馬曉菁,薛曉波,葉 鋒,劉麗婭,古麗扎提·塔力甫汗,谷文喜,易新萍*
(1.新疆畜牧科學院獸醫(yī)研究所/新疆畜牧科學院動物臨床研究中心,烏魯木齊 830002;2.新疆畜牧科學院畜牧業(yè)經(jīng)濟與信息研究所,烏魯木齊 830002)
藍舌?。˙luetongue,BT)是由呼腸孤病毒科(Reoviridae)環(huán)狀病毒屬(Orbivirus)的藍舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)引起的經(jīng)媒介昆蟲如庫蠓、伊蚊等傳播的非接觸性病毒性傳染病[1]。綿羊?qū)υ摬∽顬橐赘?,病死率通常?%~30%,有時高達70%~100%[1]。藍舌病不僅對畜牧業(yè)生產(chǎn)造成直接經(jīng)濟損失,同時對國際貿(mào)易也造成較大影響。藍舌病病毒血清型眾多且變異快,目前全球有29個血清型的BTV,亞洲至少存在27個血清型的BTV[2,3]。新的血清型及強毒株的出現(xiàn),應(yīng)引起我國的高度重視。1979年,云南省的師宗縣首次檢測出BT,隨后湖北、安徽、四川、山西等29個省均檢出BTV血清陽家畜。目前我國已陸續(xù)分離到16個血清型的BTV,其中云南分離并檢測到的血清型最多,廣東次之[4,5]。新疆已分離到BTV3個血清型。1988年,新疆首次從遼寧蓋縣調(diào)運至克孜勒蘇州的絨山羊中檢出,1988-1989年對新疆地區(qū)牛羊藍舌病進行普查,結(jié)果顯示BTV血清陽性畜在新疆廣泛存在。2012年,新疆畜牧科學院獸醫(yī)研究所對疆內(nèi)的8個地州的8個縣市開展藍舌病調(diào)查并在新疆尉犁縣監(jiān)控動物群中分離獲得BTV分離株[6]。
藍舌病病毒粒子呈二十面體對稱,基因組大小約20 Kb,無囊膜,有多層衣殼,主要由3部分組成,分別為內(nèi)部核心、內(nèi)層衣殼與外層衣殼。該病毒基因組由10個分節(jié)段的雙鏈RNA組成[7,8],可編碼7種結(jié)構(gòu)蛋白(VP1-VP7)和5種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1-NS4)。VP2和VP5蛋白構(gòu)成病毒外殼,其中由L2基因編碼的VP2蛋白是主要型特異性抗原,S6基因編碼VP5蛋白是藍舌病唯一糖基化蛋白,與BTV毒力相關(guān)。研究表明,VP5能增強VP2中和抗體的產(chǎn)生,能增加VP2的保護作用。對VP5蛋白相關(guān)研究可為今后BTV基因工程疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。我國流行多種BTV血清型毒株,不同血清型BTV毒株對綿羊的致病性存在較大差異,因此BTV不同血清型疫苗的研究,對我國藍舌病防控具有重要意義。本研究對新疆1株疑似BTV分離株進行PCR鑒定,明確分離株位藍舌病病毒。應(yīng)用全長cDNA擴增(full-length amplification of cDNAs,F(xiàn)LAC)技術(shù),獲得編碼VP5蛋白S6基因序列,同源性比對結(jié)果表明,BTV新疆分離株S6基因序列出現(xiàn)較大差異,遺傳進化關(guān)系可見,新疆藍舌病分離株與BTV-18血清型及BTV-27血清型關(guān)系較近,但并不能歸屬為藍舌病血清18型及27型,新疆BTV分離株血清型需進一步鑒定。本研究結(jié)果以期為新疆地區(qū)藍舌病防控提供理論基礎(chǔ)。
新疆藍舌病病毒分離株、牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)、牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)均由新疆畜牧科學院獸醫(yī)研究所保存。
基因克隆載體PMD18-T、一步法反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒(Prime ScriptTM one step RT-PCR kit)均購自TaKaRa寶信生物工程(大連)有限公司,反轉(zhuǎn)錄試劑盒(SuperScriptTMFirst-strand Synthesis System)購自Invitrogen公司,引物合成及測序服務(wù)由上海生工完成。
1.2.1 藍舌病分離株的NS1片段RT-PCR擴增
依照OIE手冊提供引物進行巢式PCR,第一輪擴增引物:FA(5’-3’):GTTCTCTAGTTGGCAACCACC;RB:(5’-3’):AAGCCAGACTGTTTCCCGAT;第二輪擴增引物FC(5’-3’):GCAGCATTTTGAGAGAGCGA;RD(5’-3’):CCCGATCATACATTGCTTCCT,擴增產(chǎn)物片段分別為272 bp和101 bp。取BTV新疆分離株提取RNA 5μL,95℃變性5 min為模板,RT-PCR反應(yīng)體系25μL,其中模板5μL,2×1 step Buffer(Dye plus)12.5μL,PrimeScript 1 step Enzyme Mix 1μL,上游引物FA(10μM)0.5μL,下游引物RB(10μM)0.5μL,ddH2O補足25μL。第一輪擴增反應(yīng)程序:45℃40 min,94℃2 min,1個循環(huán);94℃30 s,55℃30 s,72℃30 s共40個循環(huán);72℃延伸5 min。以第一輪擴增產(chǎn)物為模板,進行第二輪擴增,反應(yīng)體系為25μL,其中模板1μL,PCR mix 12.5μL,上游引物FC(10μM)1μL,下游引物RD(10μM)1μL,ddH2O補足25μL。反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性1 min,94℃30 s,58℃30 s,72℃20 s共35個循環(huán),72℃延伸5 min,擴增產(chǎn)物送上海生工測序。
1.2.2 分離株S6基因序列擴增
根據(jù)FLAC(Full-Length Amplification of cDNA)方法[9],將BTV新疆分離株接種BHK-21細胞大量培養(yǎng),離心收集病毒液200μL,加入20μLRNase A和5μL冷核酸酶,37℃處理24 h;提取分離病毒dsRNA,按照T4 RNA連接試劑盒操作方法將病毒dsRNA與Anchor Primer連接,Anchor Primer:5'p-GACCTCTGAGGATTCTAAAC/iSp9/TCCAGTTTAGAATCC-OH-3’;連接產(chǎn)物經(jīng)RNA試劑盒純化;取純化后dsRNA15μL,94℃變性5 min,立即冰浴,按反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptⅡHigh Fidelity RT-PCR Kit說明書,反轉(zhuǎn)錄純化后dsRNA,反應(yīng)條件30℃10 min,42℃1 h,70℃10 min;分離病毒反轉(zhuǎn)錄cDNA中加入0.5μL的RNase H,37℃反應(yīng)2 h;分離病毒基因組PCR擴增,擴增引物5-15-1 Primer:5'-GAGGGATCCAGTTTAGAATCCTCAGAGGTC-3',擴增體系為25μL,其中5×Prime STAR GXL Buffer 5μL,DNTP(2.5mM)2μL,5-15-1 Primer 1μL,Prime STAR GXL DNA Ploymerase 1μL,分離病毒cDNA 13.5μL,ddH2O補足25μL,反應(yīng)條件94℃3 min;94℃30 s,55℃30 s,68℃4 min,30個循環(huán)。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖電泳,觀察結(jié)果。
1.2.3 BTV分離株S6基因序列進化樹繪制
選取Genbank中已發(fā)表BTV1-28血清型(除BTV-14及BTV-15)S6基因片段序列,經(jīng)MEGA5.0軟件Neighbour-Joining(NJ)方法構(gòu)建進化樹。
提取新疆分離株RNA,以其為模板進行巢式PCR擴增,PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳,結(jié)果可見,巢式PCR產(chǎn)物為101 bp目的條帶(見圖1),測序結(jié)果NCBI Blast比對分析,分離株與GenBank數(shù)據(jù)庫中藍舌病病毒編碼NS1蛋白基因相似性為98.04%,鑒定新疆該分離株為藍舌病病毒分離株。
圖1 分離株NS1片段擴增結(jié)果
FLAC技術(shù)對藍舌病新疆分離株P(guān)CR擴增,S6基因序列片段為1 572 bp(見圖2),將PCR產(chǎn)物送上海生工測序。
圖2 分離病毒FLAC方法基因組PCR擴增
登錄NCBI GenBank對測序結(jié)果進行同源性Blast比對,結(jié)果顯示新疆BTV分離株S6基因序列與GenBank發(fā)表3株BTV分離株S6序列具有同源性,同源性分別為88.11%,87.35%以及70.92%。應(yīng)用MEGA5.0軟件Neighbour-Joining(NJ)方法繪制進化樹,其遺傳進化關(guān)系可見,新疆地區(qū)BTV分離株S6基因序列與BTV-18血清型在同一進化分枝,與BTV-27血清型親緣關(guān)系最近(見圖3),其中BTV-27型為2014年在法國首次鑒定。
除南極洲外,藍舌病病毒在所有陸地均有發(fā)現(xiàn),該病毒呈世界性分布[10]。我國目前有10個省份(地區(qū))分離到16個血清型的BTV,新疆存在3個血清型[11,12]。藍舌病病毒是一種蟲媒傳播疫病,血清型眾多,BTV基因片段重組和變異導致了其遺傳的多樣性,地理環(huán)境的差異造成不同地理區(qū)域藍舌病病毒出現(xiàn)特有的突變。研究表明,藍舌病基因組核苷酸變異在某種程度上可反應(yīng)BTV的地理起源[13]。S6基因編碼的VP5蛋白可增強VP2蛋白誘導產(chǎn)生中和抗體,與VP2蛋白構(gòu)成病毒的外層衣殼。我國BTV-21血清型S6基因序列分析發(fā)現(xiàn)該毒株源于日本,該結(jié)果證明我國存在基因重組藍舌病病毒[14],給我國藍舌病防控工作增加了一定難度。對不同地區(qū)的易感動物進行藍舌病有效防控,針對該地區(qū)藍舌病特異的血清型疫苗顯得尤為重要。
本研究對新疆分離BTV株的鑒定及S6基因序列分析表明,BTV分離株S6基因序列僅與GenBank中BTV strain XJ1407株、BTV strainMNG2/2016株及BTV-18 strain USA2014/FL株的S6基因具有同源性,且同源性均低于90%,分別為88.11%,87.35%以及70.92%。遺傳進化關(guān)系結(jié)果表明分離株S6基因序列與BTV-18血清型在同一進化分枝,與BTV-27血清型親緣關(guān)系最近,但均不屬于藍舌病血清18型及27型。因此,對新疆分離BTV株需進一步進行血清學中和試驗鑒定分析,以期為新疆地區(qū)藍舌病疫苗研究提供科學依據(jù)。