侯秋苑，馮白茹，申 茹，梁 可，莫穎華，毛一中

(惠州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)系，廣東 惠州 516025)

理沖湯出自清末名醫(yī)張錫純所著《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》上冊(cè)，方中包含生黃芪、黨參、白術(shù)、生山藥、天花粉、知母、三棱、莪術(shù)、生雞內(nèi)金九味藥，具有益氣行血，調(diào)經(jīng)祛瘀之功效[1]。經(jīng)現(xiàn)代臨床研究表明，理沖湯對(duì)子宮肌瘤、慢性盆腔炎、閉經(jīng)、不孕癥、卵巢早衰、多囊卵巢綜合征等疾病[2-9]的療效確切，不良反應(yīng)較小，是臨床常用的基礎(chǔ)方。但理沖湯在臨床應(yīng)用中出現(xiàn)不便，如湯劑煎煮耗時(shí)，服用麻煩，不易攜帶和長時(shí)間儲(chǔ)存等[10]，經(jīng)檢索發(fā)現(xiàn)目前國內(nèi)外未見有關(guān)于理沖湯的提取工藝的研究報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)采用單因素和正交試驗(yàn)等方法對(duì)理沖湯的提取工藝進(jìn)行優(yōu)選，以為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

LC-16高效液相色譜儀(島津儀器有限公司)；KQ-250超聲波清潔機(jī)(昆山超聲儀器有限公司)；SHZ-D(III)型循環(huán)水真空泵(廣州市星爍儀器有限公司)；BWS-20恒溫水槽水浴鍋(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；TC-15套式恒溫器(海寧市新華醫(yī)療器械廠)；XS205分析天平(METTLER TOLEDO)。

1.2 試藥

生黃芪(甘肅)、黨參(甘肅)、白術(shù)(安徽)、生山藥(河南)、天花粉(河北)、知母(安徽)、三棱(浙江)、莪術(shù)(廣西)、生雞內(nèi)金(山東)均購自惠州市大參林藥店有限公司。新芒果苷對(duì)照品(北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：190910，純度≥98 %)；芒果苷對(duì)照品(北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：200116，純度≥98 %)；毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品(北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：190716，純度≥98 %)；乙醇(食用級(jí)，惠州市金利達(dá)貿(mào)易有限公司)；水為超純水，其他試劑為分析純。

2 方法

2.1 含量測(cè)定方法

2.1.1 色譜條件

資生堂CAPCELL PAK C18 MG色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：0.1 %磷酸(A)：乙腈(B)梯度洗脫(0 min～5 min，10 %B；5 min～10 min，10 %～12 %B；10 min～20 min，12 %～18 %B；20 min～30 min，18 %～26 %B；30 min～35min，26 %～33 %B；35 min～40min，33 %～55 %B；40 min～45 min，55 %～95 %B；45 min～47 min，95 %～50 %B；47 min～50 min，50 %～10 %B；50 min～55 min10 %B)；檢測(cè)波長：260 nm；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。

2.1.2 對(duì)照品溶液制備

準(zhǔn)確稱取新芒果苷對(duì)照品10.6 mg、芒果苷對(duì)照品8.0 mg，毛蕊異黃酮葡萄糖苷6.8 mg，置10 mL容量瓶中，用85 %乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，置4 ℃冰箱避光保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.3 陰性樣品溶液制備

取不含黃芪或知母的1/3處方量藥材粗粉，85 %乙醇回流提取3次，每次1.5 h，過濾。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確量取新芒果苷、芒果苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、對(duì)照品儲(chǔ)備液，分別配置成720.8 μg/mL、360.4 μg/mL、180.2 μg/mL、90.1 μg/mL、45.05 μg/mL、22.53 μg/mL的新芒果苷對(duì)照品溶液，800.0 μg/mL、400.0 μg/mL、200.0 μg/mL、100.0 μg/mL、50.0 μg/mL、25.0 μg/mL、10.0 μg/mL的芒果苷對(duì)照品溶液和26.15 μg/mL、13.05 μg/mL、6.528 μg/mL、3.264 μg/mL、1.632 μg/mL、0.816 μg/mL、0.408 μg/mL、0.204 μg/mL的毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品溶液。準(zhǔn)確吸取上述溶液10 μL，按上述色譜條件進(jìn)樣行測(cè)定，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)、峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸。

2.1.5 專屬性試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液、理沖提取溶液和陰性樣品溶液10 μL，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣，記錄。

2.2 醇提工藝

2.2.1 提取方法考察

①回流提取法[10]：稱取1/3處方量(生黃芪9 g、黨參6 g、白術(shù)6 g、生山藥15 g、天花粉12 g、知母12 g、三棱9 g、莪術(shù)9 g、生雞內(nèi)金9 g)藥材粗粉，用10倍量體積分?jǐn)?shù)為85 %的乙醇回流提取1次，每次1 h，濾過。

②超聲輔助提取法[10]：稱取1/3處方量藥材粗粉，用10倍量體積分?jǐn)?shù)為85 %的乙醇，超聲1 h，濾過。

③冷浸法[10]：稱取1/3處方量稱取1/3處方量藥材粗粉用10倍量體積分?jǐn)?shù)為85 %的乙醇，浸漬48 h，濾過。

④將上述濾液進(jìn)樣測(cè)定，因黃芪為方中主藥，評(píng)分時(shí)設(shè)置毛蕊異黃酮葡萄糖苷的權(quán)重為0.5，新芒果苷、芒果苷為0.25。計(jì)算綜合評(píng)分。

2.2.2 溶劑濃度的考察

按1/3處方量稱取理沖湯藥材粗粉，分別用體積分?jǐn)?shù)為55 %、65 %、75 %、85 %、95 %的乙醇對(duì)藥材進(jìn)行回流提取，C(mL/g)=V乙醇∶m藥材=10∶1，80 ℃水浴1 h，過濾取濾液，進(jìn)樣測(cè)定。

2.2.3 正交試驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)采用體積分?jǐn)?shù)為85 %的乙醇為提取溶劑，采用回流提取法提取理沖湯中的有效成分。通過文獻(xiàn)研究[10-11]和預(yù)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)提取時(shí)間(A)、提取次數(shù)(B)及液固比(C)三個(gè)因素對(duì)提取效率影響較大，根據(jù)生產(chǎn)需要，以綜合評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，按L9(34)表正交試驗(yàn)，因素水平見表1。

表1 因素水平表

2.3 水提工藝

參考相關(guān)文獻(xiàn)[11]，取醇提后藥渣，以液固比(A)、提取時(shí)間(B)及提取次數(shù)作為因素，以干膏率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，按L9(34)表正交試驗(yàn)，因素水平見表2。

表2 因素水平表

3 結(jié)果

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與專屬性

新芒果苷、芒果苷及毛蕊異黃酮葡萄糖苷的線性結(jié)果見表3，專屬性考察結(jié)果見圖1。由此可得，三個(gè)對(duì)照品在各自范圍內(nèi)的線性關(guān)系較好，分離度高，陰性結(jié)果無干擾。

表3 線性關(guān)系考察結(jié)果

A.對(duì)照品；B.供試品；C.知母陰性樣品；D.黃芪陰性樣品1.新芒果苷(Neomangiferin)；2.芒果苷(Mangiferin)；3.毛蕊異黃酮葡萄糖苷(Calycosin-7-glucoside)圖1 專屬性考察結(jié)果

3.2 醇提工藝

3.2.1 提取方法和提取溶劑

提取方法結(jié)果見表4，提取溶劑濃度考察結(jié)果見表5，結(jié)果表明回流提取法的綜合評(píng)分遠(yuǎn)高于另兩種方法，體積分?jǐn)?shù)為85 %的乙醇提取效果最佳，故本實(shí)驗(yàn)選擇回流提取法為理沖湯的提取方法，體積分?jǐn)?shù)為85 %的乙醇為提取溶劑。

表4 提取方法考察結(jié)果

表5 溶劑濃度考察結(jié)果

3.2.2 正交試驗(yàn)

正交試驗(yàn)結(jié)果見表6，方差分析見表7。由表6可以看出，影響提取效果的各因素大小順序?yàn)椋築>A>C，即提取次數(shù)的影響程度最高，共次是提取時(shí)間，最小的是液固比影響；由表7可知，提取次數(shù)、提取時(shí)間及液固比對(duì)綜合評(píng)分均沒有顯著性影響。優(yōu)選最佳條件是提取條件應(yīng)為A3B3C1，即每次提取1.5 h，提取3次，液固比8：1。將處方量藥材放大5倍[12]，按優(yōu)化工藝進(jìn)行回流提取，進(jìn)行3批驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果表明該工藝穩(wěn)定可行。

表6 正交試驗(yàn)方案及結(jié)果

表7 方差分析

3.3 水提工藝

正交試驗(yàn)結(jié)果見表8。影響提取結(jié)果的因素順序?yàn)椋篊>B>A，即提取次數(shù)的影響程度較大，提取時(shí)間第二，液固比影響最小。優(yōu)選提取條件應(yīng)為A3B3C3，但是A、B因素中的k3和k2相差甚小，從節(jié)省資源的角度考慮，選擇最優(yōu)提取工藝條件為A2B2C3，即液固比10：1，每次提取1 h，提取3次。將處方量藥材放大5倍，按優(yōu)化工藝進(jìn)行水煎煮，進(jìn)行3批驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果表明該工藝穩(wěn)定可行。

表8 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

4 討論

理沖湯由生黃芪、黨參、白術(shù)、生山藥、天花粉、知母、三棱、莪術(shù)、生雞內(nèi)金九味藥組成，研究[12]-[16]表明知母中含有的新芒果苷具有抗病毒、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗炎及抗腫瘤等藥效、芒果苷具有降血糖、抗炎、抗腫瘤、抑菌等藥理作用，而黃芪藥材中的毛蕊異黃酮葡萄糖苷具有明顯的抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、抑制黑色素形成和免疫調(diào)節(jié)活性等作用，均與理沖湯治療子宮肌瘤、慢性盆腔炎等疾病相關(guān)，故本實(shí)驗(yàn)選擇新芒果苷、芒果苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷作為理沖湯提取工藝的評(píng)價(jià)指標(biāo)，經(jīng)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)上述三種成分在醇提物的含量遠(yuǎn)高于水提物，且有文獻(xiàn)說明[17-18]莪術(shù)乙醇提取物、三棱中的黃酮類成分具有抗腫瘤作用，選擇先對(duì)理沖湯的醇提工藝進(jìn)行了優(yōu)選，優(yōu)選的最佳方案是以體積分?jǐn)?shù)為85 %的乙醇為提取溶劑，每次提取1.5 h，提取3次，液固比8：1。

另有研究[19]-[25]表明理沖湯處方中的九種藥材大多數(shù)含有多糖、氨基酸、微量元素等成分，多糖類成分多具有抗腫瘤作用，而多糖類成分多用熱水浸提法提取，且上述文獻(xiàn)也表明方中各藥材的水提物還具有增強(qiáng)免疫活性、降糖、降血脂、抗腫瘤、抗炎等作用，因此本實(shí)驗(yàn)選擇醇提后再繼續(xù)水提，以出膏率為評(píng)價(jià)指標(biāo)將理沖湯中的有效成分盡可能地提取出來，最后優(yōu)選的水提工藝為每次提取1 h，提取3次，液固比10：1。