溫聰聰， 周 姝， 劉 華， 吳德卿， 徐曉蓉,

(1. 南京醫(yī)科大學上海十院臨床醫(yī)學院消化內科，上海 200072； 2. 同濟大學附屬第十人民醫(yī)院消化內科，上海 200072)

早期結直腸癌(early colorectal cancer, ECC)指癌細胞浸潤至黏膜下層，但未累及固有肌層[1]。在腸道上皮腫瘤診治的環(huán)節(jié)中，黏膜下層浸潤深度的識別是關鍵一環(huán)，高級別上皮內瘤變(high-grade neo-plasia, HGN)與淺表黏膜下層結直腸癌為內鏡下治療的良好適應證，而黏膜下層浸潤深度>1 mm是內鏡切除術后殘留癌、ECC患者發(fā)生淋巴結轉移的高危因素[2]。盡管已有不少研究從白光、色素內鏡角度探討相關特征與腫瘤浸潤深度的關系，但術前判斷的準確性、術后是否需追加外科手術等問題尚未完全解決。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年9月—2022年1月于同濟大學附屬第十人民醫(yī)院消化內鏡中心接受結直腸息肉治療的患者且本次切除病變術后病理診斷為高級別瘤變(high-grade neoplasia, HGN)、黏膜內癌(intram-ucosal carcinoma, MC)、黏膜下浸潤癌(submucosal invasive carcinoma, SMIC)者進行回顧性研究。排除標準: (1) 有炎癥性腸病、家族性腺瘤性息肉、既往有中、晚期結直腸惡性腫瘤病史；(2) 有其他部位惡性腫瘤病史；(3) 切除標本無法獲取或缺失切除病灶免疫組化結果；(4) 病理報告未具體記錄病灶黏膜下層浸潤的深度。

1.2 研究方法

2019年9月—2022年1月收集ECC病例，根病灶病理結果分為3組: HGN組(50例)、MC組(49例)、SMIC組(33例)，其中SMIC病例依浸潤深度分為黏膜下淺層浸潤(SM-s)組21例和黏膜下深層浸潤(SM-d)組12例?；仡櫺允占颊叩牟∈?、白光結腸鏡檢查的內鏡特征，基于窄帶成像(narrow-band image, NBI)技術留取的病變照片隨機編號后亂序排列，交由2位高年資內鏡醫(yī)師獨立觀察表面結構和微血管形態(tài)并記錄病灶JNET分型結果、切除病灶免疫組化切片在高倍鏡下隨機選取5個視野，計數(shù)Ki67陽性染色細胞數(shù)目，計算5個視野下陽性染色細胞占總細胞的百分比的平均值。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 一般資料

本研究共納入132例患者(132處病灶)，其中HGN組50例，MC組49例，SMIC組33例，男性82例，女性50例，平均年齡為(63.45±10.5)歲。本研究中一代直系親屬有結直腸癌史的患者僅1例，3組間年齡、性別、便血、血紅蛋白水平的差異無統(tǒng)計學意義，見表1。HGN組患者無消瘦癥狀，MC組和SMIC組患者消瘦表現(xiàn)的分布無統(tǒng)計學意義。

表1 患者一般資料比較Tab.1 General information and clinical indicatorsin three groups

2.2 病灶的內鏡下特征

納入132例ECC病灶的平均直徑為(26.22±11.6) mm，僅1(0.8%)個病灶直徑<10 mm，92.4%病灶直徑在10～40 mm，位于直腸、乙狀結腸、降結腸的病灶分別占31.1%、30.3%、13.6%，病灶巴黎分型以0-Ⅰp型(51.5%)、0-Ⅰs型(28.8%)、0-Ⅱa型(13.6%)為主。11.4%病灶表面存在糜爛或者潰瘍，42.4%病灶表面呈結節(jié)狀，46.2%病灶黏膜顏色較周圍正常黏膜發(fā)紅。

51.0%MC組病灶直徑≥30 mm，占比最高，3組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。HGN組、MC組、SMIC組位于左半結腸及直腸的病灶比例依次增加，其中SMIC組中比例高達84.8%，但3組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。3組中隆起型病灶的占比分別為72.0%、89.8%、81.8%，均高于平坦型病灶，組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。18.2%SMIC組病灶表面有中央凹陷，顯著高于HGN組(4.0%)和MC組(2.0%)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而組間病灶表面存在糜爛潰瘍、表面結節(jié)狀的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。有序多因素回歸結果發(fā)現(xiàn): 位于左半結腸及直腸(OR=2.487，95%CI: 1.081～5.717)、表面存在中央凹陷(OR=10.772,95%CI: 2.211～52.479)、黏膜顏色較周圍正常黏膜顏色紅(OR=2.168,95%CI: 1.084～4.334)和Ki67陽性細胞比率>25%(OR=2.668，95%CI: 1.171～6.083)是結直腸病灶發(fā)生黏膜下浸潤的獨立危險因素。

表2 病灶鏡下特征比較Tab.2 Endoscopic features of included lesionsin three groups

應用NBI觀察33例黏膜下浸潤結直腸癌病灶，并記錄相應JNET分型,見圖1。其中JNET分型為2A型共10枚，浸潤深度均為SM-s；Type 2B型共14枚，對應浸潤深度為10枚SM-s,4枚SM-d;Type 3型共9枚，對應浸潤深度為1枚SM-s，8枚SM-d。SM-s組和SM-d組間JNET分型分布差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，SM-d組中3型病灶比例顯著高于SM-s組(P<0.001)。3型對黏膜下深層浸潤的敏感度、特異度、準確率、陽性預測值和陰性預測值分別為66.7%、95.2%、84.8%、88.9%和83.3%。

圖1 NBI模式下JNET分型特點Fig.1 Features of JNET classification under NBI modeA: Type 2A型，血管粗細、分布均勻，表面結構規(guī)則，呈樹枝狀改變；B: Type 2B型，血管結構粗細不均、分布不均，表面結構不規(guī)則；C: 3型，缺乏血管腺管結構

2.3 病灶Ki67表達

HGN組、MC組、SMIC組病灶Ki67陽性細胞比率>25%的比例分別為68.0%、79.2%、84.8%，但3組間差異無統(tǒng)計學意義(P=0.177)。SM-s組23.8%病灶Ki67陽性細胞比率<25%，而SM-d組所有病灶Ki67陽性細胞比率均超過25%，超83%病灶Ki67陽性細胞比率>50%。將病灶Ki67陽性細胞比率劃分為有序分類變量，<1%計0分，1%～24%計1分，25%～49%計2分，50%～74%計3分，≥75%計4分，秩和檢驗結果示SM-s組和SM-d組病灶Ki67陽性細胞比率分布差異有統(tǒng)計學意義(P=0.026)。病灶的Ki67陽性細胞比率與黏膜下浸潤深度之間存在正向弱相關關系(r=0.394，P=0.023)。

2.4 JNET分型聯(lián)合Ki67診斷黏膜下深層浸潤

JNET(AUC=0.889，95%CI: 77.56%,100.22%)、Ki67(AUC=0.726，95%CI: 55.17%,90.07%)對于SM-d 有較高的診斷價值。而JNET聯(lián)合Ki67對于SM-d的診斷價值非常高(AUC=0.952，95%CI: 88.32%～102.16%)，在約登指數(shù)最大時的敏感度為88.3%，特異度為95.2%。Ki67、JNET聯(lián)合Ki67兩種診斷效果的AUC值差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.018)，見圖2。

圖2 JNET聯(lián)合Ki67陽性細胞比率預測SM-d的ROC曲線Fig.2 The ROC curve of JNET classification combined with Ki67 in predicting SM-d

3 討 論

據(jù)國際癌癥研究機構編制的GLOBOCAN 2020年癌癥發(fā)病率和死亡率估計值: 結直腸癌(colorectal carcinoma, CRC)位居惡性腫瘤發(fā)病譜第3位及惡性腫瘤死亡譜第2位[3]，我國CRC發(fā)病率及死亡率也呈現(xiàn)上升趨勢，其發(fā)病率從40歲開始上升，在50歲時出現(xiàn)顯著上升趨勢，男性CRC發(fā)病率及死亡率均高于女性[4]。Ⅰ期CRC與發(fā)生轉移的Ⅳ期患者的5年相對生存率存在顯著差異，Ⅰ期CRC可達90%，Ⅳ期僅為14%[5]，對CRC的早期診斷、早期干預治療可明顯改善患者生存質量及提高患者5年相對生存率。

目前國內外指南均支持，ECC首選內鏡下治療，主要是內鏡下黏膜切除術(endoscopic mucosal resection, EMR)和內鏡下黏膜剝離術(endoscopic sumucosal disection, ESD)。其中SMIC的治療方式選擇相對謹慎、復雜，黏膜下層浸潤深度≤1 mm時，一般推薦內鏡下治療，而深層黏膜下浸潤因有約10%的淋巴轉移的風險[6]，推薦外科手術治療，因此如何術前診斷黏膜下浸潤癌及準確判斷其浸潤深度對患者治療至關重要。

腺瘤性息肉是CRC的重要癌前病變，這些病變積累足夠突變后可發(fā)展為HGN、浸潤性癌，其癌變與腺瘤的數(shù)目、大小、位置、腺瘤種類、腺瘤表面形態(tài)等多因素有關。研究表明SMIC多發(fā)生在乙狀結腸、直腸，直徑<10 mm的病灶發(fā)生黏膜下浸潤的概率<1%[7]，隨著病灶直徑的增加，黏膜下浸潤的風險也逐漸增加。尤其當病灶直徑>50 mm時，黏膜下浸潤風險顯著增加[8]。本研究納入病灶61%以上位于直腸及乙狀結腸，病灶直徑集中在20～40 mm，MC組>30 mm病灶比例顯著高于HGN組和SMIC組(P=0.025)，未見病灶黏膜下浸潤風險隨著直徑增大而增加(P>0.05)。病灶直徑與SMIC浸潤深度相關性研究發(fā)現(xiàn)深層黏膜下浸潤CRC病灶平均直徑大于淺層浸潤者，但差異無統(tǒng)計學意義[9]。本研究結果類似，SM-d組病灶平均直徑[(24.58±6.8) mm]大于SM-s組[(22.81±8.9) mm]，組間差異同樣無統(tǒng)計學意義。Burgess等[8]發(fā)現(xiàn)淺表凹陷型(0-Ⅱc)是結直腸病灶發(fā)生黏膜下浸潤的高危因素。18.2%SMIC組病灶表面有中央凹陷，顯著高于HGN組(4.0%)和MC組(2.0%)，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.019)。本研究中表面存在中央凹陷病灶是表面無中央凹陷病灶癌變的10.77倍?；貧w模型分析結果顯示: 位于左半結腸及直腸、表面存在中央凹陷、黏膜顏色較周圍正常黏膜顏色紅和Ki67陽性細胞比率>25%是結直腸病灶發(fā)生黏膜下浸潤的獨立危險因素。

普通白光內鏡很難準確判斷SMIC浸潤深度，臨床上常借助多種光學增強內鏡技術用于胃腸道早癌的診治。基于窄帶成像(NBI)放大內鏡的JNET分型應用廣泛，通過實時觀察病變表面結構和微血管形態(tài)幫助判斷病理改變及浸潤深度[10]。Sumimoto等[11]認為JNET-3型是診斷SM-d的可靠指標，其敏感度、特異度和準確率為55.4%、99.8%和96.6%。本研究33例SMIC病灶中JNET-3型共9例，其中8例為SM-d，JNET-3型診斷SM-d的敏感度、特異度、準確率分別為66.7%、95.2%、83.3%，也呈現(xiàn)出高特異度和準確率。因此內鏡下觀察到病灶JNET-3型改變時，強烈提示已浸潤黏膜下深層，需要慎重考慮治療方式，甚至可將JNET-3型作為內鏡治療的禁忌證。

Ki67作為增殖細胞相關抗原，廣泛用于病理評估各種惡性腫瘤的細胞增殖能力，如肺癌、乳腺癌、淋巴瘤等[12-13]。Ki67表達在CRC的預后預測價值存在爭議，Melling等[14]認為Ki67高表達與CRC的低腫瘤分期相關。多項研究認為Ki67高表達提示CRC預后不良，CRC的浸潤深度、腫瘤大小、腫瘤分化程度在不同Ki67表達組的差異具有統(tǒng)計學意義[15-16]。Sugai等[17]定量分析黏膜下浸潤性結直腸癌中Ki67、p53、MMP7及α-SMA、CD10、FSP-1、FAP-1等表達，探究癌細胞及周圍基質細胞標志物表達模式與淋巴轉移之間的關聯(lián)，多變量分析顯示Ki67的高表達水平與黏膜下浸潤性結直腸癌的淋巴轉移顯著相關(P<0.05)。對于Ki67的截斷值目前尚存在爭議，一項評估Ki67與預后相關的各種截止水平的薈萃分析表明，與評估的其余截止點相比，Ki67陽性細胞比率>25%可提供更高的死亡風險區(qū)分能力[18]。Tong等[16]通過分析2 080例CRC病灶Ki67表達量與病理資料的相關性，病灶Ki67陽性細胞比率(+: >0且≤25%、++: >25且≤50%、+++: >50且≤75%、++++: >75%)在結直腸癌病灶不同浸潤深度(Tis和T1、T2、T3、T4)中的分布具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。Ki67的表達水平與病灶浸潤深度存在正向相關關系(r=0.170，95%CI: 0.113～0.225，P<0.001)。本研究對病灶浸潤深度劃分，病灶Ki67陽性細胞比率>25%在HGN組、MC組、SMIC組的分布無統(tǒng)計學意義。對黏膜下層浸潤結直腸癌進一步劃分浸潤深度，SM-s組和SM-d組病灶Ki67陽性細胞比率分布差異有統(tǒng)計學意義(P=0.026)。病灶的Ki67表達水平與黏膜下浸潤深度之間存在正向相關關系(r=0.394，P=0.023)。本研究還發(fā)現(xiàn)病灶Ki67陽性細胞比率>25%是結直腸病灶癌變的獨立危險因素。上述發(fā)現(xiàn)表明，使用25%作為Ki67表達的截止值是理想的，Ki67對早期結直腸癌的浸潤深度判斷具有重要意義。

JNET分型單獨診斷SM-d呈現(xiàn)出較高特異度和稍差敏感度，而病灶Ki67陽性細胞比率單獨診斷SM-d時則結果相反。聯(lián)合病灶JNET分型和Ki67陽性細胞比率時，則呈現(xiàn)出高敏感度和高特異度(83.3%和95.2%)。本研究JNET分型聯(lián)合病灶Ki67陽性細胞比率診斷SM-d時，ROC曲線的曲線下面積高達0.952，這表明內鏡下病灶特征聯(lián)合免疫組化有望提高評估黏膜下浸潤深度的準確性。但本研究黏膜下浸潤結直腸癌的樣本量較小及構成比偏倚較大，可能對結論有一定影響。

本研究初步探究了鏡下病灶特征聯(lián)合Ki67陽性細胞比率與病灶黏膜下層浸潤深度之間的關系，不足之處為單中心研究，樣本量相對較少。今后需多中心、擴大樣本量來進一步研究。