鈕妍 王澤中 國(guó)生 沈潛 楊靖頤 宋紅志 付國(guó)兵 王康

在過量運(yùn)動(dòng)發(fā)生后，由于皮質(zhì)醇和腎上腺素等應(yīng)激激素的超量分泌，血流動(dòng)力學(xué)發(fā)生顯著變化，加之氧化應(yīng)激水平的急劇升高，導(dǎo)致外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMCs)功能與結(jié)構(gòu)的異常，進(jìn)而引發(fā)暫時(shí)性的運(yùn)動(dòng)性免疫抑制[1]。此時(shí)，機(jī)體的防御屏障上就像打開了許多小窗戶，學(xué)術(shù)界稱之為免疫系統(tǒng)的“開窗現(xiàn)象”[2]。在這一階段，不僅會(huì)出現(xiàn)疲勞、乏力、注意力下降等主觀癥狀，也會(huì)增加各種細(xì)菌、微生物、病毒入侵的幾率。

本團(tuán)隊(duì)在前期研究中發(fā)現(xiàn)推拿可顯著改善運(yùn)動(dòng)性疲勞(exercise-induced fatigue，EF)引起的PBMCs凋亡及亞型分布失衡，從而減輕運(yùn)動(dòng)性氧化應(yīng)激引起的免疫炎性損傷[3]?；贓F狀態(tài)下引起氧化應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡主要通過線粒體的內(nèi)源性凋亡途徑實(shí)現(xiàn)，課題組以調(diào)控線粒體能量代謝及細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activited protein kinase，AMPK)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α,PGC-1α)、半胱氨酸蛋白酶(caspase-3)為切入點(diǎn)，通過分子生物學(xué)研究方法，初步探索了推拿改善EF模型大鼠PBMCs凋亡及免疫炎性抑制的調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6周齡SPF級(jí)雄性Wistar大鼠30只，體質(zhì)量(150±10)g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(京)2019-0009。大鼠飼養(yǎng)于醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物房，溫度18～22℃，相對(duì)濕度40%～60%，自由進(jìn)食和飲水。預(yù)訓(xùn)練及造模過程中先后剔除不會(huì)跑步大鼠2只及造模失敗大鼠4只，最終共有24只大鼠完成實(shí)驗(yàn)。本次實(shí)驗(yàn)通過北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核(編號(hào)：201940)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

蛋白酶抑制劑(瑞士Roche，批號(hào)：4693116001)，蛋白染色劑(美國(guó)Bio-Rad，批號(hào)：5000006)，磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(pAMP-activited protein kinase,pAMPK，1∶1 000，美國(guó)CST，批號(hào)：2535S)，AMPK(1∶1 000，美國(guó)CST，批號(hào)：5832S)，PGC-1α(1∶1 000，美國(guó)Affinty Biosciences，批號(hào)：AF5395)，caspase-3(1∶1 000，美國(guó)SANTA CRUZ，批號(hào)：sc-7272)，白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)(1∶1 000，美國(guó)SANTA CRUZ，批號(hào)：sc-52012)，腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)(1∶1 000，美國(guó)SANTA CRUZ，批號(hào)：sc-52746)，GAPDH(1∶4 000，英國(guó)Abcam，批號(hào)：ab128915)，ECL顯影液(美國(guó)thermo fisher scientific，批號(hào)：NCI5079)，轉(zhuǎn)印膜(德國(guó)Merck Millipore，批號(hào)：IPVH00010)，HRP二抗(1∶4 000，上海Beyotime，批號(hào)：A0208)。

1.3 分組及模型制備

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7天后，采用跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)的方法建立運(yùn)動(dòng)性氧化應(yīng)激模型。以坡度為0°，10 m/分鐘的速度跑20分鐘，每天1次，連續(xù)3天，作為大鼠適應(yīng)性跑臺(tái)訓(xùn)練。訓(xùn)練后，剔除不會(huì)跑步以及體質(zhì)量數(shù)據(jù)差異較大的大鼠2只，后隨機(jī)取出8只大鼠作為空白組。剩余20只大鼠運(yùn)用改進(jìn)的遞增跑臺(tái)有氧力竭運(yùn)動(dòng)法進(jìn)行造模，為期7天[4]。采用精神不振、對(duì)疼痛刺激反應(yīng)遲鈍、毛散且無(wú)光澤等行為學(xué)觀察指標(biāo)，并滿足隨機(jī)外周血乳酸含量>10 mmol/L視為造模成功。將16只成模大鼠隨機(jī)分為模型組及推拿組，每組各8只。

1.4 干預(yù)方法

推拿組每日力竭運(yùn)動(dòng)后予推拿干預(yù)1次，連續(xù)21天。干預(yù)方案如下：實(shí)驗(yàn)施術(shù)人員用不透光棉袋套住大鼠頭部及胸部，隨后將大鼠置于自然俯臥體位，一手輕按大鼠項(xiàng)背部安撫其情緒，另一手運(yùn)用中指揉法先后作用于雙側(cè)天樞穴，作用力1.5 N，頻率60次/分鐘，雙側(cè)同時(shí)施術(shù)，干預(yù)5分鐘；隨后食、中、無(wú)名三指松振法作用于中脘穴至關(guān)元穴的任脈區(qū)域，作用力1 N，頻率200次/分鐘，各干預(yù)5分鐘。每次腹部推拿干預(yù)時(shí)間總計(jì)15分鐘。

空白組及模型組在推拿組手法干預(yù)時(shí)段，給予同樣時(shí)長(zhǎng)及力度的抓取固定。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 外周血Lac、BUN及CK含量 各組大鼠在末次干預(yù)結(jié)束后禁食不禁水12小時(shí)，以6 mL/kg的劑量腹腔注射1%戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，腹主動(dòng)脈取血，在EP管中室溫靜置1.5小時(shí)，以3 000 r/分鐘離心10分鐘，取上清液，以全自動(dòng)生化分析儀對(duì)各組血清樣本進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

1.5.2 PBMCs中pAMPK、AMPK、PGC-1α、caspase-3、TNF-α及IL-1β蛋白表達(dá)水平 以蛋白免疫印跡法進(jìn)行檢測(cè)。每組隨機(jī)取3只大鼠的外周血清樣本并分離PBMCs，對(duì)分離后的PBMCs用含有蛋白酶抑制劑的裂解液進(jìn)行裂解(50 mmol/L Tris-Cl pH 7.4，1 mm EDTA pH 8.0，250 mm NaCl，1% Triton-X)。

蛋白裂解液濃度利用Bradford法進(jìn)行測(cè)量。10 μg從PBMCs細(xì)胞中獲得的細(xì)胞裂解液與5×樣品緩沖液(15 g SDS，15.6 mL 2M Tris pH 6.8，57.5 g glycerol，16.6 mL β-mercaptoethanol)混合后，將樣品上樣至10%聚丙烯酰胺凝膠中，SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用含0.1%吐溫的4%牛奶進(jìn)行封閉后，加入以下抗體，4℃孵育過夜。用含0.1%吐溫的PBS溶液將膜洗3遍后，加入含0.1%吐溫的4%牛奶以及HRP二抗在室溫條件下孵育1小時(shí)。取出膜，在膜上滴加ECL顯影液并放入MiniChemi成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。Image J軟件進(jìn)行光密度分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 推拿對(duì)EF大鼠外周血疲勞相關(guān)代謝產(chǎn)物的影響

與空白組比較，模型組外周血中Lac、BUN、CK水平顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，推拿組外周血中的Lac、BUN及CK水平顯著降低(P<0.05，P<0.01)。見表1。

表1 各組EF大鼠外周血Lac、BUN、CK水平比較

2.2 推拿對(duì)EF大鼠PBMCs線粒體能量代謝及凋亡關(guān)鍵因子的影響

與空白組比較，模型組PBMCs中的pAMPK/AMPK及PGC-1α蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)，caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，推拿組PBMCs中的pAMPK/AMPK及PGC-1α蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05，P<0.01)，caspase-3蛋白表達(dá)水平出現(xiàn)下降趨勢(shì)。見表2、圖1。

表2 各組EF大鼠PBMCs中pAMPK/AMPK比值、 PGC-1α、caspase-3表達(dá)水平比較

圖1 各組EF大鼠PBMCs中AMPK、pAMPK、PGC-1α、

2.3 推拿對(duì)EF大鼠PBMCs中炎性因子水平的影響

與空白組比較，模型組PBMCs中的TNF-α及IL-1β水平顯著上調(diào)(P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，推拿組PBMCs中的TNF-α及IL-1β水平顯著下調(diào)(P<0.05，P<0.01)。見表3、圖1。

表3 各組EF大鼠PBMCs中TNF-α、IL-1β水平比較

dP<0.01。

3 討論

EF歸屬于中醫(yī)學(xué)“虛勞”范疇，病機(jī)為氣血不足，痰濁內(nèi)生。本團(tuán)隊(duì)在長(zhǎng)期臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)此病的治療應(yīng)予以攻補(bǔ)兼施之法，由于脾主肌肉，為后天之本、氣血生化之源，在治療過程中既要通過手法加速“瘀濁”代謝，同時(shí)更要重視補(bǔ)益脾胃之氣。因此，臨床治療不僅是在疲勞的肌肉局部施術(shù)，更應(yīng)注重腹部手法施術(shù)。腹部推拿不僅具有健脾化濁的功效，同時(shí)兼顧培補(bǔ)元?dú)?，在臨床上亦取得了顯著的療效[5-6]。

本次研究精簡(jiǎn)了臨床處方，選取“天樞、中脘、關(guān)元”三個(gè)具備臨床核心治療思路的代表性腧穴，在控制變量的基礎(chǔ)上，最大程度還原了腹部推拿的治療思路。結(jié)果顯示，腹部推拿后EF模型大鼠外周血中Lac、BUN及CK等疲勞代謝產(chǎn)物的水平顯著下降，說明單純腹部推拿干預(yù)同樣具有較好的抗疲勞效果。天樞、關(guān)元、中脘三穴分別為大腸、小腸、胃之腹募穴，合而用之具有傳導(dǎo)糟粕、泌別清濁及化生氣血的功能，配合松振法及揉法寓通于補(bǔ)的手法特性，能夠更好地將腧穴的功效發(fā)揮出來[7]。從解剖角度來看，天樞穴毗鄰腎臟于腹部的體表投影，中脘、關(guān)元下方為腹主動(dòng)脈，通過手法干預(yù)可加速血液循環(huán)與水液代謝，在保證能量供給的同時(shí)促使代謝廢物清除，從而保護(hù)心、肝、腎等臟器功能。

研究表明，中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)可以增強(qiáng)免疫系統(tǒng)功能，而超量運(yùn)動(dòng)則會(huì)引起分泌型免疫球蛋白A、干擾素等免疫分子的水平下降，從而促進(jìn)運(yùn)動(dòng)性免疫抑制的出現(xiàn)[8]。EF可伴有單核巨噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞數(shù)量減少，中性淋巴細(xì)胞功能減退，引起機(jī)體炎癥水平升高，進(jìn)而導(dǎo)致糖皮質(zhì)激素、血管緊張素、促腎上腺皮質(zhì)激素、白細(xì)胞介素和腫瘤壞死因子數(shù)量降低，淋巴細(xì)胞數(shù)量減少，最后發(fā)生脾和胸腺免疫器官的萎縮與結(jié)構(gòu)異常[9-10]。長(zhǎng)期的EF狀態(tài)可使一過性的免疫抑制發(fā)展為慢性免疫力低下，最終使機(jī)體整體患病率上升，違背了“強(qiáng)身健體”的初衷。根據(jù)團(tuán)隊(duì)前期的研究發(fā)現(xiàn)，推拿可改善EF導(dǎo)致的PBMCs凋亡比率升高及細(xì)胞功能障礙，可能是其減輕運(yùn)動(dòng)性免疫抑制，增強(qiáng)免疫系統(tǒng)功能的部分生物學(xué)機(jī)制[11]。因此，本次研究旨在明確推拿是否通過AMPK/PGC-1α/caspase-3信號(hào)途徑實(shí)現(xiàn)了對(duì)EF大鼠PBMCs的凋亡抑制作用，并改善了PBMCs的炎癥狀態(tài)。

結(jié)果顯示，腹部推拿干預(yù)后大鼠PBMCs的pAMPK/AMPK和PGC-1α蛋白表達(dá)水平顯著下降。AMPK既是細(xì)胞能量代謝的“開關(guān)”，又是維持線粒體穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵因子[12]，PGC-1α是線粒體生物合成的直接調(diào)控因子[13]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明腹部推拿或可改善PBMCs的整體能量代謝水平，促進(jìn)線粒體的生物合成。caspase-3表達(dá)水平在推拿后雖沒有顯著差異，但呈現(xiàn)出了一定下降趨勢(shì)，提示caspase-3的mRNA轉(zhuǎn)錄速率或蛋白降解速率發(fā)生了一定程度的衰減，但也不排除推拿不依賴caspase-3途徑抑制凋亡的可能，具體原因可通過延長(zhǎng)干預(yù)時(shí)間及添加對(duì)基因轉(zhuǎn)錄情況的檢測(cè)進(jìn)行完善。炎性因子IL-1β及TNF-α表達(dá)水平的顯著下調(diào)說明腹部推拿可以減輕EF狀態(tài)下機(jī)體廣泛氧化應(yīng)激反應(yīng)引起的PBMCs內(nèi)免疫炎性反應(yīng)，從而間接緩解PBMCs凋亡。已有研究發(fā)現(xiàn)線粒體功能障礙后釋放的活性氧可激活NLRP3炎性體，表明線粒體不僅調(diào)控著細(xì)胞凋亡，同時(shí)也在細(xì)胞炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[14]。因此，腹部推拿可通過恢復(fù)PBMCs線粒體功能及生物合成，改善了PBMCs炎癥水平。

本次研究雖然初步明確了AMPK/PGC-1α信號(hào)鏈參與了推拿抗凋亡及炎癥效應(yīng)的形成，但由于缺少抑制劑組，并未闡明該通路是否為實(shí)現(xiàn)手法效應(yīng)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。其次，本次研究中推拿調(diào)控casapase-3等凋亡關(guān)鍵信號(hào)分子的影響尚未明確，對(duì)推拿手法抗凋亡的作用途徑有待進(jìn)一步研究。最后，由于本次研究的結(jié)果提示線粒體或是推拿手法作用的關(guān)鍵靶細(xì)胞器，日后圍繞線粒體生物合成及能量代謝關(guān)鍵信號(hào)通路開展研究也將有助于進(jìn)一步揭示推拿改善運(yùn)動(dòng)性氧化應(yīng)激及免疫抑制的生物學(xué)機(jī)制。