及腸道菌群失調(diào)，這些因素共同加劇了遺傳易感小鼠肝臟炎癥反應(yīng)和NASH病程進(jìn)展。本研究為進(jìn)一步闡明NASH炎癥發(fā)展機(jī)制，以及探索潛在的作為NASH病情評(píng)估的生物標(biāo)志物或治療方法提供了參考依據(jù)。