鐘立萍 謝旦立 樓永良

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）是一種常見的慢性肝病，與肥胖、高脂血癥和代謝綜合征等疾病密切相關(guān)[1]，全球發(fā)病率約為25.2%[2]。非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis,NASH）是NAFLD嚴(yán)重病理類型之一，臨床資料顯示，多達(dá)1/3的NASH患者可能發(fā)展為晚期纖維化、肝硬化和肝細(xì)胞癌，需要進(jìn)行肝移植治療[3-4]。因此，闡明NASH炎癥進(jìn)展的潛在機(jī)制，對(duì)疾病研究及診療具有重要意義。本研究通過高脂飲食喂飼野生型C57BL/6小鼠和遺傳易感型肝特異性PTEN基因缺失（liver-specific PTEN deficiency,PtenCKO）小鼠構(gòu)建NAFLD模型，研究不同處理小鼠組織病理、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells,Tregs）的免疫調(diào)節(jié)作用和腸道菌群特征，以期為NASH診治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6周齡雄性C57BL/6野生型（wild type,WT）小鼠購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0005]，PtenCKO小鼠購自南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所[許可證號(hào)：SCXK（蘇）2018-0008]，為C57BL/6背景，均由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)于SPF環(huán)境。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均通過溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批（批準(zhǔn)編號(hào)：2019-0266）。

1.1.2 主要試劑 IMDM細(xì)胞培養(yǎng)基、1000×β-mercaptoethanol購自美國Gibco公司；FBS購自中國浙江天杭生物公司；4%多聚甲醛固定液（4%PFA）購自中國北京索萊寶公司；冷凍包埋劑購自日本SAKURA公司；Live/Dead可固定死細(xì)胞熒光抗體、eBioscience破膜試劑盒含固定/通透液、eBioscience Perm/Wash?洗滌緩沖液購自美國Thermo Fisher Scientific公司；ChamQ qPCR SYBR Green Master Mix購自中國南京諾唯贊公司；Percoll細(xì)胞分離液購自美國GE公司；流式熒光抗體：抗鼠-CD4-AF488、CD8-PE/Cy7、FoxP3-PE購自美國Biolegend公司；鼠D-乳酸（D-Lactate,D-LA）ELISA試劑盒購自中國上海源葉生物公司；Trizol RNA提取試劑盒、糞便基因組提取試劑盒購自美國Omega Bio-Tek公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自中國大連TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物建模及標(biāo)本采集 實(shí)驗(yàn)小鼠分為PtenCKO高脂飲食組（PtenCKO HFD）、PtenCKO正常飲食組（PtenCKO NCD）、野生型高脂飲食組（WT HFD）和野生型正常飲食組（WT NCD），每組8只，給予相同量的標(biāo)準(zhǔn)飼料或60%高脂飼料（中國江蘇協(xié)同生物公司）。造模10周，期間小鼠自由飲食、飲水。

1.2.2 標(biāo)本采集 （1）糞便標(biāo)本采集：造模結(jié)束前2天采集4組小鼠糞便，采集后及時(shí)提取或立即-80℃凍存?zhèn)溆?。?）血漿標(biāo)本采集：實(shí)驗(yàn)前1天晚上小鼠禁食不禁水。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天稱取小鼠體質(zhì)量，異氟烷麻醉后眼球采血，收集于含有EDTA抗凝劑的離心管，提取血漿，-80℃凍存?zhèn)溆?。?）組織標(biāo)本采集：小鼠頸椎脫臼處死，手術(shù)剪剪取整個(gè)肝，記錄肝臟的一般情況，相機(jī)拍照。記錄肝濕質(zhì)量，計(jì)算肝重指數(shù)，肝重指數(shù)=肝濕質(zhì)量/體質(zhì)量×100%。剪取一部分肝左葉固定于4%PFA，剩余部分肝臟組織置于10%IMDM培養(yǎng)基中。根據(jù)解剖標(biāo)記（自回盲瓣近端5 cm處取材）剪取小鼠回腸組織，一部分回腸組織固定于4%PFA，剩余部分回腸組織-80℃凍存?zhèn)溆?。沿腸系膜收集腸系膜淋巴結(jié)并置于10%IMDM培養(yǎng)基中備用。

1.2.3 肝臟、回腸病理觀察 石蠟切片HE染色后，觀察肝細(xì)胞脂肪變、氣球樣變和小葉內(nèi)炎癥及小腸組織黏膜的結(jié)構(gòu)變化；冷凍切片油紅O染色后，觀察肝臟脂肪變。

1.2.4 回腸組織緊密連接蛋白mRNA轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)采用熒光定量PCR法。按照Trizol RNA提取試劑盒方法提取回腸組織總mRNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒方法逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）基因?yàn)閮?nèi)參。ZO-1 引物序列：F-5′-AGGACACCAAAGCATGTGAG-3′，R-5′-GGCATTCCTGCTGGTTACA-3′；Claudin-1：F-5′-TGCCCCAGTGGAAGATTTACT-3′，R-5′-CTTTGCGAAACGCAGGACAT-3′；GAPDH：F-5′-CGTGCCGCCTGGAGAAACCTG-3′，R-5′-AGAGTGGGAGTTGCTGTTGAAGTCG-3′。引物由中國上海桑尼生物科技有限公司合成。

1.2.5 腸道屏障指標(biāo)D-LA濃度檢測(cè) 采用ELISA法。按照鼠D-LA ELISA試劑盒方法檢測(cè)各組小鼠血漿D-LA濃度。

1.2.6 腸道菌群分析 按照糞便基因組提取試劑盒方法提取4組小鼠糞便樣本基因組DNA。用特異性引物擴(kuò)增16S rDNA的V3-V4區(qū)域并委托中國杭州晶佰生物科技有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序。引物由中國上海桑尼生物科技有限公司合成，引物序列：F-5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′，R-5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′。數(shù)據(jù)處理：（1）稀釋曲線分析。對(duì)所有樣本序列進(jìn)行隨機(jī)抽樣，以抽取到的序列數(shù)與它們所能代表的OTU數(shù)目構(gòu)建稀釋曲線，用于說明樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)是否足以反映菌群的多樣性。（2）α多樣性分析。測(cè)定Chao1指數(shù)、PD Whole tree指數(shù)等豐度指數(shù)，值越大，表明豐度越高；測(cè)定Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)等多樣性指標(biāo)，值越大，表明多樣性越高。（3）β多樣性分析。進(jìn)行PCoA主坐標(biāo)分析。使用QIIME軟件制作PCoA圖表，選取貢獻(xiàn)率最大的主坐標(biāo)組合進(jìn)行作圖，通過測(cè)定坐標(biāo)軸中各樣本間距離分析菌群差異性。距離越近，表示菌群差異性較小，相反則差異性較大。（4）菌群組成分析。根據(jù)OTU分析結(jié)果，得到各樣品在各分類水平上（門、屬）的物種組成比例。（5）組間菌群差異分析。進(jìn)行物種LEfSe差異分析，以線性判別分析（linear discriminant analysis,LDA）效應(yīng)量來估算每個(gè)物種豐度對(duì)差異效果影響的大小。

1.2.7 單個(gè)核細(xì)胞分離與免疫細(xì)胞Tregs檢測(cè) （1）單個(gè)核細(xì)胞分離：采用密度梯度離心法，取新鮮肝參考文獻(xiàn)[5]方法分離肝臟單個(gè)核細(xì)胞。將腸系膜淋巴結(jié)研磨后過濾，離心（4 ℃，1 500 r/min，5 min）棄上清液，IMDM培養(yǎng)基重懸，分離得到腸系膜淋巴結(jié)（mesenteric lymph nodes，MLNs）單個(gè)核細(xì)胞懸液。（2）免疫細(xì)胞Tregs檢測(cè)：采用流式細(xì)胞術(shù)。根據(jù)牛鮑計(jì)數(shù)板細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，按1×106個(gè)/孔的細(xì)胞數(shù)在96孔尖底板中鋪板，棄上清液后染色；用流式染色緩沖液按1∶400配制流式熒光抗體（CD4-AF488、CD8-PE/Cy7、Live/Dead），50 μl/孔加至尖底板，避光染色20 min；加入200 μl/孔流式染色緩沖液終止染色，并用200 μl/孔流式染色緩沖液重復(fù)洗滌2次，用100 μl固定/通透液重懸，4℃避光破膜過夜；加入200 μl 1×eBioscience Perm/Wash?洗滌緩沖液終止，并重復(fù)洗滌2次；用洗滌緩沖液按1∶200配制流式熒光抗體（FoxP3-PE），50 μl/孔加至尖底板，冰上避光染色2 h，再重復(fù)洗滌2次。重懸后流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Graphpad Prism 7.0進(jìn)行圖形制作和分析。流式數(shù)據(jù)通過BD FACS AriaⅡ流式細(xì)胞儀采集，采用Flowjo V10軟件分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）；不符合正態(tài)分布的以M（P25，P75）表示，采用非參數(shù)檢驗(yàn)（Kruskal-Wallis）法進(jìn)行多重比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠肝臟外觀及組織病理學(xué)觀察 與其他3組肝臟相比，PtenCKO HFD組小鼠肝臟體積明顯增大，邊緣厚且鈍，顆粒粗糙，表面和切面有油膩感，色澤黃白色（圖1a，見插頁）。與正常飲食組相比，高脂飲食組小鼠肝濕質(zhì)量顯著增加（P＜0.05）（圖1b，見插頁），PtenCKO HFD組肝重指數(shù)高于其他3組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）（圖1c，見插頁）。病理染色顯示：高脂飲食組小鼠肝臟脂肪變的程度和炎性浸潤程度均較正常飲食組增加，其中PtenCKO HFD組可見彌漫性、大顆粒狀紅色脂滴堆積，且部分融合呈片狀，匯管區(qū)清晰可見炎性細(xì)胞浸潤（圖1d，見插頁）。這些結(jié)果表明：高脂飲食明顯加快了PtenCKO小鼠肝損傷病程。

圖1 不同飲食對(duì)小鼠肝臟組織病理的影響（a：肝臟外觀；b：肝濕質(zhì)量；c：肝重指數(shù)；d：肝組織HE及油紅O染色，×20）

2.2 4組小鼠腸黏膜組織病理觀察及腸黏膜通透性指標(biāo)變化的分析 病理染色顯示：正常飲食組中，WT NCD組小腸黏膜結(jié)構(gòu)完整，絨毛表面細(xì)胞排列整齊、緊密，無充血、水腫改變；PtenCKO NCD組小腸黏膜結(jié)構(gòu)較為完整，但微絨毛表面細(xì)胞排列混亂，并伴有充血、水腫現(xiàn)象。高脂飲食組小鼠均有不同程度的小腸黏膜水腫，并伴有炎性細(xì)胞浸潤，微絨毛間隙增寬，部分伴有微絨毛變短、斷裂并伴有充血、水腫現(xiàn)象（圖2a，見插頁）。定量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：與WT NCD組相比，WT HFD組回腸ZO-1和Claudin-1相對(duì)表達(dá)量均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），相比其他3組，PtenCKO HFD組ZO-1表達(dá)異常增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）（圖2b，見插頁）。與WT NCD組相比，其他3組小鼠D-LA濃度均有不同程度升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）（圖2c，見插頁）。這些結(jié)果表明：高脂飲食導(dǎo)致小鼠腸黏膜屏障受損并伴有腸組織炎癥。

圖2 4組小鼠腸黏膜組織病理及腸黏膜通透性指標(biāo)的變化（a：小腸組織HE染色，×20；b：緊密連接蛋白相對(duì)表達(dá)量；c：血漿D-LA濃度）

2.3 小鼠腸道菌群組成及多樣性的變化 稀釋曲線分析顯示：各組小鼠的稀釋性曲線逐漸趨向平坦，更多的序列數(shù)只會(huì)產(chǎn)生少量的OTU，表明本次測(cè)序基本能夠真實(shí)反映樣本中的微生物情況（圖3a，見插頁）。α多樣性分析顯示：正常飲食組腸道菌群的豐度和多樣性均高于高脂飲食組，其中，PtenCKO HFD組小鼠腸道菌群的豐度和多樣性均最低（圖3b，見插頁）。PCoA主坐標(biāo)分析顯示：高脂飲食組的WT和PtenCKO小鼠兩組間直線距離較近，菌群構(gòu)成較為相似；正常飲食組的WT和PtenCKO小鼠兩組間直線距離較遠(yuǎn)，菌群構(gòu)成存在差異性（圖3c，見插頁）。物種注釋和分析顯示：在門分類水平上，各組小鼠主要腸道菌均為擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門，其中擬桿菌門和厚壁菌門是各組小鼠的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌門（圖3d，見插頁）。在屬分類水平上，相比WT NCD組，WT HFD組和PtenCKO HFD組Bacteroides屬、Alloprevotella屬、Alistipes屬豐度增高，Barnesiella屬、Odoribacter屬豐度下降；WT NCD組Akkermansia屬豐度高于其他3組（圖3e，見插頁）。對(duì)腸道菌群的LEfSe分析顯示：PtenCKO HFD組與WT HFD組菌群構(gòu)成較為相似，PtenCKO NCD組和WT NCD組小鼠腸道菌群構(gòu)成不同；高脂飲食主要引起B(yǎng)acteroides屬、Parabacteoides屬、Enterococcus屬、Enterorhabdus屬、Desulfovibrionaceae屬、Escherichia屬和Escherichia-Shigella屬等腸道致病菌和條件致病菌豐度增加，而Lactobacillus屬、Butyricicoccus屬等腸道有益菌豐度降低（圖3f，見插頁）?？梢姡嬍澈瓦z傳缺陷對(duì)小鼠腸道菌群存在不同程度的影響，高脂飲食對(duì)腸道菌群的構(gòu)成影響更為顯著。

圖3 不同飲食對(duì)小鼠腸道菌群變化的影響（a：稀釋曲線圖；b：Chao1指數(shù)，PD Whole tree指數(shù)，Shannon指數(shù)，Simpson指數(shù)；c：PCoA主坐標(biāo)分析圖；d：門水平；e：屬水平；f：LEfSe分析圖）

2.4 小鼠肝臟、腸系膜淋巴結(jié)免疫細(xì)胞Tregs變化分析 經(jīng)過10周的高脂飲食，與WT NCD組相比，WT HFD組肝臟免疫細(xì)胞Tregs下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與PtenCKO NCD組相比，PtenCKO HFD組肝臟免疫細(xì)胞Tregs上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與WT小鼠比較，PtenCKO小鼠肝臟免疫細(xì)胞Tregs升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖4a，見插頁）。與其他3組相比，PtenCKO HFD組腸系膜淋巴結(jié)免疫細(xì)胞Tregs細(xì)胞比例上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）（圖4b，見插頁）。

圖4 不同飲食對(duì)小鼠肝臟和腸系膜淋巴結(jié)Tregs細(xì)胞變化的影響（a：肝臟Tregs細(xì)胞流式圖及百分比；b：腸系膜淋巴結(jié)Tregs細(xì)胞流式圖及百分比）

3 討論

NASH是NAFLD的進(jìn)行性表現(xiàn)，持續(xù)炎癥刺激使NASH向肝纖維化發(fā)展，是肝硬化及肝癌的重要危險(xiǎn)因素，目前尚未出臺(tái)有效的治療方案及藥物用于治療NASH[6]。研究顯示：患有肥胖相關(guān)的脂肪肝人群存在PTEN表達(dá)下降的現(xiàn)象[7]。PtenCKO小鼠在遺傳和基因表達(dá)上都是NASH研究較為理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型[8]。本研究對(duì)PtenCKO轉(zhuǎn)基因鼠肝臟進(jìn)行了病理染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：PtenCKO小鼠即使正常飲食也伴有典型的NASH表現(xiàn)，高脂飲食下，NASH癥狀加重，個(gè)別小鼠伴有輕度的纖維化。

NASH的發(fā)生、發(fā)展與免疫病理、腸道屏障受損及腸道菌群失調(diào)等因素密切相關(guān)[9]。本研究發(fā)現(xiàn)：高脂飲食組的小鼠腸組織發(fā)生不同程度的病理改變，D-LA升高，ZO-1、Claudin-1的相對(duì)表達(dá)量發(fā)生變化。Xu等[10]發(fā)現(xiàn)：WT小鼠在高脂飲食下，緊密連接蛋白ZO-1、Claudin-1的mRNA下降，提示腸黏膜屏障損傷；與本研究發(fā)現(xiàn)的高脂飲食下PtenCKO小鼠緊密連接蛋白ZO-1的mRNA表達(dá)水平異常升高的結(jié)果不一致，需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探討。也有研究顯示：ZO-1在肝癌患者中的表達(dá)水平較健康人群升高[11]，而PtenCKO小鼠最終將自發(fā)發(fā)展為肝癌[12]。D-LA是腸道細(xì)菌的代謝產(chǎn)物，當(dāng)腸道屏障受損而導(dǎo)致腸黏膜屏障通透性增加時(shí)，D-LA活性增高，提示腸道屏障完整性的缺失可能推動(dòng)了肝臟炎癥和NASH病程進(jìn)展。腸道菌群易受膳食影響。本研究發(fā)現(xiàn)：高脂飲食對(duì)腸道菌群影響顯著，小鼠腸道菌群豐度及多樣性均減少。LEfSe分析顯示：高脂飲食主要引起B(yǎng)acteroides屬、Parabacteoides屬、Enterococcus屬、Enterorhabdus屬、Desulfovibrionaceae屬、Escherichia屬和Escherichia-Shigella屬等腸道致病菌和條件致病菌豐度增加，而Lactobacillus屬、Butyricicoccus屬等腸道有益菌豐度降低。與WT小鼠相比，高脂飲食下PtenCKO小鼠Alloprevotella屬增加，Odoribacter屬降低。研究顯示：Prevotellacea 科[13]、Odoribacter屬[14]在NASH患者中豐度較低。Alloprevotella屬隸屬于Prevotellaceae科，Prevotellaceae科主要為琥珀酸產(chǎn)生菌，Odoribacter屬主要為琥珀酸消耗菌，均與腸道琥珀酸代謝相關(guān)；在體內(nèi)琥珀酸濃度受肥胖、糖耐量受損等影響，琥珀酸濃度失衡是機(jī)體缺氧和炎癥下局部應(yīng)激和免疫危險(xiǎn)的代謝信號(hào)。此外，腸道內(nèi)的產(chǎn)短鏈脂肪酸菌，如產(chǎn)丁酸梭菌屬等可以增加和輔助Tregs細(xì)胞的歸巢和分化，對(duì)維持免疫穩(wěn)態(tài)具有重要作用[15]?？梢?，高脂飲食會(huì)降低腸道有益菌豐度，增加有害菌豐度，造成菌群失調(diào)，免疫功能紊亂，加劇病程。

PTEN具有維持Tregs細(xì)胞穩(wěn)定的作用。研究顯示：PTEN缺失或抑制等情況下，Tregs細(xì)胞具有促進(jìn)脂肪酸氧化磷酸化的作用，F(xiàn)oxP3是維持和控制Tregs發(fā)育和功能的主要轉(zhuǎn)錄因子之一，可以促使Tregs對(duì)脂肪酸的利用，防止脂質(zhì)毒性[16]。本研究發(fā)現(xiàn)：高脂飲食下，PtenCKO小鼠肝損傷嚴(yán)重，病理表型為嚴(yán)重NASH，其肝臟及腸系膜淋巴結(jié)Tregs細(xì)胞比例較野生型明顯升高。與Wang等[17]發(fā)現(xiàn)膽堿蛋氨酸缺乏和高脂飼料同時(shí)喂食下NASH小鼠肝臟Tregs細(xì)胞比例增高的結(jié)果一致。WT小鼠因?yàn)榘Y狀輕微，病理表型為單純性脂肪變性，肝臟免疫細(xì)胞Tregs比例下降，但趨勢(shì)不明顯，這可能與本研究造模時(shí)間較短有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)CD8+T細(xì)胞百分比在PtenCKO小鼠肝臟和腸系膜淋巴結(jié)中趨勢(shì)變化不一致，尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

綜上，本研究綜合運(yùn)用PtenCKO小鼠及高脂造模證實(shí)高脂飲食會(huì)加重PtenCKO小鼠的肝損傷，腸黏膜屏障受損，免疫細(xì)胞Tregs比例失衡及腸道菌群失調(diào)，這些因素共同加劇了遺傳易感小鼠肝臟炎癥反應(yīng)和NASH病程進(jìn)展。本研究為進(jìn)一步闡明NASH炎癥發(fā)展機(jī)制，以及探索潛在的作為NASH病情評(píng)估的生物標(biāo)志物或治療方法提供了參考依據(jù)。