陶俊鵓，何舒悅，孔令朋，程桂廣

（昆明理工大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品學(xué)院 昆明 650500）

糖尿病是一種因胰島素分泌不足或作用不敏感而引起的碳水化合物代謝紊亂性疾病[1]。糖尿病的致病原因主要分為人體內(nèi)部因素、外界膳食因素及生活方式等，其中，胰島素分泌不足是產(chǎn)生糖尿病最主要的內(nèi)部因素；胰島素分泌不足，體內(nèi)過多的糖類物質(zhì)不能在胰島素調(diào)解下代謝分解，導(dǎo)致血糖累積，從而表現(xiàn)出高血糖的癥狀[2]。如果人體長期處于高血糖的情況下，人體器官和組織會發(fā)生病變，生理功能會衰退，嚴重時可產(chǎn)生并發(fā)癥，危及生命[3]。糖尿病可分為Ⅱ型糖尿病和Ⅰ型糖尿病兩種類型，其中Ⅰ型糖尿病為免疫功能的損傷使機體中的胰島細胞被損壞，最終導(dǎo)致胰島素分泌的絕對不足，其發(fā)病率相對于總糖尿病人數(shù)占10%左右[4]。目前，從根本上治療Ⅰ型糖尿病的藥物還未曾發(fā)現(xiàn)，只能通過對飲食、藥物等方面的調(diào)理加以對Ⅰ型糖尿病進行控制[5]。目前常用的藥物有雙胍類、磺脲類、α-葡萄糖苷酶抑制劑等西藥，這些藥物服用后都有一定的副作用，長期服用可能對人體產(chǎn)生不可逆轉(zhuǎn)的傷害[6]。在我國中醫(yī)藥的發(fā)展中，可用于治療糖尿病的中成藥多達40 余種，因療效穩(wěn)定、作用靶點多、毒副作用小而被大眾普遍接受[7]。植物中所含有的生物堿、皂苷、多酚黃酮及多糖等在降血糖、改善胰島素抵抗方面有較理想的效果。相關(guān)報道指出，通過抗氧化自由基，抑制或降低α-葡萄糖苷酶的活力可達到治療糖尿病的目的[8]。天然、安全和有效的降血糖藥物或輔助降血糖功能食品的開發(fā)是預(yù)防和治療糖尿病的一種發(fā)展趨勢，也是藥食同源干預(yù)病情的重要發(fā)展方向[9-10]。

6’-O-咖啡?；芄眨?'-O-caffeoylarbutin，CA）是一種熊果苷衍生物[11]，是雀嘴茶化學(xué)成分中的主要成分，其含量占花芽干重的22%[12]。研究發(fā)現(xiàn)，CA 對黑色素的抑制效果均比熊果苷理想，其抑制活性為熊果苷的2 倍，細胞毒性僅是熊果苷的1/2[11]。在我國西南地區(qū)，富含6’-O-咖啡?；芄盏娜缸觳璩１划斪髅褡屣嬈?，用于民間預(yù)防風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和作為降血糖茶等；而其主要化學(xué)成分（6’-O-咖啡酰基熊果苷）在防治糖尿病的藥理作用等方面未見報道。因此，為探究6’-O-咖啡酰基熊果苷在Ⅰ型糖尿病中的防治作用，本論文通過四氧嘧啶誘導(dǎo)Ⅰ型糖尿病模型小鼠，研究6’-O-咖啡?；芄諏Β裥吞悄虿⌒∈蟮谋Ｗo作用，為糖尿病藥物和該類食品的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

四氧嘧啶（Alloxan），酷爾化學(xué)科技（北京）有限公司；鹽酸二甲雙胍（Metformin hydrochloride），上海麥克林生化科技有限公司；小鼠胰島素（INS）酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒，武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；甘油三酯（TG）、游離脂肪酸（NEFA）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、堿性磷酸酶（AKP）、丙二醛（MDA）、過氧化氫酶（CAT）、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）、尿素氮（BUN）等試劑盒，北京索萊寶科技有限公司。

GA-3 型血糖儀，南昌彬琪貿(mào)易有限公司；SP-Max 型多功能酶標儀，Molecular Devices 公司等。

1.2 實驗動物

SPF 級昆明種雄性小鼠50 只，體重（20±2）g，購自于昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品材料制備 6’-O-咖啡?；芄眨?’-O-caffeoylarbutin，CA） 由本實驗室分離獲得。

1.3.2 動物模型建立和分組 將50 只小鼠在溫度和濕度恒定的條件下正常喂養(yǎng)7 d，其間提供充足的正常飼料、純凈水，每天按時光照和黑暗各12 h。7 d 后，根據(jù)體重隨機抽取小鼠10 只作空白組小鼠，剩余小鼠全部用于構(gòu)建模型。構(gòu)建模型：小鼠先禁食一晚，之后按照每千克小鼠注射200 mg 四氧嘧啶的劑量進行腹腔注射；1 周后，對模型組小鼠空腹血糖進行測定，若值高于11.1 mmol/L，則造模成功。建模成功后，將建模成功的小鼠隨機分為模型組（10）、陽性對照組（10）、CA 低劑量組（10）、CA 高劑量組（10）。陽性對照組小鼠給藥二甲雙胍（10 mg/kg/d bw）；CA 高、低劑量組分別以灌胃的方式給藥6’-O-咖啡?；芄?00，100 mg/kg/d；空白對照組和模型組小鼠以相同的方式給予生理鹽水。在糖尿病小鼠被藥物干預(yù)后，給予充足純凈水和正常飼料飼養(yǎng)4 周，并每隔7 d稱量一次小鼠體重和測量小鼠的血糖值。

1.3.3 葡糖糖耐糖量測定 各試驗組小鼠被藥物干預(yù)4周后，禁食1 晚，根據(jù)灌胃劑量2 g/kg 灌胃葡萄糖溶液，尾靜脈取血測量后0，15，30，60，120 min 時的血糖值。

1.3.4 血清及血清指標測定 通過眼球取血收集血液，并在低溫離心機（3 500 r/min） 中離心10 min，吸取上層血清于離心管中并保存于-80 ℃冰箱；根據(jù)試劑盒說明書測定血清中的胰島素（INS）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、糖甘油三酯（TG）、游離脂肪酸（NEFA）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）含量。

1.3.5 組織樣品采集、臟器指數(shù)測定和臟器組織指標測定 眼球取血后，頸椎脫臼處死小鼠，取肝、胰、胸、脾和腎等臟器進行稱重，并以臟器質(zhì)量（mg）與小鼠體重（g）的比值計算各組小鼠的臟器指數(shù)；另各組取部分臟器組織浸泡于10%的甲醛固定液中，剩余液氮冷凍并放置-80 ℃冰箱保存。

取已被凍存的肝臟和腎臟組織按組織質(zhì)量（mg）與0.9%生理鹽水體積（mL）為1∶4 的比例混合，在4 ℃下超聲破碎，4 ℃的離心機中（3 500 r/min）離心10 min，吸取上清液；取肝臟組織上清液測定總蛋白、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA） 含量、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、堿性磷酸酶（AKP）含量、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）活力和測定腎臟組織液中尿素氮（BUN）含量。

1.3.6 臟器組織病理學(xué)檢查 取出固定于10%的甲醛固定液中的腎臟、肝臟和胰腺組織，用石蠟將其包埋，包埋好后，將石蠟切成2～3 μm 厚度的切片，并對切片進行HE 染色；于顯微鏡下觀察各組切片，并評價各組臟器組織的病變情況。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用SPPS 17.0 和Origin 8.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理分析，試驗結(jié)果表示為平均值±標準方差，多組比較采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 小鼠體重的變化

四氧嘧啶能選擇性地破壞胰島β 細胞，導(dǎo)致血液中胰島素含量的下降及高血糖的產(chǎn)生，降低糖類物質(zhì)的利用率，致使小鼠消瘦[13]。試驗中小鼠體重的變化如圖1所示：隨著飼養(yǎng)時間的變化，所有試驗組小鼠的體重都有不同程度上升的趨勢；與模型組相比，空白組的小鼠體重上升最為明顯；模型組小鼠飼養(yǎng)2 周后，體重上升的趨勢越來越慢；在CA 低劑量組、高劑量組和陽性對照組中，小鼠體重上升趨勢優(yōu)于模型組，且CA 高劑量組小鼠體重上升趨勢最好；這說明CA 能抑制糖尿病小鼠體重的降低。

圖1 6’-O-咖啡?；芄眨–A）對小鼠體重的影響Fig.1 Effects of 6’-O-caffeoylarbutin（CA）on body weight in mice

2.2 小鼠血糖的變化

每隔1 周定時通過尾部靜脈取血測量小鼠的血糖，血糖值變化如圖2所示：空白組的血糖含量在飼養(yǎng)過程中變化趨勢不大，都處于較低的值；其余各試驗組中小鼠的血糖值明顯高于空白組；但隨著周數(shù)增加，模型組和給藥組中小鼠的血糖值都有明顯的降低，陽性對照組血糖值下降的趨勢最為明顯，其次是6’-O-咖啡?；芄崭邉┝拷M，再者是6’-O-咖啡?；芄盏蛣┝拷M，模型組中小鼠血糖值下降最為緩慢；這說明6’-O-咖啡?；芄諏μ悄虿⌒∈笱侵涤懈纳谱饔?，高劑量效果優(yōu)于低劑量效果。

圖2 6’-O-咖啡?；芄眨–A）對小鼠血糖的影響Fig.2 Effects of 6’-O-caffeoylarbutin（CA） on fasting blood glucose in mice

2.3 6’-O-咖啡酰基熊果苷對小鼠臟器指數(shù)的影響

糖尿病小鼠的臟器指數(shù)如表1所示：相比于空白組，模型組小鼠的肝臟指數(shù)、胸腺指數(shù)、腎臟指數(shù)和脾臟指數(shù)值均高于正常組，表明小鼠的臟器都有一定的損傷；而在給藥組（CA 低、高劑量和鹽酸二甲雙胍）后，小鼠的臟器指數(shù)相比模型組都有一定程度的降低，其中陽性對照組（鹽酸二甲雙胍）的臟器指數(shù)最接近空白組，其次是CA 高劑量組。對于胰腺，空白組小鼠的胰腺指數(shù)顯著大于糖尿病小鼠（P＜0.05）；相比模型組，給藥組（鹽酸二甲雙胍和CA 低、高劑量）中糖尿病小鼠的胰腺指數(shù)有所上升，陽性對照組上升最為明顯（P＜0.05），其次是CA 高劑量組。這說明在Ⅰ型糖尿病中，CA可以使各臟器指數(shù)向正常水平恢復(fù)，CA 高劑量對糖尿病小鼠各臟器的保護作用優(yōu)于CA 低劑量。

表1 6’-O-咖啡?；芄眨–A）對小鼠臟器指數(shù)的影響Table 1 Effect of 6’-O-caffeoylarbutin（CA） on organ index in mice

2.4 6’-O-咖啡?；芄諏π∈笃咸烟悄褪芰康挠绊?/h3>

在試驗4 周后，對各組小鼠進行葡萄糖耐量測量，并以此觀察CA 對糖尿病小鼠胰島素分泌的調(diào)節(jié)能力。結(jié)果如圖3所示，各組小鼠被灌胃葡糖后，在15 min 內(nèi)各組小鼠的血糖值均急劇上升；15 min 的時候，空白組的血糖值上升到最大值，120 min 后血糖值下降到正常值范圍；模型組和給藥組小鼠血糖值在30 min 時上升到最大值；30 min 到120 min 之間，給藥組和模型組都有一定程度的降低，但值均高于空白組。各組小鼠在被灌胃葡糖糖后的120 min 內(nèi)，陽性對照組的耐糖量水平一直低于模型組，說明鹽酸二甲雙胍能提高小鼠耐糖量水平。與模型組相比，6’-O-咖啡酰基熊果苷高、低劑量組均能不同程度的降低糖尿病小鼠的血糖值，高劑量組效果較為明顯（P＜0.05）。

圖3 6’-O-咖啡?；芄眨–A）對糖尿病鼠糖耐量的影響Fig.3 Effects of 6’-O-caffeoylarbutin（CA）on glucose tolerance in diabetic mice

2.5 6’-O-咖啡?；芄諏π∈笱逯笜说挠绊?/h3>

糖尿病中胰島素嚴重缺乏會引發(fā)高血脂癥，血液中的甘油三酯、低密度脂蛋白、膽固醇等脂質(zhì)會增高，脂質(zhì)增高反過來也會加重糖尿病病情，兩者相互影響，相互促進。因此檢測血液中的甘油三酯、低密度脂蛋白、膽固醇等指標可反映糖尿病患者的嚴重性。試驗中，在給予陽性藥物和6’-O-咖啡酰基熊果苷干預(yù)4 周后，眼球取血并測量各組實驗小鼠血清中與脂代謝相關(guān)的血清指標：血清中胰島素（INS）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、糖甘油三酯（TG）、游離脂肪酸（NEFA）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）。

從表2可知，空白組小鼠血清中的TC、TG、NEFA 和LDL-C 的含量都顯著低于模型組小鼠，模型組中HDL-C 和INS 顯著低于空白組小鼠（P＜0.05）。與模型組相比，陽性對照組和CA 低、高組小鼠血清中的TC、TG、NEFA 和LDL-C 的含量有不同程度的降低；其中陽性對照組降低得最為明顯，其次是CA 高劑量組，再者是CA 低劑量組；相比于模型組，空白組小鼠中HDL-C 和INS 的含量顯著高于模型組（P＞0.05），CA 低、高劑量組和陽性對照組中小鼠的HDL-C 和INS 含量也有不同程度的升高，其中CA 高劑量組的值接近陽性藥物對照組的值；并且在TG、NEFA 和INS 的含量值中，CA 高劑量組與正常組無顯著性差異（P＞0.05），表明CA 能一定程度上改善Ⅰ糖尿病小鼠的血脂。

表2 6’-O-咖啡?；芄眨–A）對小鼠血清指標的影響Table 2 Effects of 6’-O-caffeoylarbutin（CA） on serum parameters in mice

2.6 6’-O-咖啡酰基熊果苷對小鼠肝臟指標的影響

肝臟是葡萄糖倉庫，是胰島素的作用器官之一；若糖尿病患者中血糖不能得到很好的控制可能會導(dǎo)致肝損傷，嚴重會發(fā)展成肝癌；肝臟損傷常以活性氧自由基引發(fā)的氧化應(yīng)激為基礎(chǔ)，并伴隨有炎癥。在肝臟組織中：超氧化物歧化酶（SOD）是主要的抗氧化酶，具有抑制ROS 過剩、分解H2O2、阻止脂質(zhì)被氧化、清除自由基的作用[14]；過氧化氫酶（CAT）是催化過氧化氫分解，生產(chǎn)氧和水的酶[15]；谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）是衡量機體抗氧化能力的一個重要指標；丙二醛（MDA）是脂質(zhì)發(fā)生過氧化的最終產(chǎn)物和重要指標[16]；堿性磷酸酶（AKP）和谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）常見于心肌、肝臟等組織中，當這些組織器官發(fā)生病變時，酶的活力會異常增強。為探討CA 對Ⅰ型糖尿病小鼠肝臟的保護作用，試驗檢測與肝損傷有關(guān)的SOD、CAT、GSH-Px、MDA、AKP、ALT 指標如下：

如圖4a、4b、4c 所示，模型組中糖尿病小鼠肝臟中的SOD、CAT、GSH-Px 值顯著低于空白組（P＜0.05）；與模型組相比，給藥鹽酸二甲雙胍能提高肝組織中SOD、CAT、GSH-Px 的含量值；CA 低高組中給予CA 后，CA 高劑量組對糖尿病小鼠肝臟損傷的改善效果相比CA 低劑量組好。肝臟中MDA、AKP、ALT 分別如圖4d、4e、4f 所示：模型組與空白組差異顯著（P＜0.05），說明糖尿病小鼠肝臟有一定的損傷，在給藥組中分別給予陽性藥物鹽酸二甲雙胍和CA 后，都能不同程度的改善肝臟組織中的MDA、AKP、ALT 含量，其中CA 高劑量的效果優(yōu)于CA 低劑量，但是不如陽性對照組效果。這說明在Ⅰ型糖尿病小鼠中，CA 能一定程度上改善糖尿病小鼠肝臟的損傷，對肝臟有一定的保護作用。

圖4 6’-O-咖啡?；芄眨–A）對小鼠肝臟指標的影響Fig.4 Effect of 6’-O-caffeoylarbutin（CA） on liver function in mice

2.7 6’-O-咖啡?；芄諏π∈竽I臟指標的影響

糖尿病會引起糖尿病腎臟病變，嚴重時會造成尿毒癥、腎功能不全。尿素氮（BUN）是人體蛋白質(zhì)代謝的主要終末產(chǎn)物，當腎臟受損時，血漿中的尿素氮的濃度會迅速升高[18]。Ⅰ型糖尿病小鼠中的BUN 濃度如圖5所示，模型組中小鼠的BUN顯著高于空白組；與模型組相比，給藥組中給予鹽酸二甲雙胍和CA 能不同程度改善糖尿病小鼠的BUN 值，其中CA 低劑量組的效果最差，CA 高劑量組與陽性對照組相當。

圖5 6’-O-咖啡酰基熊果苷（CA）對小鼠腎臟尿素氮指標的影響Fig.5 Effect of 6’-O-caffeoylarbutin（CA） on BUN index in kidney of mice

2.8 6’-O-咖啡?；芄諏π∈蟾闻K組織形態(tài)的影響

HE 染色法能在顯微鏡下很清楚直觀的觀察組織細胞的病理情況。Ⅰ型糖尿病小鼠的肝臟組織形態(tài)如圖6所示：空白組中細胞排列有序、形態(tài)完整、細胞核清晰可見；模型組中肝細胞排列較為混亂、細胞形態(tài)不完整、細胞核大小不一、有炎性浸潤，說明模型組中糖尿病小鼠肝臟出現(xiàn)明顯的損傷；給予糖尿病小鼠鹽酸二甲雙胍后，小鼠的肝臟損傷有一定的改善，細胞排列較整齊，相對于模型組小鼠細胞形態(tài)較完整，炎癥浸潤降低；在CA組中，CA 高劑量組中肝臟組織受損程度減小，細胞間隙縮?。坏獵A 低劑量的效果不明顯；說明CA 高劑量對Ⅰ型糖尿病肝臟的保護作用比低劑量效果好。

圖6 小鼠肝臟組織切片F(xiàn)ig.6 The liver tissue sections of mice

2.9 6’-O-咖啡?；芄諏π∈竽I臟組織形態(tài)的影響

腎臟組織HE 染色如圖7所示：正常組中小鼠的腎臟組織的細胞形態(tài)完整、無細胞核聚集、細胞核大小均一；模型組中小鼠的腎臟組織中細胞排列混亂、間隙增大、出現(xiàn)大量的細胞核聚集、細胞形態(tài)不完整；陽性對照組中Ⅰ型糖尿病小鼠被鹽酸二甲雙胍干預(yù)后，腎臟組織中細胞間隙減小、細胞排列有序、細胞核聚集現(xiàn)象減少；糖尿病小鼠被給予CA 后，CA 低劑量組中有細胞核聚集、細胞形態(tài)不完整、有一定的細胞間隙；CA 高劑量組小鼠腎臟中細胞排列有序、細胞間隙較少、細胞核聚集較少；表明CA 的高劑量對糖尿病小鼠腎臟的保護作用優(yōu)于CA 低劑量。

圖7 小鼠腎臟組織切片F(xiàn)ig.7 The kidney tissue sections of mice

2.10 6’-O-咖啡?；芄諏π∈笠认俳M織形態(tài)的影響

Ⅰ型糖尿病小鼠的胰腺切片如圖8所示，模型組與空白組比較，模型組中小鼠胰島形狀不規(guī)則、排列混亂，出現(xiàn)胰島肥大和纖維組織產(chǎn)生；給藥組中給予鹽酸二甲雙胍和CA 后，胰島基本形態(tài)完整，但CA 低劑量組中部分胰島結(jié)構(gòu)不完整、有腺泡侵入現(xiàn)象，而CA 高劑量組和陽性對照組胰腺細胞排列較為整齊均勻、緊密；表明CA 在一定程度上保護糖尿病小鼠的胰腺組織，能對Ⅰ型糖尿病小鼠胰腺組織的損傷有一定的緩解作用。

圖8 小鼠胰腺組織切片F(xiàn)ig.8 The pancreas tissue sections of mice

3 結(jié)論

本試驗通過四氧嘧啶誘導(dǎo)小鼠建立Ⅰ型糖尿病模型，研究6’-O-咖啡?；芄眨–A）對Ⅰ型糖尿病小鼠的降血糖作用和對肝臟、腎臟和胰腺的保護作用。結(jié)果得出：6’-O-咖啡?；芄眨–A）能夠降低Ⅰ型糖尿病小鼠的總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、游離脂肪酸（NEFA）和低密度脂蛋白膽固醇含量（LDL-C）和升高高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和胰島素（INS）含量；提高Ⅰ型糖尿病小鼠肝臟組織中的超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（ALT）活力，降低丙二醛（MDA）含量、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和堿性磷酸酶（AKP） 活力；降低腎臟組織中尿素氮（BUN） 的含量；并有效緩解糖尿病小鼠肝臟、腎臟、胰腺等組織的損傷。