岳宏程，祝德，許加華，何海林，張洪洋，岳興家，張建文，熊良庚

（1.巴中市中心醫(yī)院腫瘤科，四川巴中 636000；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤科，四川瀘州 646000；3.重慶市巴南區(qū)人民醫(yī)院腫瘤科，重慶 401320）

結(jié)腸癌是我國常見的惡性腫瘤[1]，該腫瘤組織中微血管（Microvessel, MV）、淋巴管（lymphatic vessel, LV）、血管生成擬態(tài)（vasculogenic mimicry,VM）等脈管系統(tǒng)豐富，腫瘤通過其獲取營養(yǎng)，并發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移。貝伐珠單抗為傳統(tǒng)的抗血管生成分子靶向藥物，其通過抑制腫瘤MV 生成，從而阻斷腫瘤血液供應(yīng)，達到抑制腫瘤生長的目的。但貝伐珠單抗對LV、VM 無效。腫瘤對貝伐珠單抗的敏感性隨治療時間的延長逐漸降低。探索抑制結(jié)腸癌的綜合治療方式成為當(dāng)前結(jié)腸癌治療的研究熱點。放療聯(lián)合貝伐珠單抗在乳腺癌、大腦膠質(zhì)瘤的治療中獲得了理想的療效，毒副作用較輕[2-3]。但尚未見二者聯(lián)合治療結(jié)腸癌的報道。本實驗通過復(fù)制結(jié)腸癌移植瘤模型，觀察單次近距離放療（singlefraction brachytherapy, SFBR）聯(lián)合貝伐珠單抗對結(jié)腸癌脈管系統(tǒng)和腫瘤生長的影響，為結(jié)腸癌治療方案的設(shè)計提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

結(jié)腸癌CT26 細胞株由西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤科提供；BALB/c 小鼠36 只，雌性，4～5 周齡，體重16～22g，購自重慶騰鑫華阜實驗動物銷售有限公司（合格證編號：11401300024918），飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤科動物房；Ir192三維后裝近距離治療機（荷蘭Nucletron 公司）；貝伐珠單抗注射液（山東齊魯制藥有限公司，規(guī)格：100 mg/4 mL）；抗小鼠CD31、D2-40 單克隆抗體、過碘酸-雪夫（PAS）染色試劑盒（美國Bio World 公司）。

1.2 方法

1.2.1 模型復(fù)制及處理取對數(shù)生長期的CT26 細胞接種于BALB/c 小鼠右側(cè)后腿皮膚，約8～10 d 后成瘤（可以觸及直徑約5 mm 瘤結(jié)節(jié)）。成瘤后隔天檢查移植瘤生長狀態(tài)，測量移植瘤長短徑，計算其體積（V）。待移植瘤直徑達8～10 mm 時將小鼠隨機分為4 組。①空白對照組：經(jīng)尾靜脈注射生理鹽水0.2 mL，注射1 d；②SFBR 組：將放療插植針沿腫瘤長軸插入腫瘤內(nèi)，對小鼠進行CT 掃描，并勾畫靶區(qū)GTV，制定放療計劃。連接后裝放療機，釋放放射源進入插植針中，對腫瘤進行近距離放療，劑量（Dt）=10 Gy/F×1 d。③貝伐珠單抗組：經(jīng)尾靜脈注射貝伐珠單抗5 mg/kg，0.2 mL，注射1 d。④聯(lián)合組：在同一天分別進行SFBR 和貝伐珠單抗的注射，方法同前。治療后第14 天處死小鼠，剝?nèi)ツ[瘤，切取部分腫瘤組織用于流式細胞術(shù)檢測，其余部分立即用10%中性甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，用于免疫組織化學(xué)檢測。

1.2.2 移植瘤體積檢測從腫瘤接種后第10 天開始，每2 天測量小鼠移植瘤的長徑（a）與短徑（b），按公式計算移植瘤體積：V=1/2（a×b2），并求各組腫瘤體積平均值。待移植瘤直徑達8～10 mm 時將小鼠隨機分組并進行治療，治療后第14 天計算腫瘤生長抑制率（tumor growth inhibition rate, TGIR）。TGIR=（對照組腫瘤V-實驗組腫瘤V）/對照組腫瘤V×100%。

1.2.3 腫瘤最大標(biāo)準(zhǔn)攝取值（maximum standard up‐take value，SUVmax）檢測先通過尾靜脈注射利多卡因?qū)⑿∈舐樽?，再進行18F-FDG micro PET/CT 掃描（電壓80 kV；電流500 μA；層距1.5 mm）。采用2D FBP 重建技術(shù)獲取腫瘤18F-FDG 分布融合圖像并計算SUVmax。

1.2.4 腫瘤微血管密度（microvessel density,MVD）檢測按免疫組織化學(xué)SP 法進行CD31 染色，結(jié)果由兩位高年資的病理醫(yī)師在光學(xué)顯微鏡下進行判讀，內(nèi)皮細胞染成棕黃色或棕褐色的管腔結(jié)構(gòu)為腫瘤MV，每張切片隨機選取5 個高倍視野，計數(shù)每個視野MV 個數(shù)，計算5 個視野MV 的平均值即為MVD。

1.2.5 腫瘤淋巴管密度（lymphatic vessel density,LVD）檢測按免疫組織化學(xué)SP 法進行D2-40 染色，結(jié)果由兩位高年資的病理醫(yī)師在光學(xué)顯微鏡下進行判讀，內(nèi)皮細胞染成棕黃色或棕褐色的管腔結(jié)構(gòu)為腫瘤LV，每張切片隨機選取5 個高倍視野，計數(shù)每個視野LV 個數(shù)，計算5 個視野LV 的平均值即為LVD。

1.2.6 腫瘤血管生成擬態(tài)密度（vasculogenic mimicry density, VMD）檢測先按免疫組織化學(xué)SP 法進行CD31 染色，再用濃度為0.5%的過碘酸氧化10 min，蒸餾水清洗后，用雪夫液（PAS）于避光條件下染20 min，吸取0.5%偏重亞硫酸鈉沖洗2 次，每次持續(xù)2 min。結(jié)果由兩位高年資的病理醫(yī)師在光學(xué)顯微鏡下進行判讀，VM 為CD31 陰性而PAS 陽性（紅色）的管腔結(jié)構(gòu)。每張切片隨機選取5 個高倍視野，計數(shù)每個視野VM 個數(shù)，計算5 個視野VM 的平均值即為VMD。

1.2.7 腫瘤細胞Ki-67陽性表達率檢測按免疫組織化學(xué)SP 法進行Ki-67 染色，結(jié)果由兩位高年資的病理醫(yī)師在光學(xué)顯微鏡下進行判讀，細胞核呈黃色或棕黃色為Ki-67 陽性細胞，每張切片隨機選取5 個高倍視野，計數(shù)每個視野Ki-67 陽性細胞占該視野腫瘤細胞的比例，計算5 個視野Ki-67 陽性細胞所占比例的平均值，即為腫瘤細胞Ki-67 陽性表達率。

1.2.8 腫瘤細胞凋亡率檢測取新鮮的腫瘤組織研磨、離心制成懸浮液。懸浮液中加入200 μL 的Binding Buffer 緩沖液，調(diào)整細胞密度為1×106個/mL。吸取195 μL 細胞懸液到流式細胞管中，向管中加入5 μL Annexin V-FITC 試劑。5 min 后向管中加入10 μL 碘化丙啶（PI）試劑，室溫下避光孵育10 min。孵育結(jié)束后向流式細胞管中加入300 μL 無菌PBS液，當(dāng)管中液體充分混勻后將流式細胞管放置流式細胞儀上檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用單因素方差分析或重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 治療后不同時間點各組小鼠移植瘤體積比較

治療后不同時間點小鼠移植瘤體積比較，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①不同時間點的移植瘤體積有差異（F=11 813.804，P=0.000）。②各組的移植瘤體積有差異（F=398.226，P=0.000），聯(lián)合組移植瘤體積最小。③各組移植瘤體積在不同時間點的變化趨勢有差異（F=393.829，P=0.000）。見表1和圖1。

表1 治療后不同時間點各組小鼠移植瘤體積的比較 （n=8，mm3，±s）

表1 治療后不同時間點各組小鼠移植瘤體積的比較 （n=8，mm3，±s）

組別空白對照組SFBR組貝伐珠單抗組聯(lián)合組0 d 309.25±12.45 312.25±13.06 316.13±12.83 315.62±13.96 2 d 588.13±26.16 535.38±20.49 577.75±23.35 480.63±24.73 4 d 827.25±23.41 712.25±24.95 797.63±35.74 517.25±37.24 6 d 1 178.13±37.77 968.75±31.90 1 073.38±43.01 688.38±38.98組別空白對照組SFBR組貝伐珠單抗組聯(lián)合組8 d 1 543.88±46.33 1 167.75±37.23 1 278.38±41.52 742.38±50.47 10 d 1 790.13±47.31 1 364.88±42.32 1 529.37±49.50 901.25±55.11 12 d 2 053.75±40.66 1 478.63±47.87 1 621.88±47.39 1 096.38±62.37 14 d 2 247.75±36.13 1 734.87±74.14 1 705.63±52.83 1 192.25±56.30

圖1 各組腫瘤體積隨時間的變化趨勢

2.2 各組小鼠移植瘤終體積、TGIR及SUVmax的比較

各組小鼠移植瘤終體積比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=428.948，P=0.000），聯(lián)合組移植瘤終體積小于SFBR 組和貝伐珠單抗組（P<0.05），SFBR 組與貝伐珠單抗組間無差異（P>0.05）。各治療組TGIR 比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=180.086，P=0.000），聯(lián)合組TGIR 高于SBRT 組和貝伐珠單抗組（P<0.05），SFBR組與貝伐珠單抗組間無差異（P>0.05）。各組SUVmax陽性表達率比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=46.586，P=0.000），聯(lián)合組SUVmax低于SFBR 組和貝伐珠單抗組（P<0.05），SFBR 組與貝伐珠單抗組之間無差異（P>0.05）。見表2和圖2。

表2 各組移植瘤終體積、TGIR及SUVmax比較（n=8，±s）

表2 各組移植瘤終體積、TGIR及SUVmax比較（n=8，±s）

注：①與空白對照組比較，P<0.05；②與SFBR組比較P<0.05；③與貝伐珠單抗組比較，P<0.05。

終體積/mm3 2 247.75±36.13 1 734.88±74.14①1 705.63±65.86①1 192.13±52.20①②③428.948 0.000 SUVmax 3.87±0.34 3.46±0.36①3.62±0.32 2.11±0.27①②③46.586 0.000組別空白對照組SFBR組貝伐珠單抗組聯(lián)合組F 值P 值TGIR/%-22.82±3.30 24.12±2.93 46.96±2.32②③180.086 0.000

圖2 各組18F-FDG micro PET/CT掃描圖

2.3 各組移植瘤組織MVD、LVD及VMD比較

各組移植瘤組織MVD 比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=39.269，P=0.000），聯(lián)合組MVD 低于SFBR 組和貝伐珠單抗組（P<0.05），貝伐珠單抗組MVD 低于SFBR 組（P<0.05）。各組移植瘤組織LVD 比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=39.587，P=0.000），聯(lián)合組LVD 低于SFBR 組和貝伐珠單抗組（P<0.05），SFBR 組LVD 低于貝伐珠單抗組（P<0.05）。各組移植瘤組織VMD比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=23.789，P=0.000）。聯(lián)合組VMD 低于SFBR 組和貝伐珠單抗組（P<0.05），SFBR 組VMD 低于貝伐珠單抗組（P<0.05）。見表3和圖3、4。

表3 各組移植瘤組織MVD、LVD及VMD比較（n=8，個/視野，±s）

表3 各組移植瘤組織MVD、LVD及VMD比較（n=8，個/視野，±s）

注：①與空白對照組比較，P<0.05；②與SFBR組比較P<0.05；③與貝伐珠單抗組比較P<0.05。

VMD 6.38±1.41 3.50±1.19①5.75±1.04②2.38±0.52①②③23.789 0.000組別空白對照組SFBR組貝伐珠單抗組聯(lián)合組F 值P 值MVD 12.63±1.69 10.38±1.51①8.63±1.41①②4.75±1.39①②③39.269 0.000 LVD 10.13±1.25 7.25±1.28①9.00±1.07②3.75±1.38①②③39.587 0.000

圖3 各組移植瘤組織脈管系統(tǒng)比較

圖4 各組脈管系統(tǒng)表達情況

2.4 各組移植瘤細胞Ki-67陽性表達率比較

各組移植瘤細胞Ki-67 陽性表達率比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），聯(lián)合組Ki-67 表達率低于SFBR 組和貝伐珠單抗組（P<0.05），SFBR 組低于貝伐珠單抗組（P<0.05）（見表4和圖5）。各組細胞凋亡率比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。聯(lián)合組腫瘤細胞凋亡率高于SFBR 組和貝伐珠單抗組（P<0.05），SFBR 組高于貝伐珠單抗組（P<0.05）（見表4和圖6）。

圖6 各組細胞凋亡率比較

表4 各組移植瘤細胞Ki-67陽性表達率及凋亡率比較(n=8，%，±s）

表4 各組移植瘤細胞Ki-67陽性表達率及凋亡率比較(n=8，%，±s）

注：①與空白對照組比較，P<0.05；②與SFBR組比較P<0.05；③與貝伐珠單抗組比較P<0.05。

組別空白對照組SFBR組貝伐珠單抗組聯(lián)合組F 值P 值Ki-67陽性表達率83.13±6.81 46.25±7.06①73.00±6.82①②26.13±8.89①②③96.493 0.000凋亡率2.11±0.18 4.22±0.24①3.53±0.30①②6.68±0.28①②③455.767 0.000

3 討論

結(jié)腸癌的治療是以手術(shù)治療為主，輔以化療、放療及靶向治療的綜合治療。結(jié)腸癌易發(fā)生脈管轉(zhuǎn)移，術(shù)后5年生存率僅為50%左右。傳統(tǒng)的外照射治療結(jié)腸癌，由于放療時間長，腫瘤周圍正常器官受到的照射劑量高，放療后不良反應(yīng)重[4]。近距離放療是近年來受到廣泛關(guān)注的新型放療技術(shù)。它將放射源直接放置到腫瘤組織內(nèi)部，在提高腫瘤放射劑量的同時，周圍的正常組織接受的放射劑量卻大大降低，有效地保護了周圍正常器官[5]，放療相關(guān)不良反應(yīng)明顯減少[6-7]。目前近距離放療已廣泛應(yīng)用于前列腺癌、乳腺癌、婦科腫瘤的治療[8]。

腫瘤MV 不僅向腫瘤供應(yīng)營養(yǎng)物質(zhì)，其內(nèi)皮細胞分泌的降解酶還可誘導(dǎo)腫瘤細胞進入MV 向遠處轉(zhuǎn)移。腫瘤組織中LV 與MV 呈交聯(lián)短路式生長，這種結(jié)構(gòu)有利于腫瘤發(fā)生LV 和MV 轉(zhuǎn)移，腫瘤的進展與腫瘤組織中MVD 和LVD 密切相關(guān)[9-10]。JANI 等[11]發(fā)現(xiàn)單次高劑量的射線可直接殺傷MV 的內(nèi)皮細胞，同時使MV 滲漏，管腔塌陷，抑制腫瘤MV 的生成。本實驗以單次10 Gy 的高劑量照射腫瘤后，MVD 明顯減少，符合相關(guān)研究[12]。貝伐珠單抗是一種重組人源化免疫球蛋白G1（IGG1）單克隆抗體，通過與MV 內(nèi)皮細胞表面的生長因子A（VEGF-A）結(jié)合，抑制其與VEGF 受體-2（VEGFR-2）結(jié)合，從而抑制MV 生成[13]。結(jié)合本研究表明，單次10 Gy 的近距離照射對MV 內(nèi)皮細胞的直接損傷作用尚不如貝伐珠單抗對MV 內(nèi)皮細胞的抑制作用。同時本實驗結(jié)果表明貝伐珠單抗能抑制MV 的生成，但對LVD 的生成無明顯抑制作用，單次10 Gy 的近距離照射卻能抑制LV 的生成。聯(lián)合治療相對于單獨使用SFBR和貝伐珠單抗能有效地抑制腫瘤LV 的生成。其機制除了射線直接導(dǎo)致LV 內(nèi)皮細胞壞死、凋亡外，射線和貝伐珠單抗同時作用于腫瘤MV，在抑制腫瘤MV 生成的同時，高劑量的射線使殘存的腫瘤MV 發(fā)生塌陷閉塞，阻斷了血管內(nèi)皮生長因子D（VEGF-D）等促LV 生成的細胞因子進入腫瘤組織內(nèi)誘導(dǎo)LV生成[14]。

腫瘤VM 是近年來發(fā)現(xiàn)的腫瘤組織中特殊的管道，是由腫瘤干細胞圍成的類似于血管的管腔結(jié)構(gòu)，為腫瘤提供血液供應(yīng)[15]。目前的抗血管生成藥物對VM 無效。當(dāng)MV 的生成受到抑制時，腫瘤組織內(nèi)部呈乏氧環(huán)境，可促進VM 的形成，腫瘤細胞通過VM 繼續(xù)獲得營養(yǎng)并通過其向遠處轉(zhuǎn)移[16-17]。腫瘤組織中VMD 與腫瘤的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[18-19]。TURESSON 等[20]發(fā)現(xiàn)射線可直接破壞腫瘤干細胞DNA 雙鏈，導(dǎo)致細胞死亡。同時殘存的細胞內(nèi)線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等亞單位腫脹壞死，失去增殖能力，呈亞致死狀態(tài)，若細胞亞致死狀態(tài)不能逆轉(zhuǎn)，將發(fā)生程序性死亡即細胞凋亡。本研究表明，單次10 Gy 近距離照射可抑制LV 的生成，而當(dāng)近距離照射與貝伐珠單抗聯(lián)合時效果更明顯。其機制可能是高劑量的射線使VM 的干細胞發(fā)生壞死，同時聯(lián)合治療有效地抑制了腫瘤MV 與LV 的生成，使亞致死損傷的干細胞因缺乏相應(yīng)原料不能自我修復(fù)進而發(fā)生凋亡。

SUVmax是評價腫瘤代謝活性的重要指標(biāo)。常用來評估腫瘤治療效果和預(yù)測腫瘤的預(yù)后，其數(shù)值的大小與腫瘤代謝活性成正比，SUVmax升高常提示預(yù)后不良[21-22]。Ki-67 是一種增殖的細胞標(biāo)志物，只表達于細胞周期的活躍階段。Ki-67 的表達反映了腫瘤的增殖率。Ki-67 高表達提示預(yù)后不良[23-24]。本研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合治療除直接損傷腫瘤細胞外，可同時抑制腫瘤MV、LV 和VM 的生成，使腫瘤細胞能量供應(yīng)不足，抑制腫瘤的代謝活性，促進腫瘤細胞的凋亡，達到控制腫瘤生長的能力。

綜上所述，SFBR 聯(lián)合貝伐珠單抗可有效抑制結(jié)腸癌脈管系統(tǒng)的生成，降低腫瘤細胞的代謝活性，促進腫瘤細胞凋亡，從而達到抑制結(jié)腸癌生長的作用，具有較高的臨床應(yīng)用價值。但其抑制脈管系統(tǒng)生成的具體機制以及SFBR 與貝伐珠單抗最佳的結(jié)合方式和時機還有待于進一步的研究。