王海茹，曹 卉，譚湘敏，龍 綺 (.?？谑腥嗣襻t(yī)院 中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，海南 海口 57008；.?？谑腥嗣襻t(yī)院 中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?57008)

鼻咽癌(NPC)是起源于鼻咽部上皮細(xì)胞的惡性腫瘤[1]，常見于東南亞國(guó)家，在我國(guó)通常集中發(fā)生在南方，尤其是廣東、廣西等地。由于鼻咽癌放化療不良反應(yīng)大、生物治療費(fèi)用昂貴，因此對(duì)鼻咽癌發(fā)病的分子機(jī)制進(jìn)行研究，尋找療效好且不良反應(yīng)小的抗鼻咽癌藥物是臨床上亟待解決的問題。自噬，又稱Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡，是細(xì)胞內(nèi)降解細(xì)胞器的唯一途徑，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展，腫瘤的轉(zhuǎn)移和能量代謝等過程有關(guān)[2]。研究鼻咽癌細(xì)胞凋亡、自噬及其信號(hào)通路有助于深入了解鼻咽癌的分子機(jī)制，為鼻咽癌治療提供新方法。

木犀草素是一種天然黃酮類化合物，存在于多種藥用植物中，如錦葵科、菊科、唇形科、馬鞭草科、傘形科等。木犀草素可在多靶點(diǎn)、多途徑、多環(huán)節(jié)產(chǎn)生抗腫瘤作用[3-4]。研究表明，木犀草素可以誘導(dǎo)自噬、抑制腫瘤細(xì)胞增殖[3-4]，但木犀草素是否對(duì)鼻咽癌細(xì)胞自噬有影響未知。因此本研究用木犀草素處理鼻咽癌細(xì)胞，觀察其對(duì)細(xì)胞增殖凋亡的影響以及能否引起自噬，從而探討木犀草素對(duì)鼻咽癌的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1材料來源：本次研究經(jīng)過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意。人鼻咽癌CNE-1細(xì)胞(來自廣州塞庫(kù)生物技術(shù)有限公司)在RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)(含10%胎牛血清)，并置于37℃和5%二氧化碳的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中。木犀草素(貨號(hào): 491-70-3) 購(gòu)自德思特生物技術(shù)有限公司，胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基、青鏈霉素購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，四氮唑藍(lán)鹽化合物(MTS)、缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司，Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自keygen公司，凋亡抑制蛋白(Bcl-2)、微管相關(guān)蛋白輕鏈3蛋白(LC3B)、泛素結(jié)合蛋白(p62)、自噬效應(yīng)蛋白(Beclin-1)、磷酸化磷脂酰肌醇3激酶(p-PI3K)、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)、蛋白激酶(AKT)、磷酸化雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)抗體購(gòu)自Abcam公司。

1.2方法

1.2.1MTS法檢測(cè)細(xì)胞增殖:將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人鼻咽癌CNE-1細(xì)胞按 1×104個(gè)/孔接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度的木犀草素(0、20、40、60、80、100 μmol/L)，其中0 μmol/L組[未加木犀草素，只加等體積的二甲基亞砜(DMSO)稀釋液]作為對(duì)照組，每個(gè)組設(shè) 3個(gè)復(fù)孔，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。收集培養(yǎng)后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞(0 h、24 h、48 h、72 h)，加入1/10檢測(cè)試劑(即100 μl培養(yǎng)液加入10 μl檢測(cè)液)孵育4 h后，再用酶標(biāo)儀檢測(cè)儀讀取OD490數(shù)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率=(其他時(shí)間點(diǎn)OD值均值÷0 h OD值均值-1)×100%。

1.2.2流式細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞凋亡：CNE-1細(xì)胞接種于6孔板，細(xì)胞密度為1.5×104/well，接種后繼續(xù)培養(yǎng)于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中24 h，待細(xì)胞貼壁后，按照加入的木犀草素濃度(20、40、60、80、100 μmol/L)分為五組，對(duì)照組為加入等量培養(yǎng)基的細(xì)胞，各組都設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后棄去原培養(yǎng)基，0.25%胰蛋白酶消化后將細(xì)胞重懸于培養(yǎng)基中(密度約1×106細(xì)胞/ml)，轉(zhuǎn)移含5×105個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液于離心管中，加入1.25 μl Annexin V-FITC和10 μl PI 染色液雙染，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CEN-1細(xì)胞凋亡率。

1.2.3透射電鏡觀察細(xì)胞內(nèi)自噬體:將1×106個(gè)CNE-1細(xì)胞接種到10 cm平皿中培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后加入藥物，加入藥物48 h后，細(xì)胞培養(yǎng)24 h，加入不同濃度木犀草素(20、40、60、80、100 μmol/L)48 h，同時(shí)設(shè)立對(duì)照組，胰酶消化細(xì)胞，離心，重復(fù)離心兩次后棄上清。2.5%戊二醛固定4℃2 h以上，1%鋨酸固定2 h，依次加入梯度乙醇脫水，丙酮固定，包埋固化和切片后，枸櫞酸鉛染色，用透射電鏡觀察后拍照。

1.2.4Western印跡檢測(cè)蛋白表達(dá)水平:將CNE-1細(xì)胞按1×106個(gè)細(xì)胞接種至培養(yǎng)瓶中，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，開始加入藥物，CNE-1細(xì)胞經(jīng)不同濃度(20、40、60、80、100 μmol/L)木犀草素處理24 h后胰酶消化細(xì)胞，離心5 min后棄上清， 用PBS重懸細(xì)胞，繼續(xù)離心2次后棄上清，加入提取緩沖液后4℃輕搖15 min。收集裂解液到EP管中，14 000 r/min離心15 min。取上清到新的EP管中。二奎啉甲酸(BCA)法測(cè)量蛋白濃度，電轉(zhuǎn)移后轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉后分別加入一抗和二抗，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯影。采用圖像處理軟件(Image J)檢測(cè)膜上的蛋白表達(dá)條帶，采用Prism 6.0用于統(tǒng)計(jì)各蛋白條帶的OD值。檢測(cè)指標(biāo)有Beclin-1、LC3、PI3K、p-AKT和p-mTOR。

2 結(jié)果

2.1木犀草素抑制鼻咽癌細(xì)胞CNE-1增殖:利用不同濃度的木犀草素分別處理 CNE-1 細(xì)胞24 h、48 h、72 h 后，MTS結(jié)果顯示，與對(duì)照組(0 μmol/L組)相比，木犀草素能夠抑制CNE-1細(xì)胞的增殖，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，并且隨著濃度和時(shí)間的增加，抑制增殖的作用增強(qiáng)。見圖1。

圖1 木犀草素抑制 CNE-1細(xì)胞增殖的作用

2.2木犀草素促進(jìn)CNE-1細(xì)胞凋亡:流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，不同濃度(20、40、60、80、100 μmol/L)木犀草素處理的CNE-1細(xì)胞凋亡率顯著提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05 或P<0.01)。見圖2。

注：與0 μmol/L組比較：*P<0.05，**P<0.01圖2 木犀草素對(duì)CNE-1細(xì)胞凋亡的影響

2.3透射電鏡觀察自噬體情況:不同濃度的木犀草素處理組細(xì)胞內(nèi)均出現(xiàn)自噬體，隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞自噬小體顯著增多。見圖3。

圖3 木犀草素誘導(dǎo)CNE-1細(xì)胞形成自噬體(×5 000)

2.4Western印跡檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)：Western印跡分析結(jié)果顯示，不同濃度的木犀草素隨著濃度增加，凋亡抑制蛋白Bcl-2表達(dá)下降(P<0.05)，自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ顯著升高，p62蛋白表達(dá)降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。木犀草素組p-PI3K、p-Akt和p-mTOR的蛋白表達(dá)比對(duì)照組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖5。

圖4 木犀草素對(duì)凋亡及自噬相關(guān)蛋白的影響

圖5 木犀草素對(duì)P13K/AKT/mTOR信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響

3 討論

鼻咽癌是我國(guó)耳鼻咽喉惡性腫瘤的主要癌種和病死因素[5]。放化療是目前主要的治療方法，但晚期低分化鼻咽癌患者對(duì)放療的敏感性較低，容易出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[6]。因此發(fā)現(xiàn)更加有效的藥物輔助鼻咽癌的治療是亟待解決的問題。木犀草素是由木犀草中分離出而得名，化學(xué)名為3，4，5，7-四羥基黃酮。目前對(duì)于木犀草素的研究主要集中在抑制腫瘤細(xì)胞增殖、阻滯細(xì)胞周期、促進(jìn)細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤血管生成方面[7-11]。為了探索木犀草素在治療鼻咽癌中的作用，本研究選擇人鼻咽癌CNE-1細(xì)胞作為研究對(duì)象，采用MTS法檢測(cè)木犀草素對(duì)CNE-1細(xì)胞增殖的影響，隨著木犀草素濃度的增加，CNE-1細(xì)胞的增殖能力顯著降低，提示木犀草素對(duì)細(xì)胞的增殖具有抑制作用。細(xì)胞凋亡和自噬是程序性細(xì)胞死亡的兩種死亡方式，可以共同作用于腫瘤細(xì)胞，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡。

自噬，也稱為Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡，廣泛存在于真核細(xì)胞中。 自噬通過將細(xì)胞質(zhì)蛋白或細(xì)胞器包裹在單層或雙層中形成自噬體，然后與溶酶體融合形成自噬溶酶體。 最后，封裝的內(nèi)容物被降解，實(shí)現(xiàn)自我消化和細(xì)胞器更新[12]。自噬在介導(dǎo)腫瘤發(fā)展中起雙刃作用，一方面誘導(dǎo)細(xì)胞自噬死亡，抑制腫瘤的發(fā)生，另一方面可能對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖有保護(hù)促進(jìn)作用，自噬對(duì)腫瘤的作用與各種細(xì)胞類型和特定的腫瘤發(fā)展階段有關(guān)。目前對(duì)自噬的研究中，Beclin1、LC3、和p62是比較公認(rèn)的自噬標(biāo)記蛋白。Beclin1是自噬的啟動(dòng)基因，它有增強(qiáng)自噬的作用[20]。LC3在形成自噬小體過程中起到錨定作用，指導(dǎo)溶酶體包裹，是評(píng)價(jià)自噬發(fā)生水平的重要指標(biāo)，包括LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ，LC3-Ⅰ是LC3的非活化形式。當(dāng)自噬被激活時(shí)，LC3-I會(huì)將一個(gè)小肽水解成 LC3-II 并聚集在自噬體膜上[13]。因此，LC3-Ⅱ水平某種程度上反映了自噬的程度，是細(xì)胞內(nèi)自噬的特異性蛋白標(biāo)志[14]。p62是自噬吞噬過程中的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，與LC3結(jié)合，運(yùn)輸被溶酶體包裏的細(xì)胞器，p62的表達(dá)水平和自噬呈負(fù)相關(guān)。本研究用流式細(xì)胞檢測(cè)木犀草素處理前后的鼻咽癌細(xì)胞凋亡率，發(fā)現(xiàn)木犀草素可誘導(dǎo)CNE-1細(xì)胞凋亡,并且凋亡率和木犀草濃度的增加相關(guān)。Western印跡結(jié)果顯示，Bcl-2蛋白表達(dá)下降，提示誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是木犀草素抑制鼻咽癌生長(zhǎng)的重要機(jī)制之一。用不同濃度的木犀草素處理鼻咽癌細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)隨著藥物濃度的升高，被處理細(xì)胞自噬小體增加，同時(shí)蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ顯著升高，Beclin-1升高，p62下降，這表明木犀草素除了除了明顯抑制CNE-1細(xì)胞的活力外，還可促進(jìn)LC3的表型轉(zhuǎn)變，提示木犀草素可誘導(dǎo)CNE-1細(xì)胞發(fā)生自噬。細(xì)胞凋亡與自噬之間的關(guān)系是復(fù)雜的，其互補(bǔ)作用最為普遍且被廣泛認(rèn)可。在腫瘤細(xì)胞中，自噬受多種信號(hào)通路的調(diào)控[15]，其中磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/mTOR)通路是最經(jīng)典的一條。PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路由 PI3K、Akt 和mTOR三種蛋白酶構(gòu)成，PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路軸通過促進(jìn)細(xì)胞增殖和阻礙凋亡在NPC的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[16]。此前有報(bào)道稱它與細(xì)胞功能如增殖、遷移和轉(zhuǎn)移有關(guān)。此外，越來越多的證據(jù)表明Akt/ mTOR級(jí)聯(lián)控制自噬，自噬可以定義呼叫的存活和壞死，并在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮關(guān)鍵作用，激活A(yù)kt可通過調(diào)節(jié)mTOR信號(hào)通路阻礙自噬。本研究結(jié)果表明，木犀草素明顯阻斷了CNE-1細(xì)胞中的 PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，通過刺激CNE-1細(xì)胞中的凋亡和(或)自噬抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。