周華晶，徐 東，黎良浩，陳元彩

（1. 昆明理工大學(xué) 建筑工程學(xué)院，云南 昆明 650504；2. 華南理工大學(xué) 環(huán)境與能源學(xué)院工業(yè)聚集區(qū)污染控制與生態(tài)修復(fù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006）

三氯生是一種廣譜抗菌劑，已應(yīng)用于許多工業(yè)產(chǎn)品和個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品。三氯生相對(duì)不揮發(fā)，水中溶解度低（20 ℃時(shí)溶解度為10 mg/L）。廢水中三氯生的去除常用的方法是生物處理法，主要是利用微生物的代謝作用將其降解和吸附。生物處理成本低、易于操作，且最重要的是沒有二次污染，但是處理時(shí)間較長，采用傳統(tǒng)微生物處理有毒、難降解有機(jī)廢物面臨極大挑戰(zhàn)。

在傳統(tǒng)的生物處理過程中加入某種特定的物質(zhì)或基團(tuán)，增強(qiáng)微生物對(duì)難降解污染物的去除能力，改善廢水處理效果，我們稱之為生物強(qiáng)化作用。納米粒子由于其豐富的活性位點(diǎn)和巨大的比表面積，被廣泛應(yīng)用到污染水體的修復(fù)處理中。其中貴重金屬的生物強(qiáng)化作用效果最佳，但其成本高昂并不適合大規(guī)模工業(yè)應(yīng)用。納米鐵是一種有效的脫鹵還原劑，可以催化還原多種有機(jī)鹵化物。但由于納米鐵穩(wěn)定性較差容易形成鐵氧化物或氫氧化物沉淀，使其功能發(fā)生鈍化。

本研究利用化學(xué)方法將納米鐵與微生物共同包埋形成復(fù)合菌劑，在相同實(shí)驗(yàn)條件下探討單一微生物體系、單一納米鐵體系及納米鐵-微生物耦合體系對(duì)三氯生的降解機(jī)制，并研究了三氯生的降解途徑以及代謝產(chǎn)物的毒性效應(yīng)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑、材料和儀器

KBH，F(xiàn)eSO·7HO，瓊脂，SiO，Al（SO），HBO，聚乙烯醇（PVA），NaCl：均為分析純。三氯甲烷：色譜純。實(shí)驗(yàn)用水均為去離子水。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：牛肉膏6.0 g/L，NaCl 15.0 g/L，蛋白胨 10.0 g/L，大豆粉 2.0 g/L，pH 6.5。

微生物菌液：施世假單胞桿菌（KS0013）取自工業(yè)聚集區(qū)污染控制與生態(tài)修復(fù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，該菌株此前從廣東省韶關(guān)市多溴二苯醚污染現(xiàn)場(chǎng)分離得到。取該菌株1環(huán)，轉(zhuǎn)移到30 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，35 ℃下培養(yǎng)2 d；再以10%的體積比接種至基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，35 ℃下培養(yǎng)2 d，以5 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min，獲得菌體的對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，稀釋至菌濃度為（2.0±0.6）×10CFU/mL。

三氯生模擬廢水：三氯生質(zhì)量濃度為10 mg/L。

MLS-3705型高壓滅菌鍋：日本三洋公司；BT125D型電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；2695型Waters高效液相色譜（HPLC）儀：沃特世科技（上海）有限公司；7890A-5975C型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）儀：安捷倫科技（中國）有限公司。

1.2 納米鐵-微生物復(fù)合菌劑的制備

納米鐵溶液的制備：采用液相還原法，在氮?dú)獗Ｗo(hù)的液相體系中加入強(qiáng)還原劑KBH，還原FeSO·7HO得到納米Fe溶液，質(zhì)量濃度為0.1 mg/L。

包埋液的制備：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的瓊脂和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.5%的PVA共同加熱至完全溶解，再加入質(zhì)量濃度為1 mg/L的 SiO溶液，制得包埋液。

交聯(lián)劑的制備：將Al（SO）粉末溶于飽和HBO溶液中，得到濃度為0.5 mol/L的Al（SO）飽和HBO交聯(lián)劑。

納米鐵-微生物復(fù)合菌劑的制備：在60 ℃恒溫水浴條件下，分別取納米鐵溶液和施世假單胞桿菌菌液加入到包埋液中，攪拌混合均勻，在氮?dú)獗Ｗo(hù)的環(huán)境中滴加交聯(lián)劑，各組分體積比為15∶6∶57∶22。在4 ℃條件下交聯(lián)10 h后，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9%的NaCl溶液清洗、保存，得到納米鐵-微生物復(fù)合菌劑。

1.3 三氯生的去除

取制得的納米鐵-微生物復(fù)合菌劑3 mg，投入基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 h，使其活化后直接投入10 L質(zhì)量濃度為10 mg/L的三氯生模擬廢水中，曝氣處理5 d，曝氣量為2 L/h，初始反應(yīng)pH為6.5左右。

對(duì)照組采用相同實(shí)驗(yàn)條件下的單一微生物菌液（接種量為12 mg/L的施氏假單胞菌在30 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后直接使用）或者單一納米鐵溶液（投加量為200 mg/L）。

1.4 分析方法

三氯生采用HPLC法測(cè)定，測(cè)定條件：色譜柱為Waters C柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；35 ℃柱溫，以乙腈-水溶液（體積比75∶5）為流動(dòng)相，總流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，檢測(cè)波長為230 nm。目標(biāo)物質(zhì)出峰時(shí)間約為6.01 min，樣品總檢測(cè)時(shí)間為7.5 min。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線=81 091-88 058（相關(guān)系數(shù)0.999）計(jì)算水樣中初始三氯生質(zhì)量濃度和反應(yīng)后三氯生質(zhì)量濃度ρ，得到三氯生去除率。

三氯生及其代謝產(chǎn)物的分析采用GC-MS法，色譜測(cè)定條件：石英柱，柱長為 30 mm，內(nèi)徑為0.22 mm，膜厚為 0.22 μm；進(jìn)樣口溫度 270 ℃；以氦氣作為載氣，流速1 mL/min；進(jìn)樣量1 μL。質(zhì)譜檢測(cè)條件：四極桿溫度150 ℃，離子源溫度230℃；轟擊源能量70 eV；質(zhì)荷比掃描范圍45～400/。具體操作如下：在每一次降解反應(yīng)過程中間隔一定時(shí)間進(jìn)行取樣，將含有樣品的懸浮液經(jīng)三氯甲烷多次萃取分離，取下層萃取液進(jìn)行N吹掃濃縮至1 mL，無水硫酸鈉吸水后作為樣液待測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 納米鐵-微生物耦合體系對(duì)三氯生的降解效果

不同體系中三氯生的去除率見圖1。由圖1可見，納米鐵-微生物耦合體系處理5 d后，三氯生的去除率高達(dá)83%，分別是對(duì)照組單一微生物體系和單一納米鐵體系的4.15倍和4.88倍，表明納米鐵和微生物之間存在明顯的協(xié)同效應(yīng)，證明納米鐵-微生物耦合體系是一種有效去除三氯生的反應(yīng)體系。

圖1 不同體系中三氯生的去除率

單一微生物體系和納米鐵-微生物耦合體系的微生物生長曲線見圖2。由圖2可見，納米鐵-微生物耦合體系的OD高于單一微生物體系，降解菌從第1天到第5天為對(duì)數(shù)增長期，納米鐵-微生物耦合體系的OD在第5天達(dá)到最大值（1.518），高于單一微生物體系的OD最大值（第6天，OD為1.332），隨后單一微生物體系的OD略微下降，但納米鐵-微生物耦合體系的OD一直保持較高水平。因此，納米鐵的存在明顯有利于微生物的生長，由此可以推斷，納米鐵通過還原產(chǎn)生的鐵離子可以為微生物生長提供營養(yǎng)，還原過程中產(chǎn)生的電子為微生物生長提供能量。

圖2 微生物的生長曲線

2.2 三氯生降解產(chǎn)物分析及其代謝途徑推測(cè)

三氯生降解過程的HPLC譜圖見圖3。由圖3可見：除了系統(tǒng)產(chǎn)生的水峰以外，三氯生的峰強(qiáng)隨時(shí)間的延長逐漸變?nèi)?；并且在這個(gè)過程中產(chǎn)生了多個(gè)降解中間體的峰；三氯生在5 d內(nèi)完全降解。

圖3 三氯生降解過程的HPLC譜圖

采用三氯生降解過程中第1、3、5天的混合水樣進(jìn)行GC-MS分析，三氯生降解過程混合水樣的色譜圖見圖4。由圖4可見，分別在保留時(shí)間為21.8，25.9，30.6 min時(shí)檢測(cè)到中間產(chǎn)物苯酚（A1）、2，2-（1-甲基）雙5-甲基環(huán)己醇和1，4-環(huán)己二醇（A2），以及29.8 min檢測(cè)到三氯生。

圖4 三氯生降解過程混合水樣的色譜圖

由于GC-MS測(cè)試過程中定容溶劑正己烷易揮發(fā)加成到中間產(chǎn)物上，故實(shí)際檢測(cè)到的三氯生降解中間產(chǎn)物碎片離子的質(zhì)譜圖見圖5。由圖5可見，除了三氯生，在反應(yīng)過程中還檢測(cè)到了苯酚、1，4-環(huán)己二醇和2，2-（1-甲基）雙5-甲基環(huán)己醇3種中間產(chǎn)物的碎片離子。

由圖4、圖5推測(cè)出本研究中納米鐵-微生物耦合體系對(duì)三氯生的降解途徑（見圖6）。由圖6可見：三氯生的降解主要包括脫氯和雙鍵斷裂；首先，路徑一是納米鐵還原脫氯以及雙鍵的斷裂形成中間產(chǎn)物B1（2，2-（1-甲基）雙5-甲基環(huán)己醇），隨后B1經(jīng)微生物代謝進(jìn)一步被降解，生成A2（1，4-環(huán)己二醇）；路徑二是由零價(jià)納米鐵造成醚鍵的氧化斷裂，形成中間產(chǎn)物A1（苯酚），A1經(jīng)微生物代謝進(jìn)一步被降解，生成A2；最后，A2經(jīng)微生物代謝進(jìn)一步開環(huán)礦化成小分子羧酸，最終生成CO和HO。

圖5 三氯生降解中間產(chǎn)物碎片離子的質(zhì)譜圖

圖6 納米鐵-微生物耦合體系中三氯生的代謝途徑

2.3 三氯生及其代謝產(chǎn)物的毒性評(píng)價(jià)

為了進(jìn)一步評(píng)估三氯生在納米鐵-微生物耦合體系降解過程中存在的潛在風(fēng)險(xiǎn)，采用ECOSAR軟件對(duì)三氯生及其中間代謝產(chǎn)物進(jìn)行毒性評(píng)估。ECOSAR軟件對(duì)三氯生及其中間代謝產(chǎn)物毒性的估測(cè)值見表1。根據(jù)《新化學(xué)物質(zhì)危害評(píng)估導(dǎo)則》（HJ/T 154—2004）規(guī)定，急性毒性半致死濃度（LC）主要分為劇毒（＜1 mg/L）、有毒（1～10 mg/L）、有害（10～100 mg/L）和無害（＞100 mg/L）4個(gè)等級(jí)，慢性毒性值（ChV）主要分為劇毒（＜0.1 mg/L）、有毒（0.1～1 mg/L）、有害（1～10 mg/L）和無害（＞10 mg/L）4個(gè)等級(jí)。由表1可見，三氯生對(duì)魚類和水蚤的急性毒性和慢性毒性均屬于劇毒（LC＜1 mg/L，ChV＜0.1 mg/L），對(duì)綠藻屬于有毒（1 mg/L＜LC＜10 mg/L，0.1 mg/L ＜ChV＜1 mg/L）。

表1 ECOSAR軟件對(duì)三氯生及其中間代謝產(chǎn)物毒性的估測(cè)值

三氯生及其中間代謝產(chǎn)物的急性毒性評(píng)價(jià)、慢性毒性評(píng)價(jià)分別見圖7、圖8。

由圖7可見：對(duì)于魚類，三氯生的LC為0.476 mg/L，然而其代謝中間體A1的LC明顯下降了兩個(gè)等級(jí)（38.351 mg/L），雖然B1毒性下降不多，但是其最終代謝產(chǎn)物A2的LC下降了多個(gè)等級(jí)，達(dá)到無害化處理；同樣的結(jié)果也在水蚤上觀察到；對(duì)于綠藻，一級(jí)代謝物B1的LC略有增加，但最終代謝產(chǎn)物A2的LC下降至無害。由圖8可見：三氯生的ChV除了綠藻的一級(jí)代謝B1略有增加，其他代謝產(chǎn)物的ChV均下降了1到多個(gè)等級(jí)，最終代謝產(chǎn)物下降至無害。上述結(jié)果對(duì)納米鐵-微生物耦合體系去除廢水中三氯生的實(shí)際應(yīng)用具有一定的指導(dǎo)意義。

圖7 三氯生及其中間代謝產(chǎn)物的急性毒性評(píng)價(jià)

圖8 三氯生及其中間代謝產(chǎn)物的慢性毒性評(píng)價(jià)

3 結(jié)論

a）利用納米鐵與微生物耦合體系降解廢水中的三氯生，通過納米鐵的還原作用脫去三氯生苯環(huán)上的氯離子，使其毒性降低或消除；再利用微生物共代謝作用引入施氏假單胞菌協(xié)同降解三氯生。

b）反應(yīng)5 d時(shí)，納米鐵-微生物耦合體系對(duì)三氯生的去除率達(dá)到83%，是單一微生物體系和單一納米鐵體系的4.15倍和4.88倍，納米鐵和微生物之間存在明顯的協(xié)同效應(yīng)。

c）納米鐵的引入明顯有利于微生物的生長，三氯生被納米鐵還原脫氯形成的中間產(chǎn)物可以進(jìn)一步被微生物降解。

d）三氯生在納米鐵-微生物耦合體系中生成了毒性更低的中間產(chǎn)物，最終能達(dá)到無害化程度。因此本研究對(duì)于實(shí)際廢水處理具有重要指導(dǎo)作用。