何宇 王建勛 王佩佩 崔鑫銘 王利

據(jù)2020年全球癌癥報告數(shù)據(jù)顯示，2020年非霍奇金淋巴瘤全球男性估計新發(fā)病例占比為3%，女性為2.6%，男性多于女性[1]。Burkitt’s 淋巴瘤屬于非霍奇金淋巴瘤的一種，是一種侵襲性極強(qiáng)的 B 細(xì)胞淋巴瘤，多發(fā)生于兒童和成年人[2-3]，臨床上主要分為地域型、散發(fā)型和免疫缺陷相關(guān)型三種[4]，Burkitt's 淋巴瘤對化療藥物高度敏感，目前臨床治療仍以多藥化療為主，同時包括靶向治療、細(xì)胞免疫治療、局部放療、自體干細(xì)胞移植等[5-6]。

中醫(yī)古籍中并沒有淋巴瘤一稱，隨著時代的發(fā)展，醫(yī)療的進(jìn)步，被現(xiàn)代中醫(yī)學(xué)家歸為“惡核”“痰核”“陰疽”等范疇，主要表現(xiàn)在“痰、毒、瘀、滯、虛”五個方面[7]，病因病機(jī)與邪毒、痰凝等有關(guān)，治療應(yīng)以解毒散瘀為原則[8-9]。蟾蜍，早在《神農(nóng)本草經(jīng)》[10]中便有記載：“蟆，味辛、寒，主邪氣，破堅(jiān)血，癰腫，陰瘡，服之不患熱病?！薄侗静菥V目》記載：“蟾蜍，辛、涼、微毒，最良治一切五疳八痢，腫毒，破傷風(fēng)病，脫肛?！比A蟾素注射液便是從蟾蜍科動物中華大蟾蜍或黑眶蟾蜍等蟾蜍干皮經(jīng)水提醇沉方法得到的水溶性提取物[11]，再加工成注射用滅菌水溶液，具有清熱解毒、化瘀潰堅(jiān)、利水消腫等作用。被廣泛用于肝癌、肺癌、胃癌等多種中晚期惡性腫瘤的治療，但華蟾素注射液對于Burkitt’s淋巴瘤治療方面少有研究。Raji細(xì)胞株于1963年首次從一個11歲小男孩左上頜骨Burkitt’s淋巴瘤中分離而得到的，為B細(xì)胞起源，是Burkitt’s淋巴瘤藥理學(xué)研究的理想選擇?；趯?shí)驗(yàn)室前期研究方案與方法[12]，因此本實(shí)驗(yàn)擬通過觀察和檢測不同濃度華蟾素注射液對Burkitt’s淋巴瘤細(xì)胞Raji的生物學(xué)影響，探討華蟾素注射液在治療Burkitt’s淋巴瘤方面的作用效果及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

人Burkitt's 淋巴瘤Raji細(xì)胞株(美國ATCC細(xì)胞庫，編號：CCL-86)；華蟾素注射液(安徽金蟾生化股份有限公司，批號：211201)；RPMI-1640培養(yǎng)基(美國CORNING公司，批號：34320006)；胎牛血清(美國Gibco公司，批號：2084568P)；1×PBS(美國Gibco公司，批號：8119312)；細(xì)胞增殖檢測試劑盒(cell counting kit-8，CCK-8)(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，批號：20211210)；膜聯(lián)蛋白—異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin-FITC/PI)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(北京金普來生物科技有限公司，批號：09001); PI/RNase Staining Buffer Solution細(xì)胞周期檢測試劑(美國BD公司，批號：1228040)。

生物安全柜(美國Thermo Scientific，型號：1300 SERUES A2)；小型臺式離心機(jī)(德國 Eppendorf，型號：5424R)；二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo Scientific，型號： HERAcell 150i)；倒置顯微鏡(日本 OLYMPUS，型號：CKX53)；細(xì)胞計數(shù)儀(美國invitrogen，型號：Countess Ⅱ)；自動酶標(biāo)儀(美國MolecμLar Devices，型號：SpectraMax i3x)；流式細(xì)胞儀 (美國BD，型號：FACSCantoⅡ)；IncuCyte實(shí)時動態(tài)細(xì)胞成像分析儀(美國Essen Bioscience，型號：IncuCyte S3)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

Raji細(xì)胞以5×105個/mL接種于含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)于飽和濕度、37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，待其密度達(dá)到70%～90%時需要傳代，每2～3天傳代1次。

1.3 CCK-8法檢測華蟾素注射液對Raji細(xì)胞增殖的影響

收集處于對數(shù)生長期的Raji細(xì)胞，每孔4×104個(90 μL)接種于96孔板，各設(shè)6個復(fù)孔，同時設(shè)置空白孔(僅含培養(yǎng)基)及對照孔(含有Raji細(xì)胞及培養(yǎng)基)，將華蟾素注射液用10% FBS-RPMI-1640培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋，分別為原濃度的1/10、1/20、1/40、1/50、1/100、1/200、1/400，各取10 μL加入至對應(yīng)實(shí)驗(yàn)孔內(nèi)，總體系100 μL，邊緣孔用無菌的PBS溶液進(jìn)行填充，于飽和濕度、37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12小時、24小時、48小時后，盡量避光的條件下加入10 μL CCK-8檢測溶液，輕輕振蕩混勻，放回培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育1.5小時,酶標(biāo)儀波長設(shè)置為450 nm，在此波長處讀取各孔的吸光度(OD值)，并計算各組細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)孔吸光度-空白孔吸光度)/(對照孔吸光度-空白孔吸光度)× 100%。

1.4 IncuCyte實(shí)時動態(tài)細(xì)胞成像分析系統(tǒng)監(jiān)測華蟾素注射液對Raji細(xì)胞增殖的影響

在實(shí)驗(yàn)室前期研究[12]基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)首次采用IncuCyte實(shí)時動態(tài)細(xì)胞成像分析系統(tǒng)對細(xì)胞生長狀態(tài)進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測與記錄。該系統(tǒng)的優(yōu)勢在于不僅可以實(shí)時記錄活細(xì)胞的生長狀態(tài)，還可以在成像的同時進(jìn)行定量分析，記錄影響細(xì)胞生物學(xué)行為的關(guān)鍵時間點(diǎn)等。

根據(jù)1.4實(shí)驗(yàn)結(jié)果，取處于對數(shù)生長期的Raji細(xì)胞，每孔以1×104個(90 μL)的密度接種于96孔板，各設(shè)4個復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)組加入10 μL華蟾素注射液稀釋液(1/10、1/20、1/40、1/50、1/100、1/200、1/400)，總體系100 μL，空白對照組加入10 μL培養(yǎng)基，實(shí)時監(jiān)測24小時，每隔2 小時拍照一次；以每孔0 h 0 m的匯合度為標(biāo)準(zhǔn)，觀察細(xì)胞生長情況。

1.5 流式細(xì)胞檢測華蟾素注射液Raji細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響

根據(jù)1.4實(shí)驗(yàn)結(jié)果，取處于對數(shù)生長期的Raji細(xì)胞，每孔以1×106個的密度接種于6孔板，各設(shè)4個復(fù)孔，選取濃度為原液濃度的1/20、1/50、1/200、1/400的華蟾素稀釋液作用于Raji細(xì)胞24小時，24小時后顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)。(1)細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)組：收集細(xì)胞于15 mL離心管內(nèi)，預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞1次，在渦旋條件下，逐滴加入預(yù)冷的70%乙醇1 mL，輕輕吹打混勻，在-20 ℃條件下固定過夜，過夜后離心棄上清，預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞1次，再使用300 μL PI/RNase Staining Buffer對細(xì)胞進(jìn)行染色, 室溫條件下，避光孵育15分鐘,用 40 μm濾網(wǎng)過濾細(xì)胞至流式管內(nèi),1小時內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測;(2)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)組：收集細(xì)胞于2 mL離心管內(nèi)，預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞1次，加入 100 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，每孔加入5 μL Annexin V-FITC抗體；混勻后室溫條件下避光孵育15分鐘，可在搖床上慢搖加速染色；15分鐘后加入10 μL PI；流式上機(jī)前在反應(yīng)管中加入100 μL結(jié)合緩沖液終止染色，用 40 μm 濾網(wǎng)過濾細(xì)胞，1小時內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞檢測。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 華蟾素注射液對Raji細(xì)胞增殖的影響

不同濃度華蟾素注射液作用于Raji細(xì)胞后，12小時、24小時、48小時存活率明顯低于空白對照組(1/400實(shí)驗(yàn)組的12小時和48小時除外)，并且華蟾素注射液濃度越高，Raji細(xì)胞存活率越低，說明抑制率越高，但抑制率與作用時間無明顯依賴性，見表1。

2.2 IncuCyte實(shí)時動態(tài)細(xì)胞成像分析系統(tǒng)監(jiān)測華蟾素注射液對Raji細(xì)胞增殖的影響

IncuCyte實(shí)時動態(tài)細(xì)胞成像分析系統(tǒng)監(jiān)測華蟾素注射液對Raji細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，不同濃度華蟾素注射液作用于Raji 細(xì)胞24小時后，以每孔0 h 0 m的匯合度為標(biāo)準(zhǔn)，通過匯合度變化曲線得出，實(shí)驗(yàn)組華蟾素1/10、1/20、1/40、1/50、1/100、1/200、1/400稀釋組可明顯抑制Raji細(xì)胞的增殖，且有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，見圖1～2，表2。

2.3 華蟾素注射液對Raji細(xì)胞周期及凋亡的影響

參考2.1結(jié)果，Raji細(xì)胞在為原液濃度1/20、1/50、1/200、1/400的華蟾素注射液24小時作用后，通過流式檢測其細(xì)胞周期及凋亡率的變化情況。結(jié)果顯示，華蟾素注射液可以增加Raji細(xì)胞 G0/G1和S 期的比例，降低G2/M期比例，阻止細(xì)胞進(jìn)入G2/M期，見圖3，表3；未經(jīng)華蟾素注射液處理的Raji細(xì)胞自然凋亡率較低，為 (12.65±0.65)%，而經(jīng)過1/20、1/50、1/200、1/400華蟾素注射液處理24小時后，Raji細(xì)胞凋亡率明顯升高，分別為(48.15±1.50)%、(33.50±1.51)%、(27.77±1.66)%、(14.72±0.43)%，說明華蟾素注射液能明顯誘導(dǎo)Raji細(xì)胞的凋亡，且有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，見圖4，表4。

表1 華蟾素注射液對Raji細(xì)胞增殖的影響

注：A 空白對照組0 h 0 m細(xì)胞成像圖；B 空白對照組24 h 0 m細(xì)胞成像圖；C 華蟾素1/20 稀釋組0 h 0 m細(xì)胞成像圖；D 華蟾素1/20 稀釋組24 h 0 m細(xì)胞成像圖；E 華蟾素1/200 稀釋組0 h 0 m細(xì)胞成像圖；F 華蟾素1/200 稀釋組24 h 0 m細(xì)胞成像圖。

注：以每孔0 h 0 m匯合度為標(biāo)準(zhǔn)，IncuCyte實(shí)時動態(tài)細(xì)胞成像分析系統(tǒng)獲取的各組匯合度變化曲線。

表2 IncuCyte實(shí)時動態(tài)細(xì)胞成像分析系統(tǒng)監(jiān)測不同稀釋倍數(shù)華蟾素注射液對Raji細(xì)胞增殖的影響

表3 不同稀釋倍數(shù)華蟾素注射液對Raji細(xì)胞周期的影響

注： 橫坐標(biāo)代表Annexin V-FITC，縱坐標(biāo)代表PI；Q1代表損傷或壞死細(xì)胞，Q2代表晚期凋亡的Raji細(xì)胞，Q3代表Raji活細(xì)胞，Q4代表早期凋亡的Raji細(xì)胞。

表4 不同稀釋倍數(shù)華蟾素注射液 對Raji細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

《中醫(yī)大辭典》中記載：“蟾蜍，辛，涼，有毒，有解毒消腫、止痛、利尿的功效?！斌蛤茏鳛槲覈鴤鹘y(tǒng)的抗腫瘤中藥材，因其藥效顯著而被廣泛研究。華蟾素注射液作為中國自行研發(fā)制作的中藥二類新藥，自上世紀(jì)80年代上市至今，在臨床應(yīng)用已有40余年[13]，華蟾素注射液化學(xué)成分較為復(fù)雜，截至目前已分離獲得單體化合物超過100種[14]，主要包括蟾蜍二烯羥酸內(nèi)酯類、小分子肽類、生物堿類及有機(jī)酸類等[15]。多項(xiàng)研究表明，蟾蜍二烯羥酸內(nèi)酯和吲哚生物堿兩大類具有抗腫瘤的作用[16]。大量臨床研究表明，華蟾素注射液與化療藥物聯(lián)用可有效降低化療藥物的不良反應(yīng)，安全性較好，可提高患者的生活質(zhì)量[17-19]。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，華蟾素注射液可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡對肝癌、肺癌、胃癌等多種實(shí)體瘤發(fā)揮抑制作用[17，19-21]。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞程序性死亡的一種形式，能有效地清除機(jī)體內(nèi)受損的細(xì)胞。細(xì)胞凋亡的失調(diào)不僅與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，而且與腫瘤對治療的抵抗有關(guān)[22]。根據(jù)先前的研究結(jié)果，華蟾素注射液一方面可通過調(diào)控肝癌細(xì)胞中Bcl-2/Bax和Fas/Fas L的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞啟動凋亡程序，抑制肝癌細(xì)胞的增殖[23]；還可通過調(diào)控miR-106a-5p/STRT3信號通路促進(jìn)凋亡發(fā)生[24]。本實(shí)驗(yàn)中，CCK-8法、IncuCyte活細(xì)胞成像以及流式檢測均發(fā)現(xiàn)，華蟾素注射液可有效抑制Raji細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡，且藥物濃度越高，作用效果越明顯。并且首次應(yīng)用IncuCyte動態(tài)監(jiān)測系統(tǒng)還直接觀察到，在華蟾素注射液干預(yù)6小時后，Raji細(xì)胞的增殖明顯受限，圖像顯示細(xì)胞呈皺縮狀態(tài)。

細(xì)胞周期由一系列的檢驗(yàn)點(diǎn)控制，當(dāng)DNA出現(xiàn)損傷時，可激活相關(guān)的檢驗(yàn)點(diǎn)蛋白，從而導(dǎo)致細(xì)胞周期的延遲或阻滯[25]，細(xì)胞周期的異?？芍苯佑绊懩[瘤細(xì)胞的增殖與分化。Han Y等[26]研究發(fā)現(xiàn)，華蟾素聯(lián)合吉非替尼可將A549細(xì)胞周期阻滯于S期。張霞等[27]實(shí)驗(yàn)表明，華蟾素注射液可阻滯Hep G2肝癌細(xì)胞于G0/G1期。本實(shí)驗(yàn)中，流式檢測及分析發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，不同濃度華蟾素注射液可阻滯Raji細(xì)胞周期于G0/G1期和S期，表明華蟾素注射液可能通過抑制Raji細(xì)胞周期發(fā)揮抗腫瘤作用。

綜上，本研究首次證實(shí)華蟾素注射液可抑制Burkitt's 淋巴瘤Raji細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡，阻滯細(xì)胞于G0/G1期和S期，發(fā)揮其抗腫瘤作用，為臨床治療Burkitt's 淋巴瘤提供新的思路及客觀的體外實(shí)驗(yàn)依據(jù)。后續(xù)研究可針對華蟾素注射液單體成分的作用效果、對Raji細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)及信號通路的影響進(jìn)行研究，進(jìn)一步明確華蟾素注射液治療Burkitt's 淋巴瘤的作用機(jī)制。