柯林楠 宋茂謙 高敏 陸云龍 母瑞紅*

1 中國食品藥品檢定研究院 （北京 100050）

2 江陰貝瑞森生化技術(shù)有限公司 （江蘇 無錫 214437）

內(nèi)容提要： 目的：建立高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC）鑒別檢測貽貝黏蛋白（Mussel Adhesive Protein，MAP）的方法。方法：采用Agilent Zobax SB 300A C8（4.6×250mm，5μm）色譜柱，流動相為0.1%三氟乙酸水溶液（A）和含0.1%三氟乙酸乙腈溶液（B）梯度洗脫，檢測波長280nm，洗脫溫度25°C，流量為0.9mL/min。進(jìn)樣量20μL?？疾旆椒ǖ南到y(tǒng)適用性、線性、精密度、檢測限及定量限。結(jié)果：貽貝黏蛋白供試樣品與對照品的HPLC圖譜一致。貽貝黏蛋白在0.01～9.79mg/mL范圍內(nèi)峰面積與其濃度呈良好的線性關(guān)系(r=1)，峰面積及保留時間RSD均小于5%，最低定量限（LOQ）為0.03mg/mL，最低檢出限（LOD）為0.01mg/mL。結(jié)論：該方法專屬性強(qiáng)，穩(wěn)定性好，簡單易用，適用貽貝黏蛋白的檢測。

貽貝是一種能在淡水和海洋環(huán)境中附著在如巖石、船體、纜繩等固體表面上和生物表面的海洋生物，可以分泌一種具有卓越黏附性的蛋白質(zhì)，即貽貝黏蛋白（Mussel Adhesive Protein，MAP）。貽貝黏蛋白具有多巴胺特殊的組成和結(jié)構(gòu)以及優(yōu)良的黏附特性，其黏合范圍廣、耐海水腐蝕、強(qiáng)度高、生物親和性良好，可作為環(huán)境友好型膠黏劑，應(yīng)用于帶水條件下的黏合，該特性在醫(yī)療領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。韓國科學(xué)家借鑒貽貝能在水下附著的原理，已經(jīng)研制出一種光活化的以貽貝蛋白為基礎(chǔ)的生物膠黏劑[1]。美國西北大學(xué)的研究人員正在開發(fā)一種與眾不同的源自貽貝蛋白的涂層，用于改良醫(yī)用植入物的生物相容性，并能更好地防止危及生命的血栓和細(xì)菌感染[2]。我國貽貝黏蛋白醫(yī)療器械、美容產(chǎn)品等領(lǐng)域的研發(fā)和在創(chuàng)面修復(fù)、肛腸黏膜損傷、皮膚敏感瘙癢等臨床的應(yīng)用已有報(bào)道[3-9]。

貽貝黏蛋白獲取方法主要是直接從貽貝足腺中提取天然黏附蛋白成分，因此，作為醫(yī)療產(chǎn)品時，貽貝黏蛋白的純度和含量是含貽貝黏蛋白的醫(yī)療器械質(zhì)量控制的關(guān)鍵技術(shù)指標(biāo)，開發(fā)精準(zhǔn)的測量方法對產(chǎn)品質(zhì)量控制具有重要的意義。蛋白的測定方法通常有電泳法、分光光度法、高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）等。電泳法可通過分子量和分子結(jié)構(gòu)將貽貝黏蛋白與雜蛋白分離進(jìn)行定性和定量，但操作復(fù)雜；而分光光度法因?qū)傩圆粡?qiáng)無法用于復(fù)雜體系中單體成分的測定。HPLC因具有分離效果好、分析速度快、樣品回收簡單、靈敏度高，方法靈活等特點(diǎn)，已廣泛地應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化妝品等多專業(yè)領(lǐng)域的檢測，但在貽貝黏蛋白純度檢測方面的應(yīng)用未見報(bào)道[10-13]。本研究采用HPLC方法對貽貝黏蛋白純度進(jìn)行檢測，以期為貽貝黏蛋白醫(yī)療產(chǎn)品質(zhì)量控制提供技術(shù)支持。

1.材料與方法

1.1 一般資料

供試樣品：由江蘇江陰貝瑞森生化技術(shù)有限公司生產(chǎn)，不同批次純化所得的貽貝黏蛋白半成品，在4～8 C下存儲。貽貝黏蛋白對照品：采用市售的高純度試劑作為本研究的對照品，MAP-04012，細(xì)胞培養(yǎng)級純度，濃度為1mg/mL乙酸水溶液，美國ACROBiosystems公司。

儀器設(shè)備：①高效液相色譜儀：島津LC-15C，包括泵送系統(tǒng)（LC-15C）、自動進(jìn)樣器（SIL-16）和探測器（SPD-15C），并配裝Labsolution軟件。②紫外可見分光光度計(jì)：UV-2401PC，島津公司，日本。

1.2 色譜條件

Agilent Zobax SB 300A C8（4.6×250mm）色譜柱。檢測波長280nm，洗脫溫度25°C，流速為0.9mL/min，進(jìn)樣量20μL。

2.結(jié)果與討論

2.1 色譜條件選擇

2.1.1 檢測波長

采用紫外可見分光光度計(jì)在200～900nm對貽貝黏蛋白溶液進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果如圖1所示。圖中顯示：在波長200～250nm范圍內(nèi)有較強(qiáng)吸收，但該范圍內(nèi)吸光度變化快，易存在溶劑干擾，影響檢測結(jié)果的穩(wěn)定性。在280nm處吸收較大且受溶劑干擾較小，因此，確定280nm為貽貝黏蛋白的HPLC分析方法的檢測波長。

圖1.貽貝黏蛋白溶液全波長掃描圖

2.1.2 流動相的選擇

貽貝黏蛋白分子上的羥基易與色譜介質(zhì)之間產(chǎn)生離子作用，造成色譜峰拖尾，通常在流動相中加入酸來抑制這種離子間作用。為測定提取液中的貽貝黏蛋白，考察了乙腈：水：乙酸、乙腈：水：磷酸和乙腈：水：三氟乙酸三種體系為洗脫劑，在1.2的液相色譜條件和梯度洗脫程序?yàn)?～8min時5%～12%B，8.01～20min時15%B，20.01～45min時15%～100%B的測試結(jié)果，對各流動相體系同一測試樣品的色譜峰峰形、分離狀況和保留時間等進(jìn)行了分析對比，選擇合適流動相體系。采用乙腈：水：乙酸體系為流動相時，樣品色譜峰峰形不對稱、分離情況不好；采用乙腈：水：磷酸體系為流動相時，樣品色譜峰峰形有所改善；采用乙腈：水：三氟乙酸體系為流動相時，樣品色譜峰峰形進(jìn)一步改善，對稱性好，目標(biāo)色譜峰的理論塔板數(shù)和分離狀況均優(yōu)于前兩種洗脫體系，選定乙腈：水：三氟乙酸體系，即0.1%三氟乙酸水溶液（A）和含0.1%三氟乙酸的乙腈溶液（B）為本研究的流動相。

2.1.3 系統(tǒng)適應(yīng)性

取1.0mg/mL對照品溶液按1.2色譜條件進(jìn)樣測定，保留時間29.4min，貽貝黏蛋白峰的拖尾因子（T）為1.12，反映了峰的對稱性較好。主峰及其鄰近峰的分辨率（Rs）為2.1，表明貽貝黏蛋白與其他蛋白質(zhì)的分離性較好。理論塔板數(shù)（N）為5015，表明塔柱效率較高。該方法系統(tǒng)適應(yīng)性符合《中華人民共和國藥典2015年版 四部》[14]HPLC的要求。

2.2 對照品與供試樣品的HPLC譜圖比較

精密量取貽貝黏蛋白濃度為1mg/mL的對照品溶液與供試樣品（MAP15041908，濃度1mg/mL）溶液在相同條件下進(jìn)行測定，所得的HPLC譜圖，如圖2所示。

圖2.供試樣品與對照品HPLC 譜圖（實(shí)線：供試樣品；虛線：對照品）

從圖中看出，供試樣品和對照品在保留時間、主峰位置和形狀一致，表明該峰為貽貝黏蛋白色譜峰。說明該方法對貽貝黏蛋白具有特異性，可以用于貽貝黏蛋白的檢測鑒定。

2.3 線性

貽貝黏蛋白原液：批號為16072315-A，純度為99.76，濃度為9.79mg/mL。

用0.005%的乙酸鹽溶液將純化的貽貝黏蛋白原液在0.01～9.79mg/mL范圍稀釋至不同濃度，制備成系列測試液進(jìn)行測定，記錄色譜圖，以濃度為橫坐標(biāo)（X），主要峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪制線性回歸曲線，圖3 所示，r2=1，斜 率=2.457e+006±2295，截 距=-25081±9110。表 明 在0.01～9.79mg/mL濃度范圍內(nèi)，峰面積和貽貝黏蛋白濃度呈良好的線性關(guān)系。

圖3.峰面積與貽貝黏蛋白濃度的關(guān)系圖

2.4 精密度

取貽貝黏蛋白半成品，記錄批號、濃度和純度，用0.005%的乙酸鹽溶液分別稀釋至1.5mg/mL作為供試液進(jìn)行測定，記錄純度、保留時間和峰面積，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果評價方法的精密度，測試結(jié)果的純度在標(biāo)稱純度的90%～110%范圍內(nèi)，RSD 應(yīng)＜5%，保留時間應(yīng)在29～31min，則符合該方法精密度要求。

2.4.1 重復(fù)性

供試貽貝黏蛋白樣品：批號為16050502-A，標(biāo)示純度為95%，濃度為11.17mg/mL。將供試樣品用0.005%的乙酸鹽溶液稀釋制備供試液，重復(fù)測定6次，結(jié)果見表1。結(jié)果顯示供試樣品純度平均值為96.4%，為標(biāo)示純度的101%，所有參數(shù)的RSD均＜5%，保留時間為30.1min，顯示該方法重復(fù)性良好。

表1.重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

2.4.2 重現(xiàn)性

通過測定同批次不同濃度的樣品和相同濃度不同批次的樣品的純度、保留時間的RSD值評價重現(xiàn)性。

同批次不同濃度樣品測定：將標(biāo)示純度99.76%，批號16072315-A的貽貝黏蛋白樣品，分別稀釋至0.5mg/mL，1.0mg/mL，1.5mg/mL進(jìn)行測定，結(jié)果：純度的RSD為3.6%，保留時間的RSD為0。

相同濃度不同批次樣品測定：分別將標(biāo)示純度99.76%，批號16072315-A；標(biāo)示純度97.98%，批號16070301-A；標(biāo)示純度91.2%，批號15042211-A的樣品稀釋至1.5mg/mL，進(jìn)行測定，結(jié)果：純度和保留時間RSD分別為1.26%和0.4%。

上述同一批號的樣品稀釋至不同的濃度，不同的批號稀釋至相同濃度，測定純度和保留時間的RSD值均低于5%，表明了該方法具有重現(xiàn)性。

良好的重復(fù)性和重現(xiàn)性測定結(jié)果表明：該方法精密度符合要求。

2.5 檢測限LOD和定量限LOQ

將空白樣本溶液注入6次進(jìn)行測定，得到的峰面積為噪聲值。LOD 為噪聲值的3 倍，而LOQ 為噪聲值的10 倍。結(jié)果為LOD為0.01mg/mL，而LOQ為0.03mg/mL。

2.6 穩(wěn)定性

通過微小的改變色譜條件對貽貝黏蛋白測定造成的影響來驗(yàn)證。本研究使用不同批次的流動相和不同的柱溫測試分別對樣品進(jìn)行分析，RSD均為零，表明了該方法具有穩(wěn)定性。

3.結(jié)論

建立的HPLC檢測貽貝黏蛋白純度方法，色譜分離好，專屬性強(qiáng)，穩(wěn)定性好，系統(tǒng)適應(yīng)性符合《中國藥典》HPLC的要求，方法簡便易行，適用于含貽貝黏蛋白類醫(yī)療器械中貽貝黏蛋白的鑒別檢測。