程顥，阮驪韜，楊艷秋

（1.西安交通大學(xué)附屬陜西省腫瘤醫(yī)院，陜西西安 710061；2.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院，陜西西安 710061；3.青海省第五人民醫(yī)院，青海西寧 810001）

腫瘤新生血管在腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后過程中具有關(guān)鍵作用[1]。腫瘤新生血管的生成與血管內(nèi)皮生成因子的釋放密切相關(guān)，如CD34、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等的表達(dá)促進(jìn)新生血管形成，加快腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移[2]。在腫瘤患者的長(zhǎng)期隨訪與遠(yuǎn)期療效評(píng)估過程中，組織學(xué)方法觀察腫瘤新生血管是有創(chuàng)性的，多次重復(fù)測(cè)定不切實(shí)際。近年來影像學(xué)技術(shù)對(duì)腫瘤血管形態(tài)和功能的評(píng)估進(jìn)展顯著，通過影像手段反映腫瘤新生血管及瘤內(nèi)微血管灌注情況已成為腫瘤診斷治療的研究熱點(diǎn)。其中超聲造影（contrast-enhanced ultrasound,CEUS）技術(shù)發(fā)展迅速。研究表明CEUS 能夠顯示腫瘤血管灌注變化情況，是一種敏感且可靠的影像學(xué)手段[3]。本實(shí)驗(yàn)通過觀察兔肝VX2 腫瘤的進(jìn)展過程，分析CEUS 定量參數(shù)與CD34 和VEGF 的相關(guān)性，進(jìn)一步深入探討腫瘤血管生成基礎(chǔ)與CEUS 定量參數(shù)的關(guān)系，為影像學(xué)準(zhǔn)確地評(píng)估肝腫瘤血管生成、預(yù)后及復(fù)發(fā)的相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

LOGIQ E9 超聲診斷儀和ML6-15 高頻探頭購(gòu)自美國(guó)GE 公司，儀器配置低機(jī)械指數(shù)反向編碼造影成像技術(shù)（coded phased inversion, CPI）。兔抗兔CD34 多克隆抗體（一抗稀釋濃度為1∶100）、兔抗兔VEGF 多克隆抗體（一抗稀釋濃度為1∶100）、即用型鏈霉親和素-生物素復(fù)合物（strept avidin-biotin complex, SABC）免疫組織化學(xué)試劑盒均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 動(dòng)物模型復(fù)制

選擇健康新西蘭白兔24 只，體重（2.5±0.5）kg，雌雄不限。手術(shù)剝離出荷瘤兔肝VX2 腫瘤，選取腫瘤邊緣生長(zhǎng)旺盛的魚肉樣組織，制備成大小約1 mm×1 mm 的腫瘤塊。用3%戊巴比妥鈉（劑量30 mg/kg）經(jīng)耳緣靜脈麻醉接種兔后，在超聲引導(dǎo)下，用穿刺針經(jīng)皮經(jīng)肝將腫瘤塊接種于兔肝左葉深部位置，完成兔肝VX2 腫瘤模型復(fù)制。術(shù)后正常飼養(yǎng)，預(yù)防感染。共復(fù)制24 只兔肝VX2 腫瘤模型，腫瘤種植成功后正常飼養(yǎng)14 d，選取24 個(gè)腫瘤灶進(jìn)行觀察。

1.3 CEUS與定量分析

VX2 腫瘤植入14 d 后1 進(jìn)行CEUS 檢查。啟用CPI 技術(shù)，Small Parts 造影模式。常規(guī)掃查選定兔肝腫瘤的最大中心切面行CEUS 檢查，將觀察目標(biāo)放置于屏幕中央，局部放大圖像。使用5 號(hào)頭皮針建立耳緣靜脈通道，制備SonoVue 微泡混懸液，經(jīng)耳緣靜脈團(tuán)注射1 mL 混懸液后，隨即快速注射2 mL 生理鹽水沖洗靜脈通路。團(tuán)注對(duì)比劑同時(shí)啟動(dòng)系統(tǒng)內(nèi)存儲(chǔ)計(jì)時(shí)器，實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)觀察選定的肝腫瘤顯影情況2 min，所有影像資料存盤。對(duì)存盤圖像進(jìn)行CEUS 定量參數(shù)分析。

利用CEUS 定量分析軟件，選取感興趣區(qū)域（ROI）進(jìn)行動(dòng)態(tài)量化分析，選取腫瘤實(shí)質(zhì)內(nèi)或壞死周邊顯著增強(qiáng)的病灶區(qū)域，避開腫瘤內(nèi)壞死液化的無(wú)增強(qiáng)區(qū)。選取周圍肝組織時(shí)避開肝內(nèi)大血管走行。儀器自動(dòng)擬合出時(shí)間-強(qiáng)度曲線，軟件自動(dòng)計(jì)算并顯示腫瘤組織與周圍正常肝組織曲線增強(qiáng)上升斜率（AS）、對(duì)比劑強(qiáng)度、達(dá)峰時(shí)間（TTP）及曲線下面積（AUC）等CEUS 定量參數(shù)。同一腫瘤及周圍組織選擇不同感興趣區(qū)域重復(fù)測(cè)取3 次，取其平均值。

1.4 免疫組織化學(xué)染色

24 只兔肝VX2 腫瘤模型進(jìn)行CEUS 檢查后立即處死荷瘤兔，制作腫瘤標(biāo)本并進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。所有標(biāo)本用10 %甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋、切片、染色，并采用SABC 法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，判定CD34 和VEGF 的表達(dá)水平。

1.4.1 CD34 的檢測(cè)腫瘤細(xì)胞染色呈棕黃色為CD34 陽(yáng)性細(xì)胞,在低倍光鏡下隨機(jī)選取熱點(diǎn)，然后轉(zhuǎn)換到400 倍鏡下隨機(jī)選取5 個(gè)熱點(diǎn)視野計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞，計(jì)算每個(gè)視野中陽(yáng)性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分率，將其平均值作為CD34 陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)率。CD34 陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)分為：0%～30%為弱陽(yáng)性，>30%～70%為陽(yáng)性，>70%～100%為強(qiáng)陽(yáng)性。

1.4.2 VEGF 的檢測(cè)腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)中出現(xiàn)黃色、棕黃色、棕褐色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。隨機(jī)選取5 個(gè)熱點(diǎn)視野，高倍鏡下計(jì)算每個(gè)視野中陽(yáng)性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分率，將其平均值作為VEGF 陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)率。VEGF 陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率分級(jí)：0%～25%為Ⅰ級(jí)，> 25%～50%為Ⅱ級(jí)，> 50%～75%為Ⅲ級(jí)，>75%～100%為Ⅳ級(jí)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson 法。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝腫瘤與周圍正常肝組織CEUS參數(shù)比較

兔肝VX2 腫瘤的對(duì)比劑強(qiáng)度、AS、TTP、AUC與周圍正常肝組織比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），對(duì)比劑強(qiáng)度、AS 及AUC 均明顯大于周圍正常肝組織，TTP 明顯短于周圍正常肝組織。本實(shí)驗(yàn)兔肝VX2 腫瘤CEUS 直觀表現(xiàn)均呈“速升速降”特點(diǎn)，腫瘤在動(dòng)脈相呈整體顯著增強(qiáng)，瘤內(nèi)出現(xiàn)液化壞死者表現(xiàn)為不均勻增強(qiáng)或環(huán)狀增強(qiáng)，壞死灶無(wú)增強(qiáng)。造影時(shí)間-強(qiáng)度曲線表現(xiàn)為動(dòng)脈相上升支陡直，快速達(dá)峰，靜脈相迅速下降。見表1和圖1。

表1 兔肝VX2腫瘤與周圍正常肝組織CEUS參數(shù)的比較 （n=24，±s）

表1 兔肝VX2腫瘤與周圍正常肝組織CEUS參數(shù)的比較 （n=24，±s）

組別兔肝VX2腫瘤周圍正常肝組織t 值P 值對(duì)比劑強(qiáng)度15.30±4.36 10.28±5.12-5.912 0.000 AS 0.68±0.43 0.36±0.21-2.321 0.000 TTP 12.86±4.93 19.82±4.42 6.285 0.000 AUC 757.70±242.73 953±265.16 7.441 0.000

圖1 兔肝VX2腫瘤與正常肝組織CEUS時(shí)間-強(qiáng)度曲線

2.2 免疫組織化學(xué)檢查結(jié)果

兔VX2 腫瘤CD34 與VEGF 表達(dá)均為陽(yáng)性（見圖2A、B），其中弱陽(yáng)性5 個(gè)，陽(yáng)性16 個(gè)，強(qiáng)陽(yáng)性3 個(gè)。CD34 陽(yáng)性表達(dá)的平均值為（56.12±6.72），VEGF 陽(yáng)性表達(dá)率的平均值為（61±24）%。VEGF 陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率Ⅰ級(jí)：0%～25%陽(yáng)性細(xì)胞的腫瘤5個(gè)；Ⅱ級(jí)：>25%～50%陽(yáng)性細(xì)胞的腫瘤6 個(gè)；Ⅲ級(jí)：> 50%～75%陽(yáng)性細(xì)胞的腫瘤10 個(gè)；Ⅳ級(jí)：> 75%～100%陽(yáng)性細(xì)胞的腫瘤3 個(gè)。見表2。

圖2 兔肝VX2腫瘤CD34和VEGF的表達(dá)（SABC染色×400）

表2 兔VX2腫瘤CD34與VEGF陽(yáng)性表達(dá)結(jié)果

2.3 CEUS定量指標(biāo)與CD34、VEGF的相關(guān)性

CEUS 各定量指標(biāo)中，TTP 與CD34、VEGF 呈負(fù)相關(guān)（r=-0.843 和-0.692，均P=0.000）；對(duì)比劑強(qiáng)度與CD34、VEGF 呈正相關(guān)（r=0.386 和0.365，均P=0.042）；AS 與CD34、VEGF 呈正相關(guān)（r=0.497 和0.631，均P=0.005）；AUC 與CD34、VEGF 呈正相關(guān)（r=0.425 和0.485，均P=0.016）。

3 討論

兔肝VX2 腫瘤的生長(zhǎng)特性類似于人類肝細(xì)胞癌，其生長(zhǎng)演變過程迅速，腫瘤血供豐富，被廣泛用于肝腫瘤影像診斷、介入治療等基礎(chǔ)研究[4-6]。近年來，腫瘤精準(zhǔn)治療技術(shù)不斷發(fā)展，對(duì)腫瘤療效和預(yù)后的判斷需要更加準(zhǔn)確的評(píng)估方法。

腫瘤的生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移依賴于新生血管生成[7]，因此對(duì)腫瘤新生血管的評(píng)估成為腫瘤研究的熱點(diǎn)。腫瘤血管具有特殊的形態(tài)，血管走形扭曲，粗細(xì)不均并會(huì)生成較多異常分支，結(jié)構(gòu)特點(diǎn)也不同于正常組織血管，其內(nèi)皮細(xì)胞基底膜不完整，沒有平滑肌成分，僅由有孔的內(nèi)皮細(xì)胞和片狀基膜結(jié)構(gòu)組成，導(dǎo)致腫瘤血管滲透性增加等，這種異常的形態(tài)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)更加促進(jìn)惡性腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移。因此有研究認(rèn)為，腫瘤新生血管的定量是一個(gè)重要的獨(dú)立預(yù)后因素[8]。

惡性腫瘤細(xì)胞還會(huì)分泌多種血管內(nèi)皮生成因子，如CD34、VEGF、vWF、CD105 等，血管內(nèi)皮生成因子的釋放促進(jìn)了腫瘤血管的生成。腫瘤新生血管旺盛形成與多種血管內(nèi)皮生成因子的高表達(dá)密切相關(guān)。因此在進(jìn)行腫瘤新生血管計(jì)數(shù)時(shí)，可采用CD34、VEGF 等內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物定量法，但此法具有損傷性且易受取材范圍的影響。一直以來，各種臨床和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)都致力于找到一種安全有效、操作簡(jiǎn)便的技術(shù)用來精確評(píng)估腫瘤的生長(zhǎng)和新生血管的生成。目前應(yīng)用于臨床和研究的主要有CT 灌注[9]、CEUS[10]等影像學(xué)技術(shù)手段。

由于腫瘤血管特殊的形態(tài)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，造成腫瘤的血流灌注量和血容量明顯高于正常組織，超聲對(duì)比劑是一種血池顯影劑，CEUS 過程中對(duì)比劑能快速進(jìn)入腫瘤，并且快速廓清[11]。CEUS 通過測(cè)定對(duì)比劑強(qiáng)度、AS、TTP、AUC 等參數(shù)，反映腫瘤內(nèi)對(duì)比劑灌注隨時(shí)間變化的特點(diǎn)，能夠比較客觀地評(píng)價(jià)腫瘤新生血管的生成和功能情況[12]。

本實(shí)驗(yàn)兔肝腫瘤CEUS 時(shí)間-強(qiáng)度曲線參數(shù)中，TTP 與CD34 和VEGF 表達(dá)具有較好的負(fù)相關(guān)性，AS 與CD34 和VEGF 呈正相關(guān)，腫瘤血供越豐富，對(duì)比劑的灌注速度越快，對(duì)比劑所表示的腫瘤血流信號(hào)也更豐富[13]。腫瘤動(dòng)脈血液供應(yīng)的多寡與新生腫瘤血管形成關(guān)系密切，腫瘤新生血管是以血管生成因子為中介誘導(dǎo)產(chǎn)生，CD34 和VEGF 等血管內(nèi)皮生成因子的高表達(dá)與新生血管的旺盛程度密切相關(guān)，因此CEUS 參數(shù)在一定程度上能夠客觀地反映腫瘤血管內(nèi)皮生成因子的表達(dá)水平。同時(shí)AUC 與CD34 和VEGF 呈正相關(guān)，AUC 是流速、流量及時(shí)間三者的全面評(píng)估,可較好地反映一定時(shí)間內(nèi)局部組織造影增強(qiáng)的累積效應(yīng)，同時(shí)受血流速度的影響，與局部血流量呈線性正相關(guān)[14]，因此AUC 能夠綜合反映腫瘤血管床的血流動(dòng)力學(xué)情況[15]，也表明AUC 與腫瘤血管內(nèi)皮生成因子的表達(dá)密切相關(guān)。

綜上所述，腫瘤的CEUS 表現(xiàn)與腫瘤新生血管及血管內(nèi)皮生成因子密切相關(guān)，CEUS 時(shí)間-強(qiáng)度曲線能夠量化腫瘤血管內(nèi)對(duì)比劑流速和流量的變化情況[16]，從而更加客觀地反映出腫瘤新生血管的生成情況及瘤內(nèi)灌注特點(diǎn)，CEUS 定量參數(shù)也能夠客觀反映出腫瘤血管內(nèi)皮生成因子CD34 和VEGF 表達(dá)水平。因此，CEUS 定量分析技術(shù)的應(yīng)用實(shí)現(xiàn)了由主觀判斷腫瘤強(qiáng)化程度到客觀定量評(píng)價(jià)腫瘤血流灌注情況的轉(zhuǎn)變。這種無(wú)創(chuàng)而實(shí)用的影像學(xué)技術(shù)在評(píng)價(jià)腫瘤微血管密度及抗腫瘤血管治療療效等方面具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。