馬剛 丁方 胡錦婷 郭艷麗 安徽省食品藥品檢驗研究院 （安徽 合肥 230000）

內容提要： 目的：對羅氏的AMH試劑盒進行性能驗證，評估其是否滿足臨床應用。方法：參考美國臨床和實驗室標準協(xié)會（CLSI）的標準要求，制定方案，對羅氏AMH試劑盒的準確度、精密度、線性范圍、臨床可報道范圍、參考區(qū)間等性能進行驗證，比較廠家試劑盒說明書，評價其性能是否通過驗證。結果：準確度驗證其檢測結果與理論值的相對偏倚均在5%范圍以內，未超過廠家及臨床的允許范圍；試劑批內精密度均＜2.00%，均＜5.00%，符合廠家說明書要求；在廠家說明書0.01～23ng/mL的線性范圍內，試劑線性較好，符合臨床應用標準；試劑最大稀釋倍數(shù)為64倍，臨床最大可報告范圍濃度為1472ng/mL，最低檢測限為0.0011；參考范圍驗證表明檢測值均在廠家說明書提供的參考區(qū)間范圍內。結論：試劑盒的準確度、精密度、線性范圍、臨床可報道范圍、參考區(qū)間等性能符合廠家說明書所公布的性能，滿足臨床檢驗應用。

抗米勒管激素（Anti-MüLlerian Hormone，AMH）自1930年發(fā)現(xiàn)以來，其臨床檢測意義廣泛，主要包括以下幾點，AMH由卵巢分泌，與卵巢功能關聯(lián)緊密，最為典型的是它可以評估卵巢的儲備能力，直接反映女性的生育能力，其水平隨著年齡的增加而下降，其次AMH水平與卵巢早衰相關聯(lián)，是不孕癥診治的理想判斷指標[1-3]；同時，臨床中也應用于女性絕經(jīng)年齡預測、乳腺癌、多囊卵巢綜合征等疾病中的應用，因此AMH 的檢測至關重要[4,5]。國內臨床中AMH的檢測主要依靠于AMH檢測試劑盒，其試劑盒的性能與臨床中疾病的診治密切相關，因此試劑盒性能驗證具有必要性，本研究對羅氏生物AMH檢測試劑盒進行了試劑盒性能驗證分析，包括其準確度、精密度、線性范圍、臨床可報告范圍、參考區(qū)間等性能，分析改試劑盒性能是否良好，符合臨床使用標準。

1.資料與方法

1.1 臨床資料

健康人群血清樣本來自醫(yī)院體檢中心的健康體檢者，排除有感染、腫瘤、心腦血管疾病等重大疾病的體檢者，最終獲取20例健康體檢者血樣，樣本無溶血、脂血及黃疸等情況，其中男性11例，女性9例，血樣均為清晨空腹12h后采集的靜脈血5mL，4000r/min離心3min，取上清檢測并記錄健康體檢者的年齡、性別等基本信息。定值血清隨機采購羅氏高、中、低三個濃度范圍的定值血清各5支，血清濃度范圍0.01～23ng/mL，符合試劑廠家說明書濃度范圍。

1.2 儀器與試劑

試劑、校準品及質控品均采用羅氏公司生產的AMH配套試劑盒，按其說明書操作，用羅氏Cobas6000全自動免疫分析儀檢測、分析、統(tǒng)計數(shù)據(jù)。

1.3 測定方法

1.3.1 準確度驗證

采用廠家羅氏的AMH定值血清，編號分別為20210026、20210027、20210028、20210029，用于準確度性能測定，每支血清連續(xù)測定3次計算實測均值，與理論值比對，計算偏差和相對偏倚，其中偏差=實測均值-理論值，相對偏倚=偏差/理論值×100%，根據(jù)廠家說明書準確性的相對偏倚范圍＜10%，臨床應用要求試劑準確度相對偏倚范圍＜15%，判斷此試劑的準確度驗證是否通過。

1.3.2 精密度驗證

精密度驗證采用廠家的AMH水平定值血清及質控，分別為水平1、水平2定值血清、質控品1、質控品2，驗證分為批內精密度和批間精密度驗證，其中批內精密度驗證將水平1、水平2定值血清、質控品1、質控品2連續(xù)重復測定10次，計算各自批內均值、批內標準差、批內變異系數(shù)，其中變異系數(shù)（CV）=標準差/均值×100%，批間精密度采用3個不同批次的試劑，對水平1、水平2定值血清、質控品1、質控品2連續(xù)重復測定10次，計算3批試劑檢測的批間均值、批間標準差及其變異系數(shù)，根據(jù)廠家說明書批內精密度的2.00%，批間精密度5.00%的標準，臨床應用要求批內精密度、批間精密度＜10%的標準，判斷此試劑精密度是否符合要求。

1.3.3 線性范圍驗證

根據(jù)廠家說明書0.01～23ng/mL的線性范圍，選取接近線性上限和下限的高值（H）、低值（L）定值血清樣本，按0H:5L、1H:4L、2H:3L、3H:2L、4H:1L、5H:0L的比例梯度配制，計算其每個梯度的理論值，將每個梯度連續(xù)測定3次，計算實測均值，以實測均值為因變量，理論值為自變量，進行線性回歸分析，計算其回歸方程式，依據(jù)廠家說明書要求樣本濃度在0.046～16.5ng/mL范圍內線性r值＞0.976，在0.046～3.99ng/mL濃度范圍內線性r值＞0.966，臨床應用要求r值＞0.975時表明此濃度范圍內，試劑線性良好的標準，判斷試劑線性范圍是否符合標準。

1.3.4 臨床可報告范圍驗證

依據(jù)廠家的線性范圍，采用廠家的高值定值血清樣本，以4倍梯度，依次稀釋至4、16、64、256倍，將每個梯度依次連續(xù)重復測定3次，計算實測均值，相對偏倚，依據(jù)廠家相對偏倚＜10%的標準判斷各梯度測定是否有效，以高值血清濃度乘以最大有效稀釋倍數(shù)計算臨床可報告最大范圍濃度，采用低值質控品以4倍梯度，依次稀釋，每個梯度依次連續(xù)重復測定3次，計算實測均值，看最低檢測值是否在廠家試劑盒檢出限＜0.01ng/mL的范圍內。

1.3.5 參考區(qū)間驗證

隨機選取20個健康體檢人群血清樣本，每個人的AMH值重復測定3次，取實測均值，按說明書上給出的參考區(qū)間，依據(jù)記錄的健康體檢者的年齡、性別信息依次對應至說明書中的參考區(qū)間，判斷隨機抽選的人員測定濃度是否在參考區(qū)間內。

1.4 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)處理均采用Excel 2003軟件進行平均值、標準差、相對偏倚、變異系數(shù)及線性回歸分析。

2.結果

2.1 準確性驗證

通過標準品檢測結果可知，羅氏試劑的檢測結果與理論值的相對偏倚均在10%范圍以內，未超出廠家統(tǒng)計結果的允許范圍，因此試劑準確度性能驗證通過，詳見表1。

表1.準確性驗證

2.2 精密度驗證

水平1、水平2及試劑盒配套質控品1、質控品2批內精密度分別為1.1%、1.5%、1.06%、0.97%，均小于廠家說明書批內精密度的2%標準，符合要求，批間內精密度分別為2.7%、2.88%、3.46%、4.17%，均小于廠家說明書批間內精密度的5%標準，符合要求。見表2。

表2.精密度驗證結果(ng/mL)

2.3 線性范圍驗證

試劑盒線性范圍為0.01～23ng/mL，選定接近線性的高值和低值按比例稀釋，依次測定，每個梯度測定3次，取實測均值為因變量，理論值為自變量，計算線性回歸方程Y=0.986X-0.288（r2=0.998），符合廠家試劑說明書的要求，在0.01～23ng/mL濃度范圍線性較好。

2.4 臨床可報告范圍驗證

高值定值血清樣本按4倍梯度稀釋，通過3次測定，計算實測均值，測定結果表明高值樣本稀釋至256倍時，相對偏倚超出廠家范圍，因此試劑的最大稀釋比例為1:64，依據(jù)試劑線性范圍0.01～23ng/mL，試劑臨床最大可報告范圍上限為1472ng/mL，低值質控品依次稀釋，每個濃度檢測3次，結果顯示最低檢測限為0.0011，符合廠家試劑盒檢出限＜0.01ng/mL的要求。具體數(shù)據(jù)見表3。

表3.AMH臨床可報告范圍驗證

2.5 參考區(qū)間驗證

隨機抽取20例健康人群樣本檢測，其中男性9人，年齡35～78 歲，女性11 人，年 齡23～47 歲，男 性AMH 的測定濃度范圍為7.63～15.93ng/mL，女性測定的濃度范圍為5.11～12.17ng/mL，均在廠家的說明書參考區(qū)間范圍內。

3.討論

隨著社會的快節(jié)奏發(fā)展，高齡化產婦的比例不斷增加，多囊卵巢綜合征、卵巢早衰、卵巢腫瘤等卵巢疾病是育齡期女性常見的內分泌和代謝疾病，早期的預防與診斷，并配合治療，臨床中治療效果一般良好，一般提倡早發(fā)現(xiàn)、早治療[6,7]。相比于傳統(tǒng)的雌二醇、促卵泡激素、黃體生成素水平的檢測，AMH作為早期卵泡的直接產物，能夠發(fā)現(xiàn)并預測婦女卵巢儲備的變化，在診治卵巢疾病、評估藥物治療對患者卵巢功能的影響中具有十分明顯的優(yōu)勢。因此AMH是目前預測卵巢反應、評估卵巢貯備功能的最理想生物標志物[8,9]。

此羅氏的AMH檢測試劑盒，其性能參數(shù)均是由廠家在實驗室的最適條件下檢測完成的，雖然廠家說明書中給出各項性能指標，但在臨床的常規(guī)環(huán)境中使用是否滿足說明書中的性能指標，仍需進行驗證。因此本研究對羅氏AMH檢測試劑盒進行試劑盒性能驗證，包括準確度、精密度、線性范圍、臨床可報告范圍、參考區(qū)間等性能，分析其試劑盒性能是否符合臨床要求。

準確性驗證結果表明，檢測結果與理論值的相對偏倚均在10%范圍以內，未超出廠家說明書的允許范圍，因此試劑準確度性能驗證通過。精密度驗證結果顯示，水平1、水平2及試劑盒配套質控品1、質控品2批內精密度分別為1.1%、1.5%、1.06%、0.97%，均小于廠家說明書批內精密度的2%標準，符合要求，批間內精密度分別為2.7%、2.88%、3.46%、4.17%，均小于廠家說明書批間內精密度的5%標準，精密度均符合廠家及臨床要求。線性范圍的回歸方程為Y=0.986X-0.288（r2=0.998），符合廠家試劑說明書的要求，在說明書線性范圍內此試劑盒線性較好。線性范圍結果表明，當高值樣本稀釋至256倍時，相對偏倚超出廠家范圍，因此試劑的最大稀釋比例為1:64，試劑盒臨床最大可報告范圍上限為1472ng/mL，最低下限為0.0011，既符合廠家說明書的要求，也符合臨床應用范圍。參考區(qū)間驗證結果表明，此參考區(qū)間適用于本地區(qū)人群參考區(qū)間范圍，由于實際臨床中大多數(shù)實驗室都不建立本區(qū)域的參考區(qū)間，僅驗證廠家說明書的參考區(qū)間是否適用于本實驗室，因此可直接應用廠家說明書所提供的參考區(qū)間。

綜上所述，在羅氏Cobas6000全自動免疫分析儀對羅氏的AMH檢測試劑盒進行性能驗證，其試劑盒的準確性、精密度、線性范圍、參考區(qū)間與廠家所給說明書的數(shù)據(jù)相符合，能夠滿足臨床應用。