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        高脂飲食對(duì)非酒精性脂肪性肝炎小鼠腸肝免疫及腸道菌群的影響

        2022-07-22 04:01:54鐘立萍謝旦立樓永良
        浙江醫(yī)學(xué) 2022年12期
        關(guān)鍵詞:插頁(yè)高脂菌群

        鐘立萍 謝旦立 樓永良

        非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是一種常見(jiàn)的慢性肝病,與肥胖、高脂血癥和代謝綜合征等疾病密切相關(guān)[1],全球發(fā)病率約為25.2%[2]。非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis,NASH)是NAFLD嚴(yán)重病理類型之一,臨床資料顯示,多達(dá)1/3的NASH患者可能發(fā)展為晚期纖維化、肝硬化和肝細(xì)胞癌,需要進(jìn)行肝移植治療[3-4]。因此,闡明NASH炎癥進(jìn)展的潛在機(jī)制,對(duì)疾病研究及診療具有重要意義。本研究通過(guò)高脂飲食喂飼野生型C57BL/6小鼠和遺傳易感型肝特異性PTEN基因缺失(liver-specific PTEN deficiency,PtenCKO)小鼠構(gòu)建NAFLD模型,研究不同處理小鼠組織病理、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells,Tregs)的免疫調(diào)節(jié)作用和腸道菌群特征,以期為NASH診治提供科學(xué)依據(jù)。

        1 材料和方法

        1.1 材料

        1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6周齡雄性C57BL/6野生型(wild type,WT)小鼠購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[許可證號(hào):SCXK(滬)2017-0005],PtenCKO小鼠購(gòu)自南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所[許可證號(hào):SCXK(蘇)2018-0008],為C57BL/6背景,均由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)于SPF環(huán)境。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均通過(guò)溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批(批準(zhǔn)編號(hào):2019-0266)。

        1.1.2 主要試劑 IMDM細(xì)胞培養(yǎng)基、1000×β-mercaptoethanol購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;FBS購(gòu)自中國(guó)浙江天杭生物公司;4%多聚甲醛固定液(4%PFA)購(gòu)自中國(guó)北京索萊寶公司;冷凍包埋劑購(gòu)自日本SAKURA公司;Live/Dead可固定死細(xì)胞熒光抗體、eBioscience破膜試劑盒含固定/通透液、eBioscience Perm/Wash?洗滌緩沖液購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司;ChamQ qPCR SYBR Green Master Mix購(gòu)自中國(guó)南京諾唯贊公司;Percoll細(xì)胞分離液購(gòu)自美國(guó)GE公司;流式熒光抗體:抗鼠-CD4-AF488、CD8-PE/Cy7、FoxP3-PE購(gòu)自美國(guó)Biolegend公司;鼠D-乳酸(D-Lactate,D-LA)ELISA試劑盒購(gòu)自中國(guó)上海源葉生物公司;Trizol RNA提取試劑盒、糞便基因組提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Omega Bio-Tek公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自中國(guó)大連TaKaRa公司。

        1.2 方法

        1.2.1 動(dòng)物建模及標(biāo)本采集 實(shí)驗(yàn)小鼠分為PtenCKO高脂飲食組(PtenCKO HFD)、PtenCKO正常飲食組(PtenCKO NCD)、野生型高脂飲食組(WT HFD)和野生型正常飲食組(WT NCD),每組8只,給予相同量的標(biāo)準(zhǔn)飼料或60%高脂飼料(中國(guó)江蘇協(xié)同生物公司)。造模10周,期間小鼠自由飲食、飲水。

        1.2.2 標(biāo)本采集 (1)糞便標(biāo)本采集:造模結(jié)束前2天采集4組小鼠糞便,采集后及時(shí)提取或立即-80℃凍存?zhèn)溆谩#?)血漿標(biāo)本采集:實(shí)驗(yàn)前1天晚上小鼠禁食不禁水。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天稱取小鼠體質(zhì)量,異氟烷麻醉后眼球采血,收集于含有EDTA抗凝劑的離心管,提取血漿,-80℃凍存?zhèn)溆?。?)組織標(biāo)本采集:小鼠頸椎脫臼處死,手術(shù)剪剪取整個(gè)肝,記錄肝臟的一般情況,相機(jī)拍照。記錄肝濕質(zhì)量,計(jì)算肝重指數(shù),肝重指數(shù)=肝濕質(zhì)量/體質(zhì)量×100%。剪取一部分肝左葉固定于4%PFA,剩余部分肝臟組織置于10%IMDM培養(yǎng)基中。根據(jù)解剖標(biāo)記(自回盲瓣近端5 cm處取材)剪取小鼠回腸組織,一部分回腸組織固定于4%PFA,剩余部分回腸組織-80℃凍存?zhèn)溆?。沿腸系膜收集腸系膜淋巴結(jié)并置于10%IMDM培養(yǎng)基中備用。

        1.2.3 肝臟、回腸病理觀察 石蠟切片HE染色后,觀察肝細(xì)胞脂肪變、氣球樣變和小葉內(nèi)炎癥及小腸組織黏膜的結(jié)構(gòu)變化;冷凍切片油紅O染色后,觀察肝臟脂肪變。

        1.2.4 回腸組織緊密連接蛋白mRNA轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)采用熒光定量PCR法。按照Trizol RNA提取試劑盒方法提取回腸組織總mRNA,按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒方法逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)基因?yàn)閮?nèi)參。ZO-1 引物序列:F-5′-AGGACACCAAAGCATGTGAG-3′,R-5′-GGCATTCCTGCTGGTTACA-3′;Claudin-1:F-5′-TGCCCCAGTGGAAGATTTACT-3′,R-5′-CTTTGCGAAACGCAGGACAT-3′;GAPDH:F-5′-CGTGCCGCCTGGAGAAACCTG-3′,R-5′-AGAGTGGGAGTTGCTGTTGAAGTCG-3′。引物由中國(guó)上海桑尼生物科技有限公司合成。

        1.2.5 腸道屏障指標(biāo)D-LA濃度檢測(cè) 采用ELISA法。按照鼠D-LA ELISA試劑盒方法檢測(cè)各組小鼠血漿D-LA濃度。

        1.2.6 腸道菌群分析 按照糞便基因組提取試劑盒方法提取4組小鼠糞便樣本基因組DNA。用特異性引物擴(kuò)增16S rDNA的V3-V4區(qū)域并委托中國(guó)杭州晶佰生物科技有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序。引物由中國(guó)上海桑尼生物科技有限公司合成,引物序列:F-5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′,R-5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′。數(shù)據(jù)處理:(1)稀釋曲線分析。對(duì)所有樣本序列進(jìn)行隨機(jī)抽樣,以抽取到的序列數(shù)與它們所能代表的OTU數(shù)目構(gòu)建稀釋曲線,用于說(shuō)明樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)是否足以反映菌群的多樣性。(2)α多樣性分析。測(cè)定Chao1指數(shù)、PD Whole tree指數(shù)等豐度指數(shù),值越大,表明豐度越高;測(cè)定Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)等多樣性指標(biāo),值越大,表明多樣性越高。(3)β多樣性分析。進(jìn)行PCoA主坐標(biāo)分析。使用QIIME軟件制作PCoA圖表,選取貢獻(xiàn)率最大的主坐標(biāo)組合進(jìn)行作圖,通過(guò)測(cè)定坐標(biāo)軸中各樣本間距離分析菌群差異性。距離越近,表示菌群差異性較小,相反則差異性較大。(4)菌群組成分析。根據(jù)OTU分析結(jié)果,得到各樣品在各分類水平上(門、屬)的物種組成比例。(5)組間菌群差異分析。進(jìn)行物種LEfSe差異分析,以線性判別分析(linear discriminant analysis,LDA)效應(yīng)量來(lái)估算每個(gè)物種豐度對(duì)差異效果影響的大小。

        1.2.7 單個(gè)核細(xì)胞分離與免疫細(xì)胞Tregs檢測(cè) (1)單個(gè)核細(xì)胞分離:采用密度梯度離心法,取新鮮肝參考文獻(xiàn)[5]方法分離肝臟單個(gè)核細(xì)胞。將腸系膜淋巴結(jié)研磨后過(guò)濾,離心(4 ℃,1 500 r/min,5 min)棄上清液,IMDM培養(yǎng)基重懸,分離得到腸系膜淋巴結(jié)(mesenteric lymph nodes,MLNs)單個(gè)核細(xì)胞懸液。(2)免疫細(xì)胞Tregs檢測(cè):采用流式細(xì)胞術(shù)。根據(jù)牛鮑計(jì)數(shù)板細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果,按1×106個(gè)/孔的細(xì)胞數(shù)在96孔尖底板中鋪板,棄上清液后染色;用流式染色緩沖液按1∶400配制流式熒光抗體(CD4-AF488、CD8-PE/Cy7、Live/Dead),50 μl/孔加至尖底板,避光染色20 min;加入200 μl/孔流式染色緩沖液終止染色,并用200 μl/孔流式染色緩沖液重復(fù)洗滌2次,用100 μl固定/通透液重懸,4℃避光破膜過(guò)夜;加入200 μl 1×eBioscience Perm/Wash?洗滌緩沖液終止,并重復(fù)洗滌2次;用洗滌緩沖液按1∶200配制流式熒光抗體(FoxP3-PE),50 μl/孔加至尖底板,冰上避光染色2 h,再重復(fù)洗滌2次。重懸后流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Graphpad Prism 7.0進(jìn)行圖形制作和分析。流式數(shù)據(jù)通過(guò)BD FACS AriaⅡ流式細(xì)胞儀采集,采用Flowjo V10軟件分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示,采用單因素方差分析(One-Way ANOVA);不符合正態(tài)分布的以M(P25,P75)表示,采用非參數(shù)檢驗(yàn)(Kruskal-Wallis)法進(jìn)行多重比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 小鼠肝臟外觀及組織病理學(xué)觀察 與其他3組肝臟相比,PtenCKO HFD組小鼠肝臟體積明顯增大,邊緣厚且鈍,顆粒粗糙,表面和切面有油膩感,色澤黃白色(圖1a,見(jiàn)插頁(yè))。與正常飲食組相比,高脂飲食組小鼠肝濕質(zhì)量顯著增加(P<0.05)(圖1b,見(jiàn)插頁(yè)),PtenCKO HFD組肝重指數(shù)高于其他3組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(圖1c,見(jiàn)插頁(yè))。病理染色顯示:高脂飲食組小鼠肝臟脂肪變的程度和炎性浸潤(rùn)程度均較正常飲食組增加,其中PtenCKO HFD組可見(jiàn)彌漫性、大顆粒狀紅色脂滴堆積,且部分融合呈片狀,匯管區(qū)清晰可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1d,見(jiàn)插頁(yè))。這些結(jié)果表明:高脂飲食明顯加快了PtenCKO小鼠肝損傷病程。

        圖1 不同飲食對(duì)小鼠肝臟組織病理的影響(a:肝臟外觀;b:肝濕質(zhì)量;c:肝重指數(shù);d:肝組織HE及油紅O染色,×20)

        2.2 4組小鼠腸黏膜組織病理觀察及腸黏膜通透性指標(biāo)變化的分析 病理染色顯示:正常飲食組中,WT NCD組小腸黏膜結(jié)構(gòu)完整,絨毛表面細(xì)胞排列整齊、緊密,無(wú)充血、水腫改變;PtenCKO NCD組小腸黏膜結(jié)構(gòu)較為完整,但微絨毛表面細(xì)胞排列混亂,并伴有充血、水腫現(xiàn)象。高脂飲食組小鼠均有不同程度的小腸黏膜水腫,并伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn),微絨毛間隙增寬,部分伴有微絨毛變短、斷裂并伴有充血、水腫現(xiàn)象(圖2a,見(jiàn)插頁(yè))。定量檢測(cè)發(fā)現(xiàn):與WT NCD組相比,WT HFD組回腸ZO-1和Claudin-1相對(duì)表達(dá)量均降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),相比其他3組,PtenCKO HFD組ZO-1表達(dá)異常增高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(圖2b,見(jiàn)插頁(yè))。與WT NCD組相比,其他3組小鼠D-LA濃度均有不同程度升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(圖2c,見(jiàn)插頁(yè))。這些結(jié)果表明:高脂飲食導(dǎo)致小鼠腸黏膜屏障受損并伴有腸組織炎癥。

        圖2 4組小鼠腸黏膜組織病理及腸黏膜通透性指標(biāo)的變化(a:小腸組織HE染色,×20;b:緊密連接蛋白相對(duì)表達(dá)量;c:血漿D-LA濃度)

        2.3 小鼠腸道菌群組成及多樣性的變化 稀釋曲線分析顯示:各組小鼠的稀釋性曲線逐漸趨向平坦,更多的序列數(shù)只會(huì)產(chǎn)生少量的OTU,表明本次測(cè)序基本能夠真實(shí)反映樣本中的微生物情況(圖3a,見(jiàn)插頁(yè))。α多樣性分析顯示:正常飲食組腸道菌群的豐度和多樣性均高于高脂飲食組,其中,PtenCKO HFD組小鼠腸道菌群的豐度和多樣性均最低(圖3b,見(jiàn)插頁(yè))。PCoA主坐標(biāo)分析顯示:高脂飲食組的WT和PtenCKO小鼠兩組間直線距離較近,菌群構(gòu)成較為相似;正常飲食組的WT和PtenCKO小鼠兩組間直線距離較遠(yuǎn),菌群構(gòu)成存在差異性(圖3c,見(jiàn)插頁(yè))。物種注釋和分析顯示:在門分類水平上,各組小鼠主要腸道菌均為擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門,其中擬桿菌門和厚壁菌門是各組小鼠的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌門(圖3d,見(jiàn)插頁(yè))。在屬分類水平上,相比WT NCD組,WT HFD組和PtenCKO HFD組Bacteroides屬、Alloprevotella屬、Alistipes屬豐度增高,Barnesiella屬、Odoribacter屬豐度下降;WT NCD組Akkermansia屬豐度高于其他3組(圖3e,見(jiàn)插頁(yè))。對(duì)腸道菌群的LEfSe分析顯示:PtenCKO HFD組與WT HFD組菌群構(gòu)成較為相似,PtenCKO NCD組和WT NCD組小鼠腸道菌群構(gòu)成不同;高脂飲食主要引起B(yǎng)acteroides屬、Parabacteoides屬、Enterococcus屬、Enterorhabdus屬、Desulfovibrionaceae屬、Escherichia屬和Escherichia-Shigella屬等腸道致病菌和條件致病菌豐度增加,而Lactobacillus屬、Butyricicoccus屬等腸道有益菌豐度降低(圖3f,見(jiàn)插頁(yè))??梢?jiàn),飲食和遺傳缺陷對(duì)小鼠腸道菌群存在不同程度的影響,高脂飲食對(duì)腸道菌群的構(gòu)成影響更為顯著。

        圖3 不同飲食對(duì)小鼠腸道菌群變化的影響(a:稀釋曲線圖;b:Chao1指數(shù),PD Whole tree指數(shù),Shannon指數(shù),Simpson指數(shù);c:PCoA主坐標(biāo)分析圖;d:門水平;e:屬水平;f:LEfSe分析圖)

        2.4 小鼠肝臟、腸系膜淋巴結(jié)免疫細(xì)胞Tregs變化分析 經(jīng)過(guò)10周的高脂飲食,與WT NCD組相比,WT HFD組肝臟免疫細(xì)胞Tregs下降,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與PtenCKO NCD組相比,PtenCKO HFD組肝臟免疫細(xì)胞Tregs上升,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與WT小鼠比較,PtenCKO小鼠肝臟免疫細(xì)胞Tregs升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖4a,見(jiàn)插頁(yè))。與其他3組相比,PtenCKO HFD組腸系膜淋巴結(jié)免疫細(xì)胞Tregs細(xì)胞比例上升,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(圖4b,見(jiàn)插頁(yè))。

        圖4 不同飲食對(duì)小鼠肝臟和腸系膜淋巴結(jié)Tregs細(xì)胞變化的影響(a:肝臟Tregs細(xì)胞流式圖及百分比;b:腸系膜淋巴結(jié)Tregs細(xì)胞流式圖及百分比)

        3 討論

        NASH是NAFLD的進(jìn)行性表現(xiàn),持續(xù)炎癥刺激使NASH向肝纖維化發(fā)展,是肝硬化及肝癌的重要危險(xiǎn)因素,目前尚未出臺(tái)有效的治療方案及藥物用于治療NASH[6]。研究顯示:患有肥胖相關(guān)的脂肪肝人群存在PTEN表達(dá)下降的現(xiàn)象[7]。PtenCKO小鼠在遺傳和基因表達(dá)上都是NASH研究較為理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型[8]。本研究對(duì)PtenCKO轉(zhuǎn)基因鼠肝臟進(jìn)行了病理染色,結(jié)果發(fā)現(xiàn):PtenCKO小鼠即使正常飲食也伴有典型的NASH表現(xiàn),高脂飲食下,NASH癥狀加重,個(gè)別小鼠伴有輕度的纖維化。

        NASH的發(fā)生、發(fā)展與免疫病理、腸道屏障受損及腸道菌群失調(diào)等因素密切相關(guān)[9]。本研究發(fā)現(xiàn):高脂飲食組的小鼠腸組織發(fā)生不同程度的病理改變,D-LA升高,ZO-1、Claudin-1的相對(duì)表達(dá)量發(fā)生變化。Xu等[10]發(fā)現(xiàn):WT小鼠在高脂飲食下,緊密連接蛋白ZO-1、Claudin-1的mRNA下降,提示腸黏膜屏障損傷;與本研究發(fā)現(xiàn)的高脂飲食下PtenCKO小鼠緊密連接蛋白ZO-1的mRNA表達(dá)水平異常升高的結(jié)果不一致,需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探討。也有研究顯示:ZO-1在肝癌患者中的表達(dá)水平較健康人群升高[11],而PtenCKO小鼠最終將自發(fā)發(fā)展為肝癌[12]。D-LA是腸道細(xì)菌的代謝產(chǎn)物,當(dāng)腸道屏障受損而導(dǎo)致腸黏膜屏障通透性增加時(shí),D-LA活性增高,提示腸道屏障完整性的缺失可能推動(dòng)了肝臟炎癥和NASH病程進(jìn)展。腸道菌群易受膳食影響。本研究發(fā)現(xiàn):高脂飲食對(duì)腸道菌群影響顯著,小鼠腸道菌群豐度及多樣性均減少。LEfSe分析顯示:高脂飲食主要引起B(yǎng)acteroides屬、Parabacteoides屬、Enterococcus屬、Enterorhabdus屬、Desulfovibrionaceae屬、Escherichia屬和Escherichia-Shigella屬等腸道致病菌和條件致病菌豐度增加,而Lactobacillus屬、Butyricicoccus屬等腸道有益菌豐度降低。與WT小鼠相比,高脂飲食下PtenCKO小鼠Alloprevotella屬增加,Odoribacter屬降低。研究顯示:Prevotellacea 科[13]、Odoribacter屬[14]在NASH患者中豐度較低。Alloprevotella屬隸屬于Prevotellaceae科,Prevotellaceae科主要為琥珀酸產(chǎn)生菌,Odoribacter屬主要為琥珀酸消耗菌,均與腸道琥珀酸代謝相關(guān);在體內(nèi)琥珀酸濃度受肥胖、糖耐量受損等影響,琥珀酸濃度失衡是機(jī)體缺氧和炎癥下局部應(yīng)激和免疫危險(xiǎn)的代謝信號(hào)。此外,腸道內(nèi)的產(chǎn)短鏈脂肪酸菌,如產(chǎn)丁酸梭菌屬等可以增加和輔助Tregs細(xì)胞的歸巢和分化,對(duì)維持免疫穩(wěn)態(tài)具有重要作用[15]。可見(jiàn),高脂飲食會(huì)降低腸道有益菌豐度,增加有害菌豐度,造成菌群失調(diào),免疫功能紊亂,加劇病程。

        PTEN具有維持Tregs細(xì)胞穩(wěn)定的作用。研究顯示:PTEN缺失或抑制等情況下,Tregs細(xì)胞具有促進(jìn)脂肪酸氧化磷酸化的作用,F(xiàn)oxP3是維持和控制Tregs發(fā)育和功能的主要轉(zhuǎn)錄因子之一,可以促使Tregs對(duì)脂肪酸的利用,防止脂質(zhì)毒性[16]。本研究發(fā)現(xiàn):高脂飲食下,PtenCKO小鼠肝損傷嚴(yán)重,病理表型為嚴(yán)重NASH,其肝臟及腸系膜淋巴結(jié)Tregs細(xì)胞比例較野生型明顯升高。與Wang等[17]發(fā)現(xiàn)膽堿蛋氨酸缺乏和高脂飼料同時(shí)喂食下NASH小鼠肝臟Tregs細(xì)胞比例增高的結(jié)果一致。WT小鼠因?yàn)榘Y狀輕微,病理表型為單純性脂肪變性,肝臟免疫細(xì)胞Tregs比例下降,但趨勢(shì)不明顯,這可能與本研究造模時(shí)間較短有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)CD8+T細(xì)胞百分比在PtenCKO小鼠肝臟和腸系膜淋巴結(jié)中趨勢(shì)變化不一致,尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

        綜上,本研究綜合運(yùn)用PtenCKO小鼠及高脂造模證實(shí)高脂飲食會(huì)加重PtenCKO小鼠的肝損傷,腸黏膜屏障受損,免疫細(xì)胞Tregs比例失衡及腸道菌群失調(diào),這些因素共同加劇了遺傳易感小鼠肝臟炎癥反應(yīng)和NASH病程進(jìn)展。本研究為進(jìn)一步闡明NASH炎癥發(fā)展機(jī)制,以及探索潛在的作為NASH病情評(píng)估的生物標(biāo)志物或治療方法提供了參考依據(jù)。

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