湯海霞，張 艷，葛武鵬*，宋宇軒，王海燕，王爽爽

（1 西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 陜西楊凌 712100 2 富平縣檢驗(yàn)檢測(cè)中心 陜西省羊乳產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心 陜西富平 711700 3 西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 陜西楊凌 712100）

高血壓是常見的慢性病之一，以動(dòng)脈血壓持續(xù)升高作為主要特征，也是我國(guó)心腦血管（cardiovascular）病人死亡的主要原因[1]。控制高血壓是心腦血管病預(yù)防的切入點(diǎn)和關(guān)鍵措施，而血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（Angiotensin-I-converting enzyme，ACE）可將腎素-血管緊張素系統(tǒng)（Renin-angiotensinsystem，RAS） 的血管緊張素I 轉(zhuǎn)化為血管緊張素Ⅱ（血管收縮劑），使激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)（Kallikrein-kininsystem，KKS） 中血管舒緩激肽C失活，從而失去降血壓的功能[2]。通過(guò)抑制ACE 酶活性，降血壓肽在降低血壓中發(fā)揮重要作用[3]。

酪蛋白是活性肽的良好來(lái)源，很多研究已驗(yàn)證牛奶、駝奶、山羊奶和牦牛奶來(lái)源的酪蛋白具有降血壓功能[4-7]。目前對(duì)于綿羊奶的研究主要集中在理化特性、營(yíng)養(yǎng)成分、微生物檢測(cè)、酸奶和奶酪制作等方面[8-11]，關(guān)于綿羊奶活性肽方面的研究相對(duì)較少。Tagliazucchi 等[12]通過(guò)體外模擬胃腸道環(huán)境消化牛奶、駝奶、山羊奶和綿羊乳，比較4 種乳源制備的ACE 抑制活性肽，結(jié)果表明綿羊奶水解物的降血壓效果明顯高于其它3 種奶。Hernández-Ledesma 等[13]使用不同蛋白酶水解綿羊奶和山羊奶乳清中分離的β-乳球蛋白，得到高抑制率的ACE 活性肽，而關(guān)于酶法制備綿羊奶酪蛋白ACE 抑制肽的研究鮮見報(bào)道。研究表明ACE抑制肽C-末端常含有Phe、Trp 等疏水性氨基酸[14]，N-末端含有亮氨酸或堿性氨基酸等特點(diǎn)[15]，結(jié)合蛋白酶的酶切位點(diǎn)，試驗(yàn)選擇5 種蛋白酶（堿性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K 和中性蛋白酶）水解酪蛋白。

本研究的目的是確定綿羊乳酪蛋白最佳酶解工藝，并從酪蛋白水解物中篩選和鑒定一種新的ACE 抑制肽，闡明其活性機(jī)制。利用LC-MS 鑒定酪蛋白水解物中的肽并合成一種新的ACE 抑制肽，測(cè)定其IC50值和ACE 抑制動(dòng)力學(xué)，使用分子對(duì)接解釋肽段對(duì)ACE 的抑制機(jī)制，為綿羊乳產(chǎn)品的開發(fā)和降血壓肽產(chǎn)品的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綿羊乳，采自金昌奶綿羊試驗(yàn)示范基地；酪蛋白，實(shí)驗(yàn)室制備；堿性蛋白酶（2.4LFG）、中性蛋白酶（0.8 L），諾維信公司提供；胰蛋白酶（2 500 U/mg），上海源葉有限公司；蛋白酶K，德國(guó)Meker 公司；胃蛋白酶（≥250 U/mg）、鄰苯二甲醛（OPA）、L-絲氨酸，北京索萊寶有限公司；馬尿酸-組氨酸-亮氨酸（HHL），上海麥克林有限公司；血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）、色譜級(jí)乙腈，美國(guó)Sigma 公司；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

Orbitrap Fusion Lumos Tribrid MS 三合一質(zhì)譜儀，美國(guó)ThermoFisher 公司；?KTA 蛋白純化系統(tǒng)，美國(guó)GE 公司；高速冷凍離心機(jī)，安徽中科公司；真空冷凍干燥機(jī)，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司；1100 型高效液相色譜，美國(guó)Agilent 公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋白酶篩選 將酪蛋白配成底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的溶液，在各酶的最適條件下酶解（見表1），并以1 mol/L NaOH 維持酶解體系的pH 值不變，90 min 后水浴滅活（95 ℃，15 min），冷卻至室溫后調(diào)pH 值為7，離心（10 000×g 15 min，4 ℃）取上清液，測(cè)定樣品的水解度和ACE 抑制率。

表1 不同蛋白酶最適水解條件Table 1 The optimum enzyme hydrolysis conditions of different proteases

1.3.2 單因素試驗(yàn) 選擇堿性蛋白酶作為酪蛋白最佳水解酶，保持其它條件不變，考察酶解時(shí)間（60，90，120，150，180 min）、pH（6，7，8，9，10）、溫度（45，50，55，60，65 ℃）、酶添加量E/S（1%，2%，3%，4%，5%）、底物含量（4%，6%，8%，10%，12%）對(duì)酪蛋白水解物ACE 抑制率的影響。

1.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化 基于單因素試驗(yàn)確定pH 值為6，底物含量為8%，在此條件下選擇酶解溫度、酶添加量、酶解時(shí)間3 個(gè)因素，以水解液ACE 抑制率為指標(biāo)，設(shè)計(jì)三因素三水平試驗(yàn)優(yōu)化酶解條件，試驗(yàn)因素及水平見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface experiment

1.3.4 ACE 抑制率的測(cè)定 ACE 抑制率的測(cè)定采用高效液相色譜法[16]。向離心管中加入10 μL樣品和30 μL 2.5 mmol/L HHL，37 ℃培養(yǎng)5 min，加入20 μL 0.1 U/mL ACE 后37 ℃振蕩培養(yǎng)60 min，最后加入60 μL 的1 mol/L HCL 終止反應(yīng)。ACE 酶解釋放的HA（馬尿酸）峰面積通過(guò)HPLC測(cè)定。

測(cè)定馬尿酸標(biāo)準(zhǔn)曲線：將馬尿酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 mg/mL）稀釋為：25，50，80，100，300 和400 μg/mL，上樣量5 μL，以峰面積為縱坐標(biāo)，馬尿酸濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

ACE 抑制率（%）=（ΔAControl-ΔAsample/ΔAControl）×100

式中：ΔAControl和ΔAsample分別代表空白（緩沖液）和樣品中HA 的峰面積。

1.3.5 酪蛋白水解度的測(cè)定 水解度（Degree of hydrolysis，DH）的測(cè)定采用OPA 法[17]。

1.3.6 酪蛋白水解液分子質(zhì)量的測(cè)定 分子質(zhì)量的測(cè)定采用凝膠色譜法（gel filtration chromatography，GFC）[18]。試驗(yàn)選擇牛乳白蛋白（6 800 u）、α-乳白蛋白（14 186 u）、維生素B12（1 355 u）、氧化型谷胱甘肽（612.63 u）、甘氨酸（75 u）為標(biāo)準(zhǔn)品，以出峰時(shí)間為橫坐標(biāo)，分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.7 ACE 抑制肽的結(jié)構(gòu)鑒定 采用Orbitrap Fusion Lumos Tribrid MS 三合一質(zhì)譜儀對(duì)小于3 ku 的組分進(jìn)行多肽的結(jié)構(gòu)鑒定，色譜柱：預(yù)柱C18-（2 cm×100 μm）、分析柱C18-（15 cm×75 μm，5 μm 120A）；流動(dòng)相A：0.1%甲酸的水，流動(dòng)相B：0.1%甲酸的乙腈；梯度洗脫程序?yàn)?～2 min，8%～18% B；2～32 min，18%～35% B；32～34 min，35%～100% B；34～42 min，100% B；進(jìn)樣量：5 μL；流速：300 nL/min。質(zhì)譜條件參考劉靜波的方法[19]，其中質(zhì)量掃描范圍調(diào)整為350～1 600（m/z），比對(duì)軟件：ThermoproteomeDiscover。

1.3.8 ACE 抑制肽的合成及IC50的測(cè)定 采用固相合成方法對(duì)挑選的肽段進(jìn)行合成（純度≥98%），此步驟由上海生工生物工程股份有限公司完成，后對(duì)合成肽的ACE 抑制率的IC50進(jìn)行測(cè)定。

1.3.9 ACE 抑制肽動(dòng)力學(xué)研究 肽段對(duì)ACE 酶抑制模式參考Bhaskar 等[20]方法并稍加修改。將LFRQFY（0，3，9 μmol/L）和不同濃度的HHL（0.5，2，2.5，3.5 mmol/L） 與ACE 按1.3.5 節(jié)方法混合測(cè)定馬尿酸的含量，使用雙倒數(shù)做圖分析抑制動(dòng)力學(xué)。

1.3.10 分子對(duì)接 分析抑制肽和ACE 酶之間的分子水平相互作用，使用Discovery Studio 2019軟件模擬分子對(duì)接。多肽的分子結(jié)構(gòu)由軟件的Macromolecules 模塊中Build and Edit Protein 生成，再用Small Molecules 中的Full Minimization進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化。ACE 晶體結(jié)構(gòu)（代碼：1O8A）從RCSB 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)下載PDB 格式。使用軟件的Macromolecules 模塊中的Clean Protein 對(duì)ACE 分子進(jìn)行清洗、制備、除水和加氫處理，然后以Zn2+原子為活性中心，定義活性坐標(biāo)為（X：38.977，Y：38.645，Z：50.183），對(duì)接半徑為15?。選擇程序CDOCKER 進(jìn)行半柔性分子對(duì)接[21]，基于CDOCKER 能量分?jǐn)?shù)、相互作用位點(diǎn)和與ACE 的相互作用力類型來(lái)評(píng)估分子對(duì)接的結(jié)果。

1.3.11 數(shù)據(jù)分析 通過(guò)Design-Expert 11.0 軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析，Origin 2018 分析軟件數(shù)據(jù)處理和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶的篩選

在相同酶解條件下，比較5 種蛋白酶對(duì)酪蛋白的水解能力。由圖1a 所示，5 種蛋白酶中胃蛋白酶的水解度最小為（2.8±0.12）%，胰蛋白酶的水解度最大為（10.58±0.09）%，5 種蛋白酶水解液的水解度存在顯著性差異（P＜0.05）。在本試驗(yàn)中，5種蛋白酶水解液的水解度排序?yàn)椋篩＞K＞Z＞J＞W(wǎng)。這可能與蛋白酶的酶切位點(diǎn)以及酶活有關(guān)。

為了進(jìn)一步了解5 種蛋白酶對(duì)酪蛋白的酶解和多肽釋放的影響，酶解前后使用GFC 比較蛋白/肽的分子質(zhì)量大小分布（圖1b）。酶解前，酪蛋白（CP） 溶液主要含有分子質(zhì)量大于10 ku 的物質(zhì)。這與報(bào)道的酪蛋白中主要蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量一致[22]。與酪蛋白原液相比，水解后的酪蛋白水解物中（＞10 ku）蛋白質(zhì)的比例顯著降低，小分子質(zhì)量的組分（＜3 ku）增多，并且隨著水解的增大其所占比例逐漸增加。

圖1 不同蛋白酶酶解對(duì)酪蛋白水解液的水解度（a）、分子質(zhì)量分布（b）和ACE 抑制率（c）的影響Fig.1 Effects of different proteases on degree of hydrolysis（a），molecular weight distribution（b）and ACE inhibition rate（c） of casein hydrolysate

酪蛋白水解液的ACE 抑制率結(jié)果如圖1c 所示，5 種蛋白水解液中，ACE 抑制率最高的是堿性蛋白酶（90%±0.07%），和蛋白酶K 沒(méi)有顯著差異（P＞0.05），中性蛋白酶水解液ACE 抑制率最低（79.8%±0.78%），并與胰蛋白酶水解液無(wú)顯著差異（P＜0.05）。在研究中，綿羊乳酪蛋白水解產(chǎn)物的ACE 抑制率高于Ugwu 等[23]用胃蛋白酶和胰蛋白酶水解駝奶和馬奶來(lái)源的酪蛋白及Xu 等[24]用中性蛋白酶處理牛乳酪蛋白獲得水解產(chǎn)物的ACE抑制率，原因可能與不同乳源的酪蛋白結(jié)構(gòu)存在差異以及酶添加量有關(guān)。綜合考慮，選擇堿性蛋白酶進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 酶解時(shí)間對(duì)酪蛋白水解液的影響 圖2顯示，在60 min 至120 min，酪蛋白水解度迅速增加，120 min 之后，酪蛋白水解度趨于穩(wěn)定。ACE 抑制率隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)呈先增加后穩(wěn)定下降的趨勢(shì)，酪蛋白水解液在90 min 抑制率最高。這一結(jié)論與Kim 等[25]研究一致，隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，ACE 抑制率先增加后降低，最初產(chǎn)生的ACE 抑制肽隨后被降解。

圖2 酶解時(shí)間對(duì)ACE 抑制率和水解度的影響Fig.2 Effect of enzymolysis time on ACE inhibition rate and degree of hydrolysis

2.2.2 酶解pH 值對(duì)酪蛋白水解液的影響 圖3顯示，隨著pH 值的增加，酪蛋白水解度顯著性增大（P＜0.05），而ACE 抑制率則緩慢降低。這是因?yàn)殡S著水解度增大酪蛋白被過(guò)度水解，產(chǎn)生的ACE 抑制肽被酶解更小分子的多肽和氨基酸從而失去降血壓作用[26]。因此選擇pH 6 為最適酶解條件。

圖3 酶解pH 值對(duì)ACE 抑制率和水解度的影響Fig.3 Effect of enzymolysis pH on ACE inhibition rate and degree of hydrolysis

2.2.3 酶解溫度對(duì)酪蛋白水解液的影響 圖4顯示，酪蛋白水解度隨著酶溫度升高而增大。在一定溫度范圍內(nèi)，升高溫度能夠加快化學(xué)反應(yīng)的速度，提高底物和酶的結(jié)合幾率，使酪蛋白水解度增加[27]。ACE 抑制率隨著溫度的上升呈現(xiàn)出先增加后下降的趨勢(shì)，在50 ℃得到最大值。結(jié)合水解度分析，適當(dāng)水解可以提高酪蛋白水解物的ACE 抑制率，但過(guò)度水解則會(huì)破壞短肽段的分子結(jié)構(gòu)使其失去活性。試驗(yàn)選擇50 ℃作為最佳酶解溫度。

2.2.4 酶添加量對(duì)酪蛋白水解液的影響 圖4顯示，當(dāng)酶添加量從1%增加4%時(shí)，水解度顯著性增加（P＜0.05），但當(dāng)酶添加量增加到5%時(shí)，水解度無(wú)顯著性變化（P＞0.05）。這是因?yàn)楫?dāng)酶添加量增加到一定程度，酶與底物已充分結(jié)合，加大酶用量對(duì)于酶解效果的影響越來(lái)越小。而ACE 抑制率則先升高后下降，在3%有最大值。試驗(yàn)中水解度和ACE 抑制率隨酶添加量的變化趨勢(shì)與Guo 等[28]使用蛋白酶水解乳清蛋白的結(jié)果相似。

圖4 酶解溫度對(duì)ACE 抑制率和水解度的影響Fig.4 Effect of enzymolysis temperature on ACE inhibition rate and degree of hydrolysis

圖5 酶添加量對(duì)ACE 抑制率和水解度的影響Fig.5 Effect of enzyme addition on ACE inhibition rate and degree of hydrolysis

2.2.5 底物含量對(duì)酪蛋白水解液的影響 圖6顯示，隨著底物含量的增加，酪蛋白水解度先降低后處于穩(wěn)定。當(dāng)?shù)孜锖窟^(guò)高時(shí)，會(huì)減弱反應(yīng)體系的流動(dòng)性，限制了酶與底物的接觸，導(dǎo)致水解度降低；水解物的ACE 抑制率則先上升后下降，在底物含量8%時(shí)達(dá)到最大值，因此選擇底物含量8%作為最佳水解條件。

圖6 底物濃度對(duì)ACE 抑制率和水解度的影響Fig.6 Effect of substrate concentrations on ACE inhibition rate and degree of hydrolysis

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及分析 按Box-Behnken 原理進(jìn)行響應(yīng)面分析，試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Experimental design and results for response surface analysis

利用Design-Expert 軟件獲得的ACE 抑制率的二次回歸模型為：Y=92.9+2.86A+0.21B+0.7C+0.63AB+0.4AC-1.2BC-0.29A2+1.01B2+1.54C2。

方差分析結(jié)果如表4所示。模型的回歸系數(shù)R2=0.9756，說(shuō)明方程對(duì)試驗(yàn)擬合度良好；R2Adj=0.9390，說(shuō)明表明該模型能解釋93.9%響應(yīng)值變化。模型P=0.0004＜0.001 極顯著；失擬項(xiàng)P=0.408＞0.05 不顯著，表明模型擬合度很好，可用此模型預(yù)測(cè)酶解溫度、酶添加量和酶解時(shí)間對(duì)酪蛋白水解物的ACE 抑制率影響。模型中一次項(xiàng)A 影響極顯著，二次項(xiàng)C2和交互項(xiàng)BC 影響高度顯著，一次項(xiàng)C 和二次項(xiàng)B2影響顯著，根據(jù)F 值可知各因素對(duì)綿羊乳酪蛋白的影響順序?yàn)槊附鉁囟龋久附鈺r(shí)間＞酶添加量。

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

（續(xù)表4）

2.3.2 最佳酶解綿羊乳酪蛋白工藝條件的確定及驗(yàn)證 堿性蛋白酶水解綿羊乳酪蛋白最佳工藝參數(shù)為pH 6、底物含量為8%、酶解溫度55 ℃、酶添加量4%、酶解時(shí)間120 min。酪蛋白水解物的ACE 抑制率預(yù)測(cè)值為99.4%。在此條件下3 次驗(yàn)證試驗(yàn)測(cè)得平均值為99.1%，實(shí)際值與模型預(yù)測(cè)值吻合度為99.7%，表明此模型可以用于實(shí)際生產(chǎn)。

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化后酪蛋白水解液的分子質(zhì)量分布

使用響應(yīng)面優(yōu)化后的條件水解酪蛋白得到的水解液的分子質(zhì)量分布如表5所示，與優(yōu)化前90 min 相比，優(yōu)化后的酪蛋白水解液的水解度增加，水解液中大于10 ku 和3～10 ku 的蛋白含量降低，小于1 ku 的多肽含量增加，特別是0.2≤-0.5 ku和0.1≤-0.2 ku 分子質(zhì)量之間的肽段。在BIOPEP數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索降血壓肽得到992 個(gè)肽段并對(duì)其相對(duì)分子質(zhì)量進(jìn)行分析，其中分子質(zhì)量在0.1～0.2 ku 的肽段比例為2.2%，0.2～0.5 ku 肽段比例為43.9%，0.5～1 ku 肽段比例為41.9%，1～1.5 肽段比例為10.4%，1.5～2 肽段比例為1.6%，降血壓肽的相對(duì)分子質(zhì)量主要集中在0.2～1.5 ku。上述結(jié)果在一定程度上解釋了優(yōu)化后酪蛋白水解液的ACE抑制率升高的原因。

表5 酪蛋白水解液的分子質(zhì)量分布Table 5 The molecular weight distribution of casein hydrolysates

2.5 ACE 抑制肽鑒定結(jié)果

經(jīng)質(zhì)譜鑒定出來(lái)的結(jié)果與UniProt sheepcasin數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，共鑒定出484 條肽段，其中源自αs1-酪蛋白有165 條、源自αs2-酪蛋白有122條、源自β-酪蛋白165 條，源自κ-酪蛋白68 條，將鑒定出來(lái)的肽段在數(shù)據(jù)庫(kù)中（BIOPEP、AHTPDB、SwePep、EROPMoscow 和PeptideDB）進(jìn)行搜索比對(duì)，發(fā)現(xiàn)酪蛋白酶解液中已經(jīng)驗(yàn)證具有ACE抑制活性的肽段10 條（表7），這也解釋了酪蛋白酶解液高ACE 抑制率的原因。同時(shí)利用網(wǎng)站PeptideRanker（http：//distilldeep.ucd.ie/PeptideRanker/）對(duì)肽段進(jìn)行打分，選擇評(píng)分大于0.80 的肽段為潛在的生物活性肽，同時(shí)選擇ToxinPred（http：//web.expasy.org/protparam/）網(wǎng)站進(jìn)行毒性預(yù)測(cè)、網(wǎng)站Expasy-Compute 的pI/Mw（https：//web.expasy.org/compute_pi/）預(yù)測(cè)肽段的分子質(zhì)量及等電點(diǎn)，并結(jié)合已驗(yàn)證ACE 抑制肽的氨基酸序列結(jié)構(gòu)，在鑒定結(jié)果中篩選出一條新的生物活性肽段LFRQFY。

表7 潛在的ACE 抑制肽Table 7 The potential ACE inhibitory peptides

2.6 肽段合成與活性驗(yàn)證

將肽段LFRQFY 進(jìn)行固相合成法合成，純度都大于98%。對(duì)合成的肽段進(jìn)行體外ACE 抑制活性驗(yàn)證，其IC50值（7.9±1.7）μmol/L。這肽段氨基酸序列與封梅[15]的報(bào)道相一致：氨基酸序列C 末端含有酪氨酸，N-末端含有亮氨酸或堿性氨基酸，對(duì)該肽的ACE 抑制活性起到積極的影響。同時(shí)Soleymanzadeh 等[29]從駝奶β-酪蛋白分離得到的7肽MVPYPQR（IC50=30 μmol/L）；Villadóniga 等[30]從α-乳白蛋白鑒定的兩個(gè)ACE 抑制肽：TTFHTSGY（IC50=142 μmol/L） 和GYDTQAIVQ（IC50=1.0 mmol/L）。

表6 酪蛋白水解液中具有ACE 抑制活性的肽段Table 6 Peptides with ACE inhibitory activity in casein hydrolysate

圖7 LFRQFY 的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.7 Secondary mass spectra of LFRQFY

2.7 LFRQFY 對(duì)ACE 的抑制模式分析

為了評(píng)價(jià)新的ACE 抑制肽的活性機(jī)制，通過(guò)使用Linewaver-Burk 圖研究抑制肽LFRQFY 對(duì)ACE 的抑制模式。有研究表明Lineweaver-Burk 的雙倒數(shù)作圖，若隨著抑制物濃度的增加，其Vmax減小，Km增大或減小，說(shuō)明該抑制類型屬于混合型抑制[31]。如圖8所示，Vm和Km值都隨著抑制肽濃度的增加而降低，表明抑制肽可以與酶的活性和非活性位點(diǎn)的位置結(jié)合，從而降低了血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的催化活性。相似的，Sangsawad 等[32]從熟雞胸肉中分離得到的KPLL 和KP 以及Forghani等[33]從刺參中分離得到的EVSQGRP、VSRHFASYAN 和SAAVGSP 也顯示出對(duì)ACE 的混合抑制模式。

圖8 肽段LFRQFY 對(duì)ACE 的Lineweaver－Burk 圖Fig.8 Lineweaver-Burk plot of ACE inhibition by the peptide LFRQFY

2.8 LFRQFY 與ACE 的分子對(duì)接分析

圖9 ACE-LFRQFY 復(fù)合體的3D 結(jié)構(gòu)圖Fig.9 3D structure diagram of ACE-LFRQFY

圖11 ACE-LFRQFY 復(fù)合體的2D 結(jié)構(gòu)圖Fig.11 2D structure diagram of ACE-LFRQFY

使用Discovery Studio 2019 軟件將LFRQFY與ACE 進(jìn)行半柔性對(duì)接，分析LFRQFY 與ACE的分子水平的相互作用機(jī)制。分子對(duì)接結(jié)果中的“-CDOCKER Energy”和“-CDOCKER Interaction Energy”值可以評(píng)價(jià)受體與配體親和力，其相對(duì)值越高，表明肽段與ACE 結(jié)合越緊密[34]。ACELFRQFY 復(fù)合物的 “-CDOCKER Energy” 值和“-CDOCKER Interaction Energy” 值分別為114.404 和97.433，表明肽段LFRQFY 對(duì)ACE 具有很強(qiáng)的結(jié)合親和力。圖10和表8顯示，肽段LFRQFY 與ACE 殘 基Asp 415、Tyr360、His353、Glu143、Asn70、Ala354、Arg522 和His383 形 成8個(gè)氫鍵，研究表明氫鍵是維持ACE-LFRQFY 復(fù)合物穩(wěn)定的主要作用力[35]，與殘基Phe457、Ala354、TYR62、Val380 形成的疏水相互作用也有助于LFRQFY-ACE 復(fù)合物的穩(wěn)定性。其中與ACE 催化活性位點(diǎn)上氨基酸殘基Ala354（活性口袋S1）形成氫鍵和疏水相互作用、His353（活性口袋S2）形成的2 個(gè)氫鍵，表明了LFRQFY 能夠與ACE 催化位點(diǎn)S1 和S2 口袋緊密結(jié)合。Fan 等[36]從大黃魚中鑒定出具有顯著降血壓作用的ACE 抑制肽WAR 和WQR 也與ACE 活性殘基Ala354、His353形成氫鍵。因此，肽LFRQFY 是一種新型有效的酪蛋白源ACE 抑制肽。

圖10 ACE-LFRQFY 復(fù)合體的局部圖Fig.10 Partial graph of ACE-LFRQFY

表8 ACE-LFRQFY 復(fù)合物在最佳構(gòu)象中觀察到的氫鍵以及靜電和疏水相互作用Table 8 Hydrogen bonds and electrostatic and hydrophobic interactions observed in the best peptide poses based on the ACE-peptide complex

3 結(jié)論

通過(guò)蛋白酶篩選，單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)確定了綿羊乳酪蛋白ACE 抑制肽最佳水解條件，優(yōu)化后的綿羊乳酪蛋白水解液ACE 抑制率達(dá)到99.1%，表現(xiàn)出極佳的降血壓潛力。小于3 ku 組分經(jīng)過(guò)質(zhì)譜鑒定氨基酸序列，在質(zhì)譜結(jié)果中發(fā)現(xiàn)了10 條已報(bào)道的具有ACE 抑制活性的肽段，這解釋了酪蛋白酶解液高ACE 抑制率的原因。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)了一條新穎的肽段LFRQFY，其IC50值為（7.9±1.7） μmol/L，酶抑制動(dòng)力學(xué)為混合抑制模式；分子對(duì)接結(jié)果表明，LFRQFY 能夠與ACE 的氨基酸殘基Ala354（活性口袋S1）、His353（活性口袋S2）形成氫鍵相互作用，而展現(xiàn)出顯著的體外降血壓活性。本研究建立了酶解法制備高ACE 抑制活性的綿羊乳酪蛋白肽工藝，為后續(xù)綿羊乳精深加工及高值化利用提供一定理論參考依據(jù)。