徐健 楊琦 吳翠暉 段鴻露

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，已成為全球癌癥相關(guān)性死亡的主要原因[1]。2018年，全球新增肺癌病例約210萬(wàn)，相關(guān)死亡病例約180萬(wàn)[2]。肺腺癌（lung adenocarcinoma,LUAD）是肺癌最常見類型，約占肺癌總病例的40%[3]。盡管早期診斷和治療取得了顯著進(jìn)展，但5年相對(duì)總生存率低于20%[4]。免疫療法被譽(yù)為L(zhǎng)UAD的創(chuàng)新治療策略。但有限的臨床療效、缺乏有效的預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物等因素限制了其更廣泛的臨床應(yīng)用。有研究報(bào)道：腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等與腫瘤免疫治療的療效和預(yù)后密切相關(guān)[5-6]。因此，明確腫瘤-免疫相互作用的免疫表型，尋找新的LUAD免疫治療靶點(diǎn)非常迫切。拓?fù)洚悩?gòu)酶2-α（topoisomeraseⅡalpha,TOP2A）是一種控制DNA拓?fù)渥兓?、染色體分離、冷凝和染色體形成的酶。研究發(fā)現(xiàn)：TOP2A已成為阿霉素、依托泊苷等化療藥物的主要靶點(diǎn)[7-8]，但其抑制和殺傷細(xì)胞的確切機(jī)制尚不明確[9]。TOP2A在腎上腺皮質(zhì)癌、鼻咽癌等多種癌組織中高表達(dá)，本研究利用多種生物信息學(xué)工具對(duì)TOP2A進(jìn)行多角度分析，以期探明其在LUAD中的表達(dá)及其對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移等作用的內(nèi)在機(jī)制，為L(zhǎng)UAD患者的預(yù)后生物標(biāo)志物和新的潛在生物靶點(diǎn)候選提供參考。

1 材料和方法

1.1 Oncomine[10]數(shù)據(jù)庫(kù)及檢測(cè)指標(biāo) 利用Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.oncomine.org）檢測(cè)不同類型癌組織與正常組織中TOP2A表達(dá)差異。

1.2 GEPIA[11]數(shù)據(jù)庫(kù)及檢測(cè)指標(biāo) 利用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)（http://gepia.cancer-pku.cn/）檢測(cè)TOP2A在LUAD中的表達(dá)水平。

1.3 GEO[12]數(shù)據(jù)庫(kù)及檢測(cè)指標(biāo) 利用GEO數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中 GSE31210數(shù)據(jù)集分析TOP2A在LUAD中的表達(dá)水平。

1.4 Ualcan[13]數(shù)據(jù)庫(kù)及檢測(cè)指標(biāo) 利用Ualcan數(shù)據(jù)庫(kù)（http://ualcan.path.uab.edu/analysis.html）提供的基因表達(dá)和生存曲線的圖表，分析LUAD不同臨床病理特征中TOP2A表達(dá)差異。

1.5 Kaplan-Meier Plotter[14]數(shù)據(jù)庫(kù)及檢測(cè)指標(biāo) 將患者樣本中TOP2A按中位表達(dá)分為兩組（高表達(dá)和低表達(dá)），利用Kaplan-Meier生存曲線（https://kmplot.com/analysis/index.php）評(píng)估TOP2A表達(dá)對(duì)LUAD預(yù)后的影響。

1.6 HPA[15]數(shù)據(jù)庫(kù)及檢測(cè)指標(biāo) 利用HPA數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.proteinatlas.org/）分析TOP2A在LUAD組織和正常組織中的蛋白表達(dá)差異。

1.7 cBioPortal[16]數(shù)據(jù)庫(kù)及檢測(cè)指標(biāo) 利用cBioPortal數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.cbioportal.org/）獲取TOP2A突變信息及其對(duì)LUAD預(yù)后的影響。

1.8 TIMER[17]數(shù)據(jù)庫(kù)及檢測(cè)指標(biāo) 利用TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)（https://cistrome.shinyapps.io/timer/）分析TOP2A在不同類型癌組織中的表達(dá)，分析LUAD中TOP2A表達(dá)與免疫細(xì)胞（B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞）浸潤(rùn)的相關(guān)性。

1.9 TISIDB[18]數(shù)據(jù)庫(kù)及檢測(cè)指標(biāo) 利用TISIDB數(shù)據(jù)庫(kù)（http://cis.hku.hk/TISIDB/）分析TOP2A的表達(dá)與趨化因子和免疫檢查點(diǎn)調(diào)節(jié)劑基因表達(dá)的關(guān)系，以|r|作為確定TOP2A表達(dá)對(duì)免疫系統(tǒng)影響的標(biāo)準(zhǔn)，|r|為相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值。|r|＞0.1認(rèn)為TOP2A表達(dá)對(duì)免疫系統(tǒng)有影響；按照|r|大小排序，選取排序前6個(gè)基因。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 Oncomine、GEPIA、GEO、Ualcan、HPA、cBioPortal、TIMER和TISIDB等數(shù)據(jù)庫(kù)分析通過在線工具進(jìn)行，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。利用Kaplan-Meier Plotter工具生成生存曲線，采用HR、95%CI和log-rankP值描述結(jié)果；采用Spearman秩相關(guān)分析評(píng)估基因表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平、趨化因子和免疫檢查點(diǎn)調(diào)節(jié)劑基因的相關(guān)性，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TOP2A在不同類型癌組織中的表達(dá) Oncomine和TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)TOP2A在不同癌組織及正常組織中表達(dá)的分析結(jié)果表明：相比正常組織，TOP2A在肺癌、膀胱癌、乳腺癌、膽管癌等多種癌組織中高表達(dá)（均P＜0.05）。見圖1。

圖1 TOP2A在不同類型癌組織中的表達(dá)（a：Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)；b：TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)）

2.2 不同數(shù)據(jù)庫(kù)中TOP2A在LUAD中和正常組織中的表達(dá)差異 Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)顯示：有9個(gè)研究發(fā)現(xiàn)TOP2A在LUAD中表達(dá)上調(diào)。對(duì)各數(shù)據(jù)集的合并分析顯示：TOP2A的表達(dá)中位數(shù)為30（P＜0.05）。Ualcan、GEPIA及GEO數(shù)據(jù)庫(kù)顯示：與正常組織相比，TOP2A在LUAD中顯著過表達(dá)（均P＜0.05）。見圖2。

圖2 TOP2A在LUAD和正常組織中的表達(dá)（a：Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)；b：Ualcan數(shù)據(jù)庫(kù)；c：GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)；d：GEO數(shù)據(jù)庫(kù)）

2.3 TOP2A在不同臨床病理特征LUAD中的表達(dá)差異 Ualcan數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)：與正常組相比，LUAD患者TOP2A在不同人種、性別、年齡、吸煙史等臨床病理特征中的表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。具體表現(xiàn)為：男性LUAD患者TOP2A表達(dá)高于女性患者，吸煙LUAD患者高于非吸煙者或戒煙者，戒煙＞15年患者TOP2A高于戒煙＜15年者。對(duì)不同LUAD臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況患者TOP2A表達(dá)差異的分析顯示：與正常組相比，各臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），各臨床分期之間TOP2A表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但N3期TOP2A表達(dá)高于N0期及N1期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3。

圖3 TOP2A在LUAD不同臨床病理特征中的表達(dá)（a：不同年齡；b：不同性別；c：不同種族；d：不同吸煙習(xí)慣；e：不同分期；f：不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況）

2.4 TOP2A過表達(dá)對(duì)LUAD患者總生存的影響 TOP2A過表達(dá)與LUAD患者總生存率的下降顯著相關(guān)（均P＜0.05），與不同性別患者生存率低顯著相關(guān)（均P＜0.05），但與不同吸煙習(xí)慣人群生存率均無(wú)顯著相關(guān)性（均P＞0.05）。見圖4。

圖4 TOP2A表達(dá)對(duì)LUAD生存率的影響（a：總生存率；b：男性患者生存率；c：女性患者生存率；d：吸煙患者生存率；e：不吸煙患者生存率）

2.5 TOP2A蛋白在LUAD中的表達(dá) HPA數(shù)據(jù)庫(kù)顯示：和正常組織相比，LUAD中TOP2A蛋白表達(dá)明顯升高。見圖5。

圖5 TOP2A蛋白在LUAD中的表達(dá)（a和b：正常肺組織；c和d：LUAD組織）

2.6 TOP2A在LUAD中的突變情況 TOP2A在LUAD患者中的基因突變率達(dá)2.6%；TOP2A突變組中，縫隙連接蛋白δ3（gap junction protein delta 3,GJD3）、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白4（insulin like growth factor binding protein 4,IGFBP4）、細(xì)胞分裂周期 6（cell divi-sion cycle 6,CDC6）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶12（cyclin dependent kinase 12,CDK12）、鐵硫簇結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白 3（CDGSH iron sulfur domain 3,CISD3）、DExD-box解旋酶 52（DExD-box helicase 52,DDX52）、延長(zhǎng)蛋白BC和多梳抑制復(fù)合體2相關(guān)蛋白（elongin BC and polycomb repressive complex 2 associated protein,EPOP）、焦孔素A（gasdermin A,GSDMA）、IKAROS家族鋅指蛋白3（IKAROS family zinc finger 3,IKZF3）、LIM和SH3蛋白1（LIM And SH3 protein 1,LASP1）等基因也存在突變。TOP2A基因突變能明顯降低患者總生存率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖6。

圖6 TOP2A基因在LUAD中的突變情況（a：TOP2A突變率；b：TOP2A共同突變基因；c：TOP2A突變對(duì)生存率的影響）

2.7 TOP2A表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的關(guān)系 TOP2A表達(dá)與 B細(xì)胞浸潤(rùn)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.104，P＜0.05），與CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)均呈正相關(guān)（r=0.110，0.165，均P＜0.05）。見圖7。

圖7 LUAD中TOP2A表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)性

2.8 TOP2A表達(dá)與趨化因子和免疫檢查點(diǎn)調(diào)節(jié)劑基因的相關(guān)性 TOP2A與趨化因子7（C-C motif chemokine ligand 7,CCL7）、CCL26、C-X-C基序趨化因子配體10（C-X-C motif chemokine ligand 10,CXCL10）等趨化因子正相關(guān)（均P＜0.05），與CCL14、CXCL16、CCL17等均呈負(fù)相關(guān)（均P＜0.05）。見圖8（插頁(yè)）。TOP2A顯著相關(guān)免疫檢查點(diǎn)調(diào)節(jié)劑包括免疫增強(qiáng)性和免疫抑制性。TOP2A與CD40配體（CD40 ligand,CD40LG）、IL-6受體（interleukin 6 receptor,IL-6R）、跨膜蛋白173（transmembrane protein 173,TMEM173）、腫瘤壞死因子受體超家族成員14（TNF receptor superfamily member 14,TNFRSF14）、TNFSF13等免疫增強(qiáng)劑基因呈負(fù)相關(guān)，與脊髓灰質(zhì)炎病毒受體（poliovirus receptor,PVR）基因呈正相關(guān)。見圖9（插頁(yè)）。TOP2A與腺苷A2a受體（adenosine receptor A2a,ADORA2A）、B和T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白（B-and T-lymphocyte-associated protein,BTLA）、半乳糖凝集素9（galectin 9,LGALS9）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 Beta 1（transforming growth factor Beta 1,TGFB1）等免疫抑制劑基因呈負(fù)相關(guān)，與表面抗原分化簇274（cluster of differentiation 274,CD274）分子、淋巴細(xì)胞激活物3（lymphocyteactivating 3,LAG3）等基因呈正相關(guān)。見圖10（插頁(yè)）。

圖8 LUAD中TOP2A表達(dá)與趨化因子的相關(guān)性（a：CXCL10；b：CCL26；c：CCL7；d：CCL14；e：CXCL16；f：CCL17）

圖9 LUAD中TOP2A與免疫刺激劑基因的相關(guān)性（a：TNFSF13；b：TMEM173；c：CD40LG；d：TNFRSF14；e：IL6R；f：PVR）

圖10 LUAD中TOP2A與免疫抑制劑基因的相關(guān)性（a：LAG3；b：CD274；c：LGALS9；d：TGFB1；e：ADORA2A；f：BTLA）

3 討論

TOP2A在轉(zhuǎn)錄過程中調(diào)控DNA的拓?fù)錉顟B(tài)，參與染色體凝聚和染色單體的分離。在多種癌癥中，TOP2A表達(dá)水平升高提示預(yù)后較差[7，19]。肺癌是致死率第一的惡性腫瘤，其存活時(shí)間很大程度上取決于診斷時(shí)的階段。然而，40%～60%的肺癌患者直到晚期才被診斷出來(lái)[20]。因此很有必要尋找肺癌新的標(biāo)志物，力爭(zhēng)早期診斷，提高患者生存率。TOP2A表達(dá)和功能在LUAD中報(bào)道相對(duì)較少，其潛在作用機(jī)制仍不明確。

本研究通過查詢Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)：TOP2A在大部分癌組織中表達(dá)均增高，可能是共同的腫瘤標(biāo)志物。對(duì)Ualcan、GEPIA、GEO等數(shù)據(jù)庫(kù)的單個(gè)研究和Oncomine多個(gè)研究合并分析均證實(shí)：TOP2A在LUAD中表達(dá)高于正常對(duì)照組?？梢奣OP2A的表達(dá)具有較高的敏感度，有望成為L(zhǎng)UAD新的生物標(biāo)志物。Zeng等[19]研究發(fā)現(xiàn)：TOP2A與膀胱移行細(xì)胞癌臨床病理特征相關(guān)。本研究通過Ualcan數(shù)據(jù)庫(kù)查詢發(fā)現(xiàn)：LUAD中的TOP2A表達(dá)水平與臨床病理特征（如年齡、種族、性別、吸煙、疾病分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移）密切相關(guān)。由此推斷，TOP2A可作為L(zhǎng)UAD病情評(píng)估的生物標(biāo)志物。

本研究發(fā)現(xiàn)：相比低表達(dá)的LUAD患者，TOP2A高表達(dá)的患者總生存率下降；提示TOP2A高表達(dá)與總生存率降低相關(guān)，由此推測(cè)TOP2A可作為L(zhǎng)UAD的預(yù)后標(biāo)志物。與Kou等[21]認(rèn)為TOP2A在LUAD中起重要作用、可作為預(yù)后指標(biāo)和治療靶點(diǎn)的觀點(diǎn)一致。利用HPA數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)TOP2A蛋白表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示：LUAD中TOP2A蛋白表達(dá)水平和基因一致。

基因突變?cè)诎┌Y的發(fā)生和進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用[22-23]。本研究發(fā)現(xiàn)：TOP2A在LUAD中存在基因突變，突變組LUAD生存率明顯降低。TOP2A突變時(shí)伴有GJD3、IGFBP4、CDC6等基因共同突變，上述突變基因可能和突變的TOP2A共同促進(jìn)LUAD發(fā)展。

機(jī)體免疫功能在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，腫瘤的免疫治療和臨床結(jié)果依賴于免疫細(xì)胞浸潤(rùn)。對(duì)TOP2A與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)：TOP2A的表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)密切相關(guān)，這可能是TOP2A影響預(yù)后的機(jī)制。提示TOP2A可作為潛在的診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物，并可作為新的免疫相關(guān)治療靶點(diǎn)。Chen等[24]認(rèn)為TOP2A是LUAD預(yù)后的關(guān)鍵標(biāo)志物，可能成為免疫治療的靶點(diǎn)，與本研究觀點(diǎn)一致。

趨化因子通過介導(dǎo)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)，調(diào)節(jié)腫瘤免疫和腫瘤生物學(xué)表型[25]。本研究發(fā)現(xiàn)：TOP2A表達(dá)與CCL7、CCL14、CXCL16等趨化因子相關(guān)。血清CXCL16是判斷非小細(xì)胞肺癌療效的潛在生物標(biāo)志物，通過調(diào)控NF-κB通路促進(jìn)肺癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[26]。由此可推測(cè)TOP2A可能通過免疫反應(yīng)影響LUAD的生物學(xué)行為，如免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)和趨化因子的表達(dá)。

腫瘤微環(huán)境由包括免疫檢查點(diǎn)在內(nèi)的多種因素參與。免疫檢查點(diǎn)表達(dá)異?？赡軐?dǎo)致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，促進(jìn)腫瘤免疫逃逸。對(duì)TOP2A和不同免疫檢查點(diǎn)調(diào)節(jié)劑基因關(guān)系的研究發(fā)現(xiàn)：不同種類的免疫檢查點(diǎn)調(diào)節(jié)劑基因，如CD40LG、PVR、ADORA2A、CD274等與TOP2A表達(dá)相關(guān)，可能參與了TOP2A在LUAD中的生物過程，提示TOP2A可能通過調(diào)節(jié)免疫檢查點(diǎn)來(lái)影響腫瘤生物學(xué)。

綜上所述，TOP2A是LUAD重要的調(diào)節(jié)因子，可能在免疫細(xì)胞浸潤(rùn)中發(fā)揮重要作用，可作為預(yù)后的生物標(biāo)志物，也可能是LUAD治療的重要靶點(diǎn)。但由于在線數(shù)據(jù)庫(kù)的局限性、數(shù)據(jù)庫(kù)樣本容量不同導(dǎo)致的結(jié)果偏差在所難免；同時(shí)研究是基于不同在線數(shù)據(jù)庫(kù)分析而來(lái)，可能存在選擇性偏倚。后續(xù)需要更深入的實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證TOP2A在LUAD中的價(jià)值。