◎ 阮明倩

（濟(jì)寧市糧食和物資儲(chǔ)備保障中心，山東 濟(jì)寧 272000）

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氫氧化鈉、鹽酸、95%乙醇、無水乙醇、氯仿、正丁醇、3,5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、95.5%濃硫酸、6%苯酚和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品均為分析純，購(gòu)自杭州米克化工；唾液、人工胃液、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-木糖、D-阿拉伯糖、D-半乳糖和N-AC-D-氨基葡萄糖（純度均≥99%），購(gòu)自阿拉丁試劑；1%NaOH溶液、甲醇、三氟乙酸（Trifluoroacetic Acid，TFA）和1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-pheny-3-methyl-5-pyrazolone，PMP）均為分析純，購(gòu)自杭州米克化工。

1.2 儀器與設(shè)備

Anglent 1100高效液相色譜儀：安捷倫；HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市國(guó)旺實(shí)驗(yàn)儀器廠；DHG-9240A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；AL04型電子天平：梅特勒-托利多有限公司；移液槍：Dragon；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 黑木耳粗多糖（AA）的提取

本文選用堿提法提取黑木耳粗多糖。將黑木耳子實(shí)體研磨成粉，過60目篩，按原料∶溶液=1∶160（m/V）加入1%（m/V）氫氧化鈉溶液，80 ℃水浴加熱攪拌3 h，用適量HCl中和NaOH。將制備得到的液體樣品于2 000 r·min-1離心25 min。取上清液，按原料∶配液=1∶（4V/V）取適量上清液和95%乙醇，混勻，于4 ℃放置6 h后，于8 000 r·min-1離心10 min，將產(chǎn)生的沉淀物在去離子水中充分溶解。

1.3.2 多糖除雜

用透析法除去包括低聚糖在內(nèi)的小分子雜質(zhì)。將粗多糖溶液裝入透析袋（3 000 Da）中，放置在容器中加入去離子水透析48 h，每隔一段時(shí)間換一次廢水，重復(fù)多次。

1.3.3 多糖除蛋白

Sevag法條件溫和，可保證多糖性質(zhì)基本穩(wěn)定，因此本文參照姜紅[1]的方法，選用Sevag法除去蛋白質(zhì)。但此法效率較低，若想要完全除盡蛋白質(zhì)至少要重復(fù)5次。

1.3.4 多糖得率的測(cè)定

（1）苯酚-硫酸法測(cè)定總糖含量[2]。①標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。將葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品置于105 ℃烘干至恒重，準(zhǔn)確稱取0.1 g于去離子水中溶解，至1 L的容量瓶中定容。分別取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL和0.5 mL，加入去離子水補(bǔ)充至0.5 mL，以0.5 mL去離子水為空白對(duì)照。均加入6%苯酚0.5 mL和濃硫酸2.5 mL，靜置10 min，置于30 ℃水浴20 min后于490 nm測(cè)定吸光度。②樣品含量測(cè)定。吸取待測(cè)樣0.1 mL，加去離子水1.9 mL、6%苯酚l mL，迅速加入濃硫酸5 mL，振蕩搖勻，30 ℃水浴加熱20 min。在490 nm處測(cè)定吸光度（OD490），以水為空白對(duì)照，做3組平行實(shí)驗(yàn)。

（2）DNS法測(cè)定還原糖含量[3]。①標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。將葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品于105 ℃烘干至恒重，準(zhǔn)確稱取0.1 g溶于去離子水，至100 mL的容量瓶中定容。分別取1 mg·mL-1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL和0.5 mL，加入去離子水補(bǔ)充至1 mL，以1 mL去離子水為空白對(duì)照。均加入DNS溶液0.75 mL，混勻，沸水浴加熱5 min，冷卻至室溫后加入去離子水3.25 mL。于540 nm測(cè)定吸光度，用空白管調(diào)零，得標(biāo)準(zhǔn)曲線。②樣品含量測(cè)定。吸取待測(cè)樣1.0 mL，加去離子水1.0 mL，水楊酸1.5 mL，充分混合，沸水浴加熱5 min后立刻用冷水冷卻至室溫，加入21.5 mL去離子水，于540 nm處測(cè)定吸光度（OD540）。以水為空白對(duì)照，做3組平行實(shí)驗(yàn)。

1.3.5 多糖純度的鑒定

將多糖配制成0.5%的溶液，4 000 r·min-1離心10 min，選用高效液相色譜法對(duì)多糖純度進(jìn)行鑒定，色譜參數(shù)如下。

高效液相色譜儀：Anglent 1100；分析柱：79911GF-083型 PL aquagel-OH 30（300 mm×7.5 mm，8 μm），79911GF-084型PL aquagel-OH 40（300 mm×7.5 mm，8 μm），兩柱串聯(lián)；流動(dòng)相：去離子水；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：30 ℃；檢測(cè)器：示差折光檢測(cè)器；檢測(cè)溫度：35 ℃。

1.3.6 黑木耳多糖體外水解物制備

取1 g（100 mL）AA，加適量唾液使之充分反應(yīng)，用 1 mol·L-1的鹽酸調(diào)節(jié)至 pH 2.5，加入溶于 0.05 mol·L-1鹽酸的10%人工胃液1 mL，37 ℃水浴加熱20 min，期間持續(xù)攪拌模擬胃腸蠕動(dòng)，取出樣品，立即用氫氧化鈉溶液中和，透析后于-20 ℃保存。

1.3.7 黑木耳多糖體外水解物的單糖組成

本文采用PMP柱前衍生化HPLC法測(cè)定體外水解物的單糖組成[4]。

（1）水解多糖AA。將黑木耳粗多糖AA凍干，取10 mg凍干樣品放入安瓿瓶，加入2 mol·L-1TFA 2 mL，火焰槍封口，110 ℃水解2 h，室溫下冷卻，加入甲醇除去剩余的TFA，于200 μL去離子水中復(fù)溶。

（2）制備單糖標(biāo)準(zhǔn)品。分別取50 mg D-木糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖、D-阿拉伯糖、N-AC-D-氨基葡萄糖，溶解于50 mL去離子水中配制成單糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液。將上述6種溶液分別吸取100 μL于5 mL離心管中混勻配制混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

（3）衍生化。分別取100 μL單糖標(biāo)準(zhǔn)品、混合標(biāo)準(zhǔn)品、多糖水解液于3個(gè)5 mL離心管中，共同加入100 μL 0.3 mol·L-1氫氧化鈉溶液和 100 μL 0.5 mol·L-1甲醇，漩渦振蕩30 s，70 ℃水浴加熱30 min后冷卻至室溫，加入 100 μL 0.3 mol·L-1氯化氫溶液、100 μL 去離子水和1.6 mL氯仿。將各試劑充分混勻后振蕩30 s，靜置5 min，將上層水相裝入離心管中，重復(fù)萃取3次，過0.45 μm針筒式水系膜后待測(cè)。

（4）高效液相色譜條件。色譜柱：Hypersil ODS2（250 mm×4.6 mm，5 μm），附紫外檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：40 ℃；流速：1.0 mL·min-1；流動(dòng)相：A乙酸銨（20 mol·mL-1），B乙腈。

梯度洗脫程序：0～10 min，16%→17%乙腈；10～ 35 min，17% → 22% 乙 腈；35～ 36 min，22%→16%乙腈。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖得率

得到總糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.007 6x+0.018 4（R2=0.990 1），還原糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.717 1x-0.004 9（R2=0.998 2），計(jì)算得多糖得率為52.08%。

2.2 多糖純度的鑒定

AA經(jīng)高效液相色譜分析，得到單一峰，推測(cè)多糖為單一組分。

2.3 黑木耳多糖的單糖組成分析

2.3.1 單糖標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線

以單糖標(biāo)準(zhǔn)品峰面積為縱坐標(biāo)，單糖標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量（mg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到單糖的回歸方程和相關(guān)系數(shù)。甘露糖：y=496.42x+20.639，R2=0.996 6；氨基葡萄糖：y=1 039.6x-11.626，R2=0.997 8；葡萄糖：y=752.33x-4.405，R2=0.999 0；半乳糖：y=254.33x+12.443，R2=0.996 1； 木 糖：y=401.39x+15.62，R2=0.993 2；阿拉伯糖：y=1 726.9x+20，R2=0.993 4。

2.3.2 體外水解物的單糖組成

高效液相色譜法測(cè)定黑木耳多糖體外水解物的單糖組成結(jié)果如圖1所示。各組分保留時(shí)間分別為14.5 min、19.9 min、23.2 min、24.8 min、26.9 min 和28.7 min，根據(jù)各組分出峰時(shí)間確定單糖組分為甘露糖、氨基葡萄糖、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖，且甘露糖含量最多。由峰面積及單糖標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算，得到各單糖組分摩爾比為1.00∶0.12∶0.53∶0.07∶0.29∶0.53（以甘露糖為基準(zhǔn)）。

圖1 黑木耳多糖體外水解物的高效液相色譜圖

3 結(jié)論

本文對(duì)堿提得到的多糖溶液采取苯酚-硫酸法測(cè)定總糖濃度，DNS法測(cè)定還原糖濃度，計(jì)算出多糖得率為52.08%。選取有合適吸收峰的多糖溶液進(jìn)行體外水解，利用高效液相色譜測(cè)定粗多糖AA的單糖組成為甘露糖、氨基葡萄糖、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖，摩爾比為1.00∶0.12∶0.53∶0.07∶0.29∶0.53。

分離純化出結(jié)構(gòu)單一、作用機(jī)理明確的黑木耳多糖成分是深入研究及開發(fā)黑木耳多糖衍生商品的難點(diǎn)之一，關(guān)鍵是要找到一種高效理想的分離制備純化方法，為全面認(rèn)識(shí)多糖化學(xué)結(jié)構(gòu)與生物活性的關(guān)系和活性機(jī)制打下基礎(chǔ)[5]。本研究只取得了一些階段性的成果，要想研究出對(duì)健康有益的、能帶來較高經(jīng)濟(jì)效益的黑木耳多糖深加工衍生產(chǎn)品，需要廣大學(xué)者的共同努力，取得更有價(jià)值的研究成果。