李成亮 王 同

2020年全球最新癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示肺癌是目前世界上發(fā)病率排行第二的惡性腫瘤，且是導(dǎo)致癌癥死亡的主要原因(占癌癥死亡總數(shù)的18%)[1]。肺癌病理分型包括非小細(xì)胞肺癌和小細(xì)胞肺癌。非小細(xì)胞肺癌在臨床上最為多見。鑒于目前臨床上肺癌放化療治療的耐藥性增加，以及這些傳統(tǒng)療法的毒性，需要一種新的、無毒的抗癌治療方法。最佳的治療方法是能夠區(qū)分不同類型的細(xì)胞，以減少副作用，而植物是一個有希望的來源。植物性或衍生性化合物通常對正常細(xì)胞無毒。所有現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的四分之一直接或間接來源于植物[2]。黃芪是一種在臨床治療中常用的中藥，現(xiàn)代藥理學(xué)表明具有提高免疫、臟器保護(hù)、抗腫瘤等療效。既往研究表明黃芪能有效抑制肝癌[3]、胰腺癌[4]、胃癌[5]腫瘤細(xì)胞的生長，但少有文獻(xiàn)報道黃芪對人肺癌A549細(xì)胞體外增殖和凋亡的影響。本文通過研究黃芪在體外對人A549細(xì)胞增殖和凋亡的作用，初步探討其促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞株由安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院科研實驗中心饋贈

1.2 藥物

黃芪注射液，規(guī)格10 ml/支(每1 ml相當(dāng)于黃芪生藥2 g)，購于神威藥業(yè)集團(tuán)。臨用前原液使用培養(yǎng)基稀釋到所需濃度。

1.3 試劑

RPMI-1640培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素溶液(100X)、胰蛋白酶、CCK-8試劑盒購于武漢普諾賽生命科技公司；胎牛血清購于美國Gbico公司；Annexin-V-FITC/PI試劑盒購于七海復(fù)泰生物科技公司；兔多抗survivin、兔多抗bax、兔多抗bcl-2購于美國Affinity公司；引物委托擎科生物科技公司合成。

1.4 方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 細(xì)胞培養(yǎng)：將配置好的含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基放入37 ℃恒溫水浴鍋中預(yù)熱。凍存的細(xì)胞從液氮中取出后，凍存管迅速置于37 ℃水浴鍋中，完全解凍后，將細(xì)胞懸液吸到15 ml離心管中，離心管加入4 ml完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，1000 rpm離心，吸取上清液，丟棄。加入完全培養(yǎng)基4 ml重懸細(xì)胞，然后將A549細(xì)胞株置于37°、5% CO2，相對濕度為90%的培養(yǎng)箱中無菌培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)基變黃時進(jìn)行換液，棄除舊培養(yǎng)液，3 ml PBS清洗細(xì)胞培養(yǎng)瓶兩遍，然后加入完全培養(yǎng)基4 ml，重新放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

分組：實驗設(shè)空白對照組(不加藥物,濃度為0 g/ml)和4組不同濃度的黃芪藥物干預(yù)組：1組(0.1 g/ml)、2組(0.5 g/ml )、3組(1.0 g/ml)、4組(1.6 g/ml)。各組藥物濃度均使用完全培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋得到。

1.4.2 CCK-8法檢測黃芪注射液對人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞增殖的影響 取對數(shù)生長期的A549細(xì)胞調(diào)成單細(xì)胞懸液5×104個/ml，以每孔100 μl接中到96孔板，加入了細(xì)胞的96孔板放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12 h，待細(xì)胞貼壁。12 h后，實驗組分別加入含有終濃度為0.1 g/ml、0.5 g/ml、1.0 g/ml、1.6 g/ml的藥物100 μl，每孔總體積為200 μl。每種藥物濃度設(shè)4個復(fù)孔，空白對照組只加完全培養(yǎng)基100 μl。以僅含有200 μl的完全培養(yǎng)基，不接種細(xì)胞的空白組作為調(diào)零孔。將空白對照組、實驗組細(xì)胞置于96孔板中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng) 24 h、48 h。然后，每孔加入10 μl CCK-8試劑，培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4 h 。然后在酶標(biāo)儀450 nm 波長處檢測各孔的吸光度值(OD值)，各孔吸光度值調(diào)零后計算抑制率，抑制率(%)=(1-實驗組OD值/空白對照組OD值)×100%。

1.4.3 Annexin-V-FITC/PI雙染法檢測黃芪注射液對人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞凋亡的影響 取生長狀態(tài)良好的A549細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個/ml,以每孔接種2 ml接種于6孔板，然后放入37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)6孔板中細(xì)胞大約鋪滿孔的70%左右時棄去孔內(nèi)舊培養(yǎng)基，然后每孔加入濃度為0.1 g/ml、0.5 g/ml、1.0 g/ml和1.6 g/ml的藥物各 2 ml，并設(shè)置空白對照組,只加 2 ml完全培養(yǎng)基，分別放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h。到時間后收集細(xì)胞，按照凋亡試劑盒操作：加入Annexin V-FITC抗體5 μl，輕輕混勻，室溫避光孵育15 min。加入PI抗體10 μl，輕輕混勻。冰浴避光放置5 min。在30 min內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。

1.4.4 RT-PCR檢測黃芪注射液干預(yù)A549細(xì)胞后Survivin mRNA、Bcl-2 mRNA及Bax mRNA水平的變化 由Genbank獲取凋亡相關(guān)基因(Survivin、Bcl-2、Bax)和內(nèi)參(GAPDH)上下游序列，并委托擎科生物科技公司合成。實驗分為5組，對照組為不加藥組，去除孔內(nèi)舊培養(yǎng)液后加入 2 ml PBS清洗2次，然后加入2 ml 完全培養(yǎng)基。其余4組為實驗組：棄去孔內(nèi)舊培養(yǎng)液后加入2 ml PBS清洗2次，再向每孔中加入2 ml濃度分別為0.1 g/ml、0.5 g/ml、1.0 g/ml、1.6 g/ml的藥物，再放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。TRIzol法提取A549細(xì)胞總RNA并測定RNA濃度，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA后再進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，最后進(jìn)行實時熒光定量PCR檢測。根據(jù)公式△Ct=△Ct目的基因-△Ct內(nèi)參基因，△△Ct=△Ct實驗組-△Ct空白對照組進(jìn)行計算，最終數(shù)據(jù)以2-△△Ct為結(jié)果進(jìn)行分析。

1.4.5 采用Western Blot方法檢測黃芪注射液干預(yù)A549細(xì)胞后凋亡相關(guān)蛋白Survivin、Bcl-2及Bax表達(dá)水平的變化 實驗分組及藥物處理同1.4.4，待培養(yǎng)48 h后加入裂解液冰上裂解30 min，4 ℃下12000 rpm離心5 min，BCA法測定蛋白濃度后取40 μg樣品與上樣緩沖液混合，煮沸10 min，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)PVDF膜。將膜在含5%脫脂奶粉的TBST中室溫下封閉2 h，隨后加入一抗(兔多抗survivin、兔多抗bax、兔多抗bcl-2，1∶1000稀釋)，4 ℃孵育過夜。第二天加入HRP標(biāo)記羊抗兔二抗(1∶50000稀釋)，ECL化學(xué)發(fā)光試劑檢測。以GAPDH為內(nèi)參，以條帶灰度值測定Bcl-2、Bax、Survivin蛋白的相對表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 黃芪注射液對A549細(xì)胞體外增殖的影響

CCK-8法檢測黃芪注射液不同濃度、不同時間段對A549細(xì)胞體外增殖的影響，結(jié)果顯示：黃芪注射液干預(yù)后能明顯抑制A549細(xì)胞的增長，且具有一定的濃度依賴性和時間依賴性。比較4個實驗組和空白對照組的抑制率，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。單因素方差分析顯示：在同一時間段，隨著藥物濃度的增加，藥物對細(xì)胞的增殖抑制率增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。在同一藥物濃度下，黃芪對A549細(xì)胞的增殖抑制率48 h高于24 h,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果見表1、圖1。

表1 不同濃度的黃芪注射液干預(yù)A549細(xì)胞24h、48h后對增殖的影響

圖1 不同濃度的黃芪注射液對A549細(xì)胞的抑制率

2.2 黃芪注射液對人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，不同濃度的黃芪注射液干預(yù)24 h后細(xì)胞凋亡率分別為(8.42±0.32)% 、(13.83±0.42)%、(18.86±0.29)%、(23.12±0.23)%。干預(yù)48 h后凋亡率為(13.02±0.39)%、(18.34±0.68)%、(24.95±0.58)%、(32.88±0.90)%?？瞻讓φ战M24 h凋亡率為(6.17±0.20)%、48 h凋亡率為(5.61±0.10)%。各實驗組凋亡率高于對照組，且相同濃度的黃芪注射液48 h的凋亡率高于24 h。各實驗組與空白對照組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，不同濃度的黃芪干預(yù)組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.01)。

2.3 黃芪注射液對A549細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

與空白對照組相比，經(jīng)藥物干預(yù)48 h后，隨著藥物濃度的增加，A549細(xì)胞Survivin mRNA、Bcl-2 mRNA表達(dá)降低(P<0.05)，Bax mRNA表達(dá)增加(P<0.01)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。以GAPDH為內(nèi)參，2-△△Ct為結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果見表2，圖2。

表2 黃芪注射液對A549細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.4 黃芪注射液對A549細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

黃芪注射液作用A549細(xì)胞48 h后，通過western blot檢測Bcl-2、Bax、Survivin蛋白的表達(dá)情況，以Survivin/GAPDH、Bcl-2/GAPDH 、Bax/GAPDH表示蛋白的相對表達(dá)含量，結(jié)果顯示:隨著藥物濃度的升高，Survivin蛋白、Bcl-2蛋白表達(dá)量逐漸減少(P<0.05)，Bax蛋白表達(dá)量逐漸增加(P<0.01)。結(jié)果見表3，圖3、4。

圖2 RT-PCR檢測Survivin mRNA、Bcl-2 mRNA和Bax mRNA表達(dá)結(jié)果

表3 黃芪注射液對A549細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討論

近年來肺癌的治療出現(xiàn)了許多新策略，如分子靶向治療、免疫治療、中醫(yī)藥治療。通過多種途徑明顯改善了患者的預(yù)后。但盡管如此，全身化療仍是肺癌不可替代的基礎(chǔ)治療手段。長期暴露于特定的化療藥物后，腫瘤細(xì)胞對一系列具有不同結(jié)構(gòu)和功能的藥物產(chǎn)生交叉耐藥性，這種現(xiàn)象被稱為多藥耐藥性(MDR)。MDR由許多不同的機(jī)制共同作用后產(chǎn)生，凋亡逃逸是其中一個重要的機(jī)制。最近的證據(jù)有力地表明，癌細(xì)胞中的幾種因子可以增強(qiáng)抗癌藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的抵抗力。

Survivin包含一個桿狀病毒凋亡抑制重復(fù)序列(BIR)蛋白結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域?qū)⑵錃w類為凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein,IAP)家族成員[6]。目前研究發(fā)現(xiàn)，Survivin對細(xì)胞凋亡的抑制分子機(jī)制如下[7]：Survivin通過直接抑制負(fù)責(zé)誘導(dǎo)和執(zhí)行凋亡的caspase；Smac/DIABLO與細(xì)胞色素C一起從線粒體釋放到胞漿中，Smac/DIABLO可以通過結(jié)合和抑制IAP蛋白的抑制效應(yīng)來促進(jìn)細(xì)胞凋亡；Survivin可能通過結(jié)合和隔離Smac/DIABLO間接抑制caspase活性，從而阻止Smac/DIABLO與其他IAP結(jié)合，從而抑制細(xì)胞死亡，促進(jìn)癌細(xì)胞存活。近年來研究發(fā)現(xiàn)，在大多數(shù)人類腫瘤細(xì)胞中都可以檢測到Survivin，包括結(jié)腸癌[8]、乳腺癌[9]、肺癌[10]等，但在正常成人組織卻罕見其表達(dá)。目前僅在正常成人的結(jié)腸隱窩的底部[11]、胎盤組織[12]中有所發(fā)現(xiàn)。這些特點(diǎn)說明Survivin基因與細(xì)胞增殖之間有著密不可分的聯(lián)系。余江濤等[13]發(fā)現(xiàn)survivin基因在甲狀腺癌組織和細(xì)胞中呈高表達(dá),沉默其表達(dá)可誘導(dǎo)甲狀腺癌細(xì)胞凋亡。賈富鑫等[14]發(fā)現(xiàn)survivin基因在胰頭癌組織的表達(dá)升高，且與胰頭癌的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。

圖3 Survivin蛋白、Bcl-2蛋白和Bax蛋白的相對表達(dá)情況

圖4 不同濃度黃芪注射液作用A549細(xì)胞48 h后Survivin、Bcl-2、Bax蛋白質(zhì)電泳圖

Bcl-2基因發(fā)現(xiàn)于B細(xì)胞濾泡性淋巴瘤的t(14；18)染色體易位斷裂點(diǎn)，Bcl-2家族蛋白也是調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因子。Bcl-2家族包括三類，第一類抑制凋亡(BCL-2,BCL-XL,BCL-W,MCL1,BCL-B)，而第二類促進(jìn)凋亡( BAX,BAK and BOK )，第三類不同的BH3-Only蛋白具有一個保守的BH3結(jié)構(gòu)域，它可以結(jié)合并調(diào)節(jié)抗凋亡的bcl-2蛋白，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[15]。Bcl-2家族主要參與線粒體凋亡途徑，目前認(rèn)為機(jī)制如下：在接收到不同的凋亡刺激后，兩個重要的促凋亡蛋白Bax和Bak通過形成線粒體外膜通透性(MOMP)復(fù)合物來啟動細(xì)胞凋亡[16]。MOMP的形成導(dǎo)致細(xì)胞色素C和其他因子從線粒體膜間間隙釋放出來，進(jìn)而激活關(guān)鍵的caspase級聯(lián)。Bcl-2蛋白家族的抗凋亡和促凋亡蛋白之間的相互作用可以抑制或激活MOMP，并決定細(xì)胞的命運(yùn)[17]。裴巖巖、張璐等[18-19]體外實驗研究發(fā)現(xiàn)Bax mRNA和蛋白表達(dá)水平上調(diào)，Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)水平下調(diào)，能抑制人乳腺癌MCF-7細(xì)胞、腎癌ACHN細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，很多中草藥作用機(jī)制的逐步被闡明。黃芪提取物中抗腫瘤的主要活性成分為黃芪甲苷。安小翠等[20]研究發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷可以通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和NF-κB信號通路實現(xiàn)抑制肝癌細(xì)胞HepG2的增殖并促進(jìn)其凋亡。曹艷等[21]研究發(fā)現(xiàn)在體外黃芪甲苷能夠通過抑制細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)信號通路減少細(xì)胞MMP-2和MMP-9的表達(dá)而發(fā)揮抑制胃癌細(xì)胞侵襲的能力。本實驗通過對細(xì)胞凋亡相關(guān)機(jī)制的研究，發(fā)現(xiàn)：黃芪注射液能有效抑制人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的體外增殖。這可能與藥物下調(diào)Survivin 、Bcl-2基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達(dá)，上調(diào)Bax基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡有關(guān)。希望隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，更多的中藥提取物可以作為臨床治療過程中的輔助抗腫瘤藥物，進(jìn)而提高腫瘤細(xì)胞凋亡率，降低腫瘤細(xì)胞多藥耐藥，進(jìn)一步改善患者預(yù)后。