孫愛猛 ,周信云 ,羅瀅娟 ,朱端昊 ,熊長輝

鉤端螺旋體病(簡稱鉤體病)是由致病性鉤端螺旋體引起的一種急性全身感染性疾病,屬于自然疫源性疾病[1]。鉤端螺旋體病在發(fā)病早期有高熱、全身酸痛、軟弱無力等癥狀,隨著病程延長,會引起肺彌漫性出血、心肌炎、呼吸功能衰竭等嚴(yán)重并發(fā)癥,甚至威脅患者生命[2]。由于鉤端螺旋體病臨床表現(xiàn)多樣性和鉤端螺旋體實驗室檢測的特殊性,很多病例被漏診,現(xiàn)就對一不明原因發(fā)熱伴呼吸困難患者實驗室診斷為鉤端螺旋體感染病例進(jìn)行闡述。

1 資料與方法

1.1 病例資料 2021年7月一患者,男,58歲,因乏力、咳嗽伴發(fā)熱自行口服感冒類藥物,癥狀無緩解,2 d后癥狀加重并出現(xiàn)呼吸困難住進(jìn)ICU。胸部X 線片示:雙肺紋理增多,呈毛玻璃樣改變,可見分布均勻、大小一致的斑片狀陰影,密度低,邊界模糊。采集呼吸道標(biāo)本做新型冠狀病毒特異性核酸片段,結(jié)果為陰性。采集呼吸道標(biāo)本和血液標(biāo)本做常規(guī)實驗室病原分離培養(yǎng),未培養(yǎng)出可疑致病菌。根據(jù)?中國宏基因組學(xué)第二代測序技術(shù)檢測感染病原體的臨床應(yīng)用專家共識?[3]和?宏基因組高通量測序技術(shù)應(yīng)用于感染性疾病病原檢測中國專家共識?[4],采集患者肺泡灌洗液進(jìn)行m NGS檢測提示有鉤端螺旋體感染的可能,繼而采集患者血液和尿液做病原分離培養(yǎng)和特異性核酸片段檢測,結(jié)果均為陰性,但患者血清抗體檢測(MAT 法)出致病性鉤端螺旋體澳洲型滴度為1∶800,患者被確診為致病性鉤端螺旋體澳洲型感染。臨床及時采用抗鉤端螺旋體藥物(用藥包括青霉素、氫化可的松等)治療后患者病情好轉(zhuǎn)。經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查,該患者于7月初在自家附近的小河捕過魚,并且該地區(qū)往年鉤端螺旋體監(jiān)測中在老鼠體內(nèi)分離到過陽性菌株,該患者這次發(fā)病可能是接觸疫水感染所致。

1.2 方 法

1.2.1 肺泡灌洗液m NGS檢測 分析采集患者肺泡灌洗液送予果生物科技(北京)有限公司做m NGS檢測,采用QIAseq Ultralow Input Library Kit構(gòu)建文庫,采用Illumina Nextseq550Dx測序平臺對構(gòu)建好的文庫測序,使用SNAP軟件篩除測序數(shù)據(jù)中的人源序列;最終獲得的數(shù)據(jù)使用Burrow-Wheeler Aligner軟件進(jìn)行分析,評估樣本中微生物的種類和是否有致病性病原微生物存在的可能。

1.2.2 Real-time PCR檢測根據(jù)肺泡灌洗液m NGS檢測分析結(jié)果的提示,用Real-time PCR 檢測方法對患者肺泡灌洗液、血液和尿液進(jìn)行鉤端螺旋體特異性基因檢測。核酸提取采用天根生化科技(北京)有限公司的核酸提取試劑盒進(jìn)行提取,提取方法參考試劑盒說明書。鉤端螺旋體特異性基因Real-time PCR 擴(kuò)增采用深圳市生科源技術(shù)有限公司試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增,反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參考檢測試劑盒說明書。

1.2.3 病原體分離培養(yǎng) 按照WS290-2008?端螺旋體病診斷標(biāo)準(zhǔn)?[5]采集患者血液和尿液培養(yǎng)分離鉤端螺旋體的病原:通過無菌操作采集患者血液接種3管EMJH 培養(yǎng)基中,每管接種1～3滴,通過無菌操作采集患者中段尿50 m L于4 000 r/min離心1 h后取沉渣接種4 管EMJH 培養(yǎng)基中,每管0.3 m L,血培養(yǎng)管和尿培養(yǎng)管均于28 ℃培養(yǎng),每隔5～7 d取培養(yǎng)物于暗視野顯微鏡下觀察有無鉤端螺旋體生長。

1.2.4 顯微鏡凝集實驗(MAT) 按照WS290-2008?端螺旋體病診斷標(biāo)準(zhǔn)?[5]采集患者血清進(jìn)行鉤端螺旋體MAT 檢測,以檢測患者血清抗體滴度和鉤端螺旋體感染型別:患者血清于56℃水浴箱中滅活30 min后作定性試驗,即以生理鹽水做1∶50稀釋,分別取稀釋好的血清50μL與50μL 15個代表株的培養(yǎng)液混勻后于37 ℃孵育1.5～2 h,用生理鹽水做對照。取孵育后的反應(yīng)液于暗視野顯微鏡下觀察凝集情況。若患者稀釋血清與某一群鉤端螺旋體抗原發(fā)生凝集則說明血清中該群鉤端螺旋體抗體滴度是1∶100,則需要進(jìn)一步稀釋患者血清檢測該群鉤端螺旋體抗體的滴度。

2 結(jié)果

2.1 肺泡灌洗液m NGS 檢測結(jié)果 肺泡灌洗液m NGS檢測結(jié)果提示有鉤端螺旋體感染的可能。m NGS結(jié)果顯示鉤端螺旋體屬序列數(shù)51,問號鉤端螺旋體特異系列數(shù)51,置信度高,相對豐度1.43%,覆蓋度0.08%。

2.2 Real-time PCR 檢測結(jié)果 用Real-time PCR檢測方法對患者肺泡灌洗液、血液和尿液進(jìn)行鉤端螺旋體特異性基因檢測,檢測結(jié)果均為陰性。

2.3 病原體分離培養(yǎng)結(jié)果 實驗室對患者血液、尿液進(jìn)行鉤端螺旋體的分離培養(yǎng)結(jié)果均為陰性。

2.4 顯微鏡凝集實驗(MAT)結(jié)果 血清抗體檢測(MAT)致病性鉤端螺旋體澳洲型滴度為1∶800(見圖1)。

圖1 致病性鉤端螺旋體澳洲型MAT結(jié)果(200×)Fig.1 Results of the MAT of pathogenic Leptospira australis type(200×)

3 討論

鉤端螺旋體病是熱帶亞熱帶地區(qū)常見的傳染病,尤其是以農(nóng)業(yè)為主以及洪澇災(zāi)害多發(fā)的地區(qū),對老百姓的身體健康危害非常大,是我國南方省份需要重點防治的傳染病之一[6]。鉤端螺旋體病臨床表現(xiàn)復(fù)雜,臨床型別多,從輕微的感冒癥狀到嚴(yán)重的多器官衰竭并無典型的特異性,這給臨床診斷帶來極大困難,很多病例被漏診,所以鉤端螺旋體病的診斷在一定程度上需要依靠實驗室的輔助檢測。目前實驗室的病原分離培養(yǎng)和MAT 仍是診斷和監(jiān)測鉤體的金標(biāo)準(zhǔn)[7-8]。但是病原體培養(yǎng)法培養(yǎng)時間較長,對鉤端螺旋體活菌培養(yǎng)一般需要2周以上;MAT 則需要將鉤端螺旋體標(biāo)準(zhǔn)菌株培養(yǎng)至一定濃度,再將活的標(biāo)準(zhǔn)菌株與待檢血清一起孵育培養(yǎng),且需要人工借助暗視野顯微鏡觀察[9]。因此,培養(yǎng)法和MAT 都不能對人群行大規(guī)模的快速篩查,也不能對鉤端螺旋體病進(jìn)行早期診斷。

隨著分子檢測技術(shù)的快速發(fā)展,采用普通PCR[10]和Taq Man Real-time PCR[11-12]技術(shù)檢測鉤端螺旋體特異性核酸在一定程度提高了鉤端螺旋體病的診斷水平。PCR 檢測對樣本采集、實驗環(huán)境和條件要求較高,并且一對PCR 擴(kuò)增引物只能獲取某一特定目的DNA 片段,如果病例懷疑有哪些病原感染的可能,PCR 檢測就要選擇相對應(yīng)病原的引物進(jìn)行擴(kuò)增,這在不明原因引起的病例檢測中對某種病原某種引物的選擇較難。特別是像鉤端螺旋體病臨床表現(xiàn)復(fù)雜,侵犯的人體臟器多、臨床型別多、病原種群多的這種病原感染無論是臨床醫(yī)師的初診還是實驗室的檢測都帶來了很大的挑戰(zhàn)。Wilson等[13]在2014 年對一例患者的腦脊液進(jìn)行高通量測序提示該患者可能為鉤端螺旋體感染,實驗室通過PCR 和血清抗體檢測也證實了該患者為鉤端螺旋體感染,這是較早將高通量測序應(yīng)用病原感染的檢測。2019 年Xie等[14]應(yīng)用m NGS 診斷管圓線蟲嬰兒嗜酸性腦膜炎的病例顯示m NGS 是一種新的精確度較高的診斷技術(shù),能幫助實驗室檢測出更多的病原體。Zhang等[15]2019 年也將m NGS 技術(shù)應(yīng)用于腦膜炎的診斷中,檢測出了人皰疹病毒。此外,還有學(xué)者探討了病原微生物m NGS 在局灶性感染中的應(yīng)用價值,發(fā)現(xiàn)其檢測的陽性臨床符合率明顯高于常規(guī)檢測法及培養(yǎng)法,且可能不受標(biāo)本采集前抗菌藥物使用的影響[16]。

在本文病例的實驗室檢測中,常規(guī)的實驗室檢測指標(biāo)均不能提示是何種病原感染,經(jīng)對患者肺泡灌洗液進(jìn)行m NGS檢測提示有鉤端螺旋體感染的可能,繼而采集患者血液和尿液做病原分離培養(yǎng)和特異性核酸片段檢測,但結(jié)果均為陰性,后經(jīng)患者血清抗體檢測(MAT)確診為致病性鉤端螺旋體澳洲型感染。這提示我們在對鉤端螺旋體的實驗室診斷中新型的檢測技術(shù)和傳統(tǒng)的檢測技術(shù)有機(jī)結(jié)合,互相驗證,才能提高鉤端螺旋體病的診斷。

利益沖突:無

引用本文格式:孫愛猛,周信云,羅瀅娟,等.1例宏基因二代測序提示鉤端螺旋體感染患者的實驗室診斷[J].中國人獸共患病學(xué)報,2022,38(6):478-480,485.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.092