劉 果 于凌昱 馬騰飛 劉 鋒 （四川大學(xué)華西醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，成都 610041）

輔助型T 細(xì)胞2（T helper 2 cell，Th2）是CD4+T細(xì)胞的效應(yīng)細(xì)胞，以表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Gata3和分泌Th2型細(xì)胞因子（IL-4、IL-5 和IL-13 等）為特征，其主要功能為參與并調(diào)節(jié)2 型免疫應(yīng)答［1-2］。正常情況下，2 型免疫應(yīng)答有助于機(jī)體抵抗外界致病菌入侵；但在特殊因素誘導(dǎo)下，Th2 細(xì)胞功能亢進(jìn)，分泌過多細(xì)胞因子，可導(dǎo)致Th2 型炎癥疾病，如哮喘、變應(yīng)性鼻炎和特異性皮炎等［1，3］。

IL-33 是一種與Th2 型炎癥反應(yīng)密切相關(guān)的細(xì)胞因子，屬于IL-1 家族成員，其受體ST2 表達(dá)于Th2細(xì)胞表面［4］。研究發(fā)現(xiàn)，IL-33 不僅可誘導(dǎo)Th2 細(xì)胞上調(diào)ST2表達(dá)，同時(shí)，IL-33結(jié)合ST2后將激活Th2細(xì)胞內(nèi)NF-κB 和MAPK 信號(hào)通路，導(dǎo)致細(xì)胞因子IL-5和IL-13 大量釋放［5-6］。因此，拮抗Th2 細(xì)胞內(nèi)IL-33的生物學(xué)功能將有助于Th2型炎癥疾病治療［4］。

Bach2（bric-a-brac，tramtrack and cap'n' collar homology 2，Bach2）是T 細(xì)胞中最新發(fā)現(xiàn)的一種負(fù)性轉(zhuǎn)錄因子，具有強(qiáng)大的轉(zhuǎn)錄抑制能力［7-8］。近年研究發(fā)現(xiàn)，敲除Bach2基因后，小鼠肺部將產(chǎn)生Th2 型炎癥反應(yīng)；CD4+T 細(xì)胞和Treg 將自發(fā)向Th2 細(xì)胞轉(zhuǎn)化；若轉(zhuǎn)染過表達(dá)Bach2將抑制此過程［9-10］。表明Bach2是Th2細(xì)胞分化過程中的關(guān)鍵負(fù)性調(diào)控因子。

Bach2 抑制Th2 細(xì)胞分化的機(jī)制是競爭性抑制MAPK 信 號(hào) 通 路［9］。而MAPK 信 號(hào) 通 路 同 樣 也 是IL-33的主要功能通路［5］。那么Bach2表達(dá)或缺失是否影響IL-33在Th2細(xì)胞內(nèi)的生物學(xué)功能？同時(shí)，研究還發(fā)現(xiàn)敲除Bach2基因后，ST2將在Bach2-/-Th2細(xì)胞表面持續(xù)表達(dá)［10］。提示Bach2 可能與Th2 細(xì)胞內(nèi)IL-33 信號(hào)通路有關(guān)。因此，本研究首先建立Bach2基因的條件敲除小鼠，再通過體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)探討B(tài)ach2 與Th2 細(xì)胞內(nèi)IL-33 生物學(xué)功能的關(guān)系，為尋求新的治療靶點(diǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Bach2-floxed 小鼠和Cd4-Cre 小鼠購于江蘇集萃藥康生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（蘇）2018-0008；兩種轉(zhuǎn)基因小鼠雜交得到陽性條件敲除小鼠，即Bach2flox/floxCd4-Cre 小鼠（Bach2-CKO小鼠）和陰性Bach2flox/floxCd4小鼠（WT小鼠）。以上所有基因小鼠均以C57BL/6小鼠為背景，并飼養(yǎng)于四川大學(xué)華西醫(yī)院科技園SPF 級(jí)動(dòng)物房，6～8 周齡時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案及飼養(yǎng)使用經(jīng)四川大學(xué)華西醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2018183A）。

1.1.2 試劑和抗體 IL-2（cat#575402）、IL-4（cat#574302）、anti-CD3ε（cat#100339）、anti-CD28（cat#102115）、anti-IFN-γ（cat#505834）、FITC-anti-mouse CD4（cat#100405）、PE-anti-mouseCD62L（cat#104407）、PE-anti-mouse ST2（cat#146607）購于美國Biolegend公司；IL-33（cat#3626-ML/CF）、Mouse IL-5（cat#DY405）和IL-13（cat#DY413）DuoSet ELISA Kit 購 于 美 國R&D 公 司；anti-Bach2 mAb（cat#PA5-100792）和anti-Gata3 mAb（cat#14-9966-82）購于美國Invitrogen公司；EasySepTMMouse CD4+CD62L+T Cell Isolation Kit（cat#18765）購于加拿大Stemcell 公司；TRIzolTMReagent（cat#15596026）購 于 美 國Thermo 公 司；iScriptTMgDNA Clear cDNA Synthesis Kit（cat#1725035）和iTaqTMUniversalSYBRGreenSupermix（cat#1725120）購于美國Biorad 公司；HE（cat#G1120）、AB-PAS（cat#G1285）和瑞氏-吉姆薩（cat#G1040）染色試劑購于北京索萊寶公司；polybrene（cat#TR-1003）購于美國Sigma 公司；RPMI1640 細(xì)胞培養(yǎng)基（cat#11875）和胎牛血清（cat#10100147）購于美國Gibco 公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒（cat#P0010）和ECL發(fā)光液（cat#P0018AS）購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型構(gòu)建 IL-33經(jīng)鼻滴藥建立小鼠呼吸 道Th2 型 炎 癥 模 型［11-12］，并 分 為 實(shí) 驗(yàn) 組（6 只Bach2-CKO 小鼠）和對照組（6 只WT 小鼠）：于小鼠腹股溝連線中點(diǎn)至臍部連線中外1/3 處注射IL-33（4 μg/d），再將IL-33（1 μg/d）溶于PBS（50 μl），雙側(cè)交替緩慢滴入鼻腔，連續(xù)4 d，最后1 次給藥24 h 后處死所有小鼠。

1.2.2 支氣管肺泡灌洗及肺組織病理學(xué)檢查 處死小鼠，隨機(jī)選取6 只小鼠（實(shí)驗(yàn)組和對照組各3只）氣管內(nèi)插入塑料管，PBS灌洗（1 ml/次），反復(fù)吹吸后回收，重復(fù)3次。收集支氣管肺泡灌洗液（bron?choalveolar lavage fluid，BALF）離心（4 ℃、2 000 r/min，5 min），棄上清，重懸，計(jì)數(shù)器檢測細(xì)胞總數(shù)。BALF沉淀細(xì)胞制備細(xì)胞涂片，行瑞氏-吉姆薩染色，鏡下分類計(jì)數(shù)，計(jì)算BALF 沉淀細(xì)胞種類和百分率以及絕對細(xì)胞數(shù)。剩余6 只小鼠（實(shí)驗(yàn)組和對照組各3 只）處死后直接取左肺組織固定于10%甲醛緩沖液，組織切片后行HE 和AB-PAS 染色，觀察肺組織結(jié)構(gòu)變化；取右肺組織提取總RNA行RT-PCR檢測。

1.2.3 細(xì)胞分離提取及誘導(dǎo)分化 取小鼠脾臟制備細(xì)胞懸液，按照EasySepTMMouse CD4+CD62L+T Cell Isolation Kit 說明書分離得到na?ve CD4+T 細(xì)胞。將分離的CD4+T 細(xì)胞加入包被處理好的24 孔板內(nèi)培養(yǎng)?？贵w包被孔板方法：500 μl/孔PBS 內(nèi)含anti-CD3ε（5 μg/ml）和anti-CD28（10 μg/ml）包被孔板，4 ℃孵育過夜［13］。Th2 細(xì)胞刺激誘導(dǎo)分化條件：IL-2（10 ng/ml）、IL-4（10 ng/ml）和anti-IFN-γ mAb（5 μg/ml）刺激4 d［13］；IL-33刺激條件：IL-33（10 ng/ml）聯(lián)合IL-2（10 ng/ml）刺激培養(yǎng)。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4+T 細(xì)胞純度及膜受體ST2 表達(dá) 磁珠分選細(xì)胞后，立即取部分細(xì)胞進(jìn)行FITC-anti-CD4 和PE-anti-CD62L 細(xì)胞膜表面染色，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞提取純度。剩余細(xì)胞以1×106個(gè)/孔加入24孔板內(nèi)培養(yǎng)2 d，Th2細(xì)胞誘導(dǎo)分化條件下培養(yǎng)3輪（4 d/輪）；收集細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞膜表面PE-anti-ST2 染色。所有染色細(xì)胞采用Beckman-cytoflex 流式細(xì)胞儀檢測，F(xiàn)lowJo軟件分析數(shù)據(jù)。

1.2.5 ELISA檢測細(xì)胞上清中Th2型細(xì)胞因子分泌水平 IL-33 主要誘導(dǎo)Th2 細(xì)胞釋放IL-5 和IL-13，而不影響IL-4表達(dá)［5，14］，因此，納入IL-5和IL-13作為判定指標(biāo)。IL-33 刺激細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)（0 h、3 h、6 h、9 h）收集上清，嚴(yán)格按照Mouse IL-5 和IL-13 DuoSet ELISA Kit說明書操作。酶標(biāo)儀于波長450 nm處測定吸光度，參照試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算IL-5、IL-13濃度。

1.2.6 RT-PCR 檢測肺組織及細(xì)胞內(nèi)Th2型細(xì)胞因子mRNA 表達(dá) TRIzol法提取小鼠右肺組織及細(xì)胞總RNA，并按照iScriptTMgDNA Clear cDNA Synthesis Kit 說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA 為模板、18S為 內(nèi) 參，RT-PCR 檢 測IL-4、IL-5、IL-13及Bach2mRNA表達(dá)，引物序列見表1。

1.2.7 腺病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞 委托上海吉?jiǎng)P基因科技有限公司構(gòu)建含有mouseBach2-cDNA 的腺病毒載體；將分離得到的Bach2-/-CD4+T 細(xì)胞按1×106個(gè)/孔加入包被處理好的24 孔板，并在Th2 條件下誘導(dǎo)分化4 d；加入腺病毒和polybrene，1 000 g 室溫離心，感染90 min后37 ℃孵化24 h；第2天，將新鮮培養(yǎng)基加入細(xì)胞中，并繼續(xù)在Th2條件下培養(yǎng)2 d進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.2.8 Western blot 檢 測Bach2、Gata3 蛋 白 表 達(dá)提取總蛋白，BCA 法檢測蛋白濃度；凝膠電泳分離等量蛋白后上樣、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入一抗（1∶500）4 ℃孵育過夜；Tris-HCl緩沖鹽溶液洗滌后將膜與適當(dāng)稀釋的二抗室溫孵育2 h，滴加ECL 發(fā)光液，凝膠成像儀觀察結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以±s表示。兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IL-33 加重Bach2-CKO 小鼠呼吸道Th2 型炎癥反應(yīng)

2.1.1 病理結(jié)果 兩組小鼠肺組織、支氣管周圍均見大量單核炎癥細(xì)胞浸潤，支氣管黏膜內(nèi)杯狀細(xì)胞化生、黏液腺分泌增加；與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠肺組織內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤程度更重（成團(tuán)分布）、支氣管黏膜內(nèi)杯狀細(xì)胞化生更加明顯、黏液腺分泌亢進(jìn)（圖1A）。

2.1.2 支氣管肺泡灌洗 實(shí)驗(yàn)組BALF 中細(xì)胞總數(shù)較對照組明顯增加，以嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞增多為主（P<0.05，圖1B）。

2.1.3 肺部RT-PCR 結(jié)果 與對照組相比，IL-33顯著增加實(shí)驗(yàn)組小鼠肺組織內(nèi)IL-4、IL-5和IL-13mRNA 表達(dá)（P<0.05，圖1C）。表明在CD4+T 細(xì)胞缺失Bach2 調(diào)控的基礎(chǔ)上，IL-33 進(jìn)一步加重小鼠呼吸道Th2型炎癥反應(yīng)。

圖1 IL-33 加重Bach2-CKO 小鼠呼吸道Th2 型炎癥反應(yīng)（×50）Fig.1 IL-33 aggravated Th2-type airway inflammation of Bach2-CKO mice（×50）

2.2 Bach2 缺失對Th2 細(xì)胞內(nèi)IL-33 生物學(xué)功能的影響

2.2.1 細(xì)胞分選純度及誘導(dǎo)分化結(jié)果 磁珠分選后得到較高純度na?ve CD4+T 細(xì)胞（約90.6%，圖2A）；Bach2mRNA 高表達(dá)于CD4+T 細(xì)胞，而在Bach2-/-CD4+T 細(xì)胞內(nèi)幾乎無表達(dá)（圖2B），提示Bach2基因敲除成功；膜受體ST2 在誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞表面高表達(dá)（圖2C），提示Th2細(xì)胞誘導(dǎo)分化成功。

2.2.2 Bach2缺失對IL-33生物學(xué)功能的影響 IL-33可增加兩種Th2 細(xì)胞內(nèi)IL-5、IL-13mRNA 表達(dá)以及細(xì)胞外IL-5、IL-13 釋放；與正常Th2 細(xì)胞組相比，IL-33顯著促進(jìn)Bach2-/-Th2細(xì)胞表達(dá)IL-5和IL-13（圖2D、E）。表明Th2 細(xì)胞內(nèi)缺失Bach2 調(diào)控，可促進(jìn)IL-33生物學(xué)功能，增加Th2型細(xì)胞因子表達(dá)。

圖2 Bach2缺失對Th2細(xì)胞內(nèi)IL-33生物學(xué)功能的影響Fig.2 Effect of Bach2 deficiency on biological function of IL-33 in Th2 cells

2.3 Bach2 過表達(dá)對Th2 細(xì)胞內(nèi)IL-33 生物學(xué)功能的影響

2.3.1 Bach2 過表達(dá)對IL-33 生物學(xué)功能的影響B(tài)ach2-/-Th2 細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染過表達(dá)Bach2-cDNA 使其成為Bach2-expressed Th2細(xì)胞（Bach2-ex Th2，圖3A）。加入IL-33 培養(yǎng)刺激（轉(zhuǎn)染后72 h）。與Bach2-/-Th2細(xì)胞相比，Bach2-ex Th2 細(xì)胞內(nèi)IL-5、IL-13mRNA 表達(dá)明顯下調(diào)，細(xì)胞外釋放量明顯減少（圖3B、C），提示Bach2 過表達(dá)將有效抑制IL-33 誘導(dǎo)Th2 細(xì)胞釋放細(xì)胞因子。

2.3.2 Bach2過表達(dá)對Th2細(xì)胞的影響 轉(zhuǎn)染后不同時(shí)點(diǎn)（0 h、48 h和72 h）檢測Th2細(xì)胞生物學(xué)特性，發(fā)現(xiàn)隨著Bach2-cDNA不斷表達(dá)，Bach2-/-Th2細(xì)胞內(nèi)Gata3蛋白激酶水平逐漸下降（圖3A）；細(xì)胞表面ST2受體表達(dá)逐漸下調(diào)（圖3D）；說明Bach2 過表達(dá)抑制Th2細(xì)胞生物學(xué)特性。

圖3 Bach2過表達(dá)對Th2細(xì)胞及IL-33生物學(xué)功能的影響Fig.3 Effects of up-regulation of Bach2 on biological function of IL-33 in Th2 cells

3 討論

Bach2 是Bach 家族中一種負(fù)性轉(zhuǎn)錄因子，由1 個(gè)堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域和相鄰保守的Cap'n'collar 結(jié)構(gòu)域組成，具有強(qiáng)大的轉(zhuǎn)錄抑制能力［15］。Bach2 通常與sMaf 蛋白結(jié)合形成異源二聚體，識(shí) 別 含 有TGCTGA（G/C）TCA（T/C）序 列 的MARE（Maf-recognition elements）元件，進(jìn)而抑制靶基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)［8，15］。

研 究 顯 示，Bach2 高 表 達(dá) 于B 細(xì) 胞、CD4+T、CD8+T細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞［15］。CD4+T細(xì)胞系中，Bach2 的主要功能是維持T 細(xì)胞原始性，抑制其向Th2細(xì)胞分化［8，15］。TSUKUMO等［10］研究發(fā)現(xiàn)，Bach2 高表達(dá)于正常的na?ve CD4+T 細(xì)胞和Treg，而在Th2 細(xì)胞內(nèi)表達(dá)明顯降低。敲除Bach2基因，na?ve CD4+T 和Treg 將 自 發(fā) 向Th2 細(xì) 胞 分 化；Bach2-/-na?ve CD4+T 細(xì)胞內(nèi)Th2 相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)；而 細(xì) 胞 表 面 將 高 表 達(dá)IL-33 受 體ST2［10，16］。同 樣，KUWAHARA 等［9］通過Bach2基因敲除小鼠模型發(fā)現(xiàn)，T 細(xì)胞內(nèi)缺乏Bach2 調(diào)控將導(dǎo)致小鼠肺部自發(fā)Th2 型炎癥反應(yīng)。與此同時(shí)，肺組織內(nèi)IL-33mRNA及受體ST2 表達(dá)明顯增加；提示Bach2 可能與IL-33/ST2信號(hào)通路有關(guān)。

本研究首先建立Bach2基因的條件敲除小鼠，經(jīng)鼻給予IL-33誘發(fā)呼吸道Th2型免疫應(yīng)答，發(fā)現(xiàn)與正常小鼠相比，IL-33顯著加重Bach2-CKO小鼠肺組織內(nèi)淋巴細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞浸潤，促進(jìn)杯狀細(xì)胞化生和黏液腺分泌以及Th2 型細(xì)胞因子IL-4、IL-5和IL-13表達(dá)，說明Bach2在體內(nèi)參與IL-33相關(guān)Th2型炎癥反應(yīng)調(diào)控。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與正常Th2 細(xì)胞相比，IL-33顯著促進(jìn)Bach2-/-Th2細(xì)胞釋放細(xì)胞因子IL-5 和IL-13；而在Bach2-/-Th2 細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染過表達(dá)Bach2 將有效抑制IL-33 相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)與釋放。證明Bach2 參與Th2 細(xì)胞內(nèi)IL-33/ST2 信號(hào)通路調(diào)控，且能有效抑制細(xì)胞內(nèi)IL-33生物學(xué)功能。

Bach2 抑制IL-33 生物學(xué)功能的機(jī)制尚未闡明，推測有以下兩種可能：①IL-33 受體ST2 在Bach2-/-Th2細(xì)胞表面高表達(dá)，而在Bach2過表達(dá)的Th2細(xì)胞內(nèi)明顯受抑制。ST2 表達(dá)下調(diào)將直接影響細(xì)胞內(nèi)IL-33 信號(hào)通路激活。因此，課題組認(rèn)為Bach2 首先可通過影響Th2 細(xì)胞表面受體ST2 表達(dá)進(jìn)而調(diào)控IL-33/ST2 信號(hào)通路；②研究證實(shí)，IL-33 主要通過激活Th2 細(xì)胞內(nèi)p38-MAPK 信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞因子釋放［14，17］；同時(shí)，KUWAHARA 等［9］研究發(fā)現(xiàn)，Th2 細(xì)胞內(nèi)Bach2 可與轉(zhuǎn)錄因子Batf 結(jié)合形成Bach2-Batf 異源二聚體，競爭抑制MAPK 信號(hào)通路。因此，Th2 細(xì)胞內(nèi)Bach2 是否通過直接調(diào)控MAPK 信號(hào)通路進(jìn)而抑制IL-33 生物學(xué)功能尚不清楚，這將是課題組下一步研究方向。

綜上所述，本研究證明Bach2 參與了Th2 細(xì)胞內(nèi)IL-33/ST2 信號(hào)通路調(diào)控，可有效抑制該細(xì)胞內(nèi)IL-33生物學(xué)功能。