陳舒 王鵬

他莫昔芬是非甾體類抗雌激素藥，主要用于乳腺癌的輔助治療[1]。他莫昔芬為前體藥物，主要通過細胞色素P450 2D6酶（CYP 2D6）代謝成為具有生物活性的4-羥基-N-去甲基他莫昔芬（Endoxifen）。研究顯示，抗抑郁藥可不同程度地抑制CYP 2D6酶活性[2]，影響他莫昔芬的體內(nèi)代謝并增加乳腺癌的復(fù)發(fā)風險[3]。目前，他莫昔芬與抗抑郁藥相互作用已得到國內(nèi)外廣泛關(guān)注。氟哌噻噸美利曲辛片（商品名：黛力新）為抗抑郁復(fù)方制劑，治療乳腺癌伴焦慮抑郁具有較好效果[4-5]，長期服用他莫昔芬的乳腺癌患者聯(lián)合使用黛力新進行抗抑郁治療是臨床普遍采用的治療策略。該研究旨在探討黛力新、氟哌噻噸和美利曲辛對他莫昔芬在大鼠體內(nèi)代謝的影響，以明確黛力新及其組分對他莫昔芬體內(nèi)代謝的影響是否一致，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要儀器 ACQUITY UPLC I-Class型超高效液相色譜、Xevo TQD型質(zhì)譜儀（美國Waters公司），WA10005型十萬分之一電子分析天平（上海方瑞儀器有限公司），XW-80A型渦旋混合器（海門其林貝爾儀器制造有限公司），TGL-16G型高速冷凍離心機（上海安亭科學儀器廠），Mill-Q A10型超純水系統(tǒng)（默克密理博有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑 鹽酸氟哌噻噸標準品（上海創(chuàng)賽科技有限公司，批號J0612A，純度99.0%），鹽酸美利曲辛標準品（上海創(chuàng)賽科技有限公司，批號RQC226，純度98.40%），他莫昔芬標準品（上海創(chuàng)賽科技有限公司，批號C10388213，純度99%），N-去甲基他莫昔芬標準品（加拿大多倫多研究化學品公司，批號6-SKS-119-2，純度98%），地西泮標準品（內(nèi)標，西格瑪奧德里奇上海貿(mào)易有限公司，純度95%～105%），磷酸鹽緩

沖液（PBS，北京索萊寶科技有限公司），甲醇、乙腈（色譜級，德國默克公司），甲酸（色譜級，德國默克公司），鹽酸（分析級，北京化工廠公司）。

1.3 實驗動物 健康清潔級雌性SD大鼠，體質(zhì)量為（280±40）g，由溫州醫(yī)科大學實驗動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（浙）2020-0001。該研究所有動物實驗均通過溫州醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會和溫州醫(yī)科大學實驗動物中心審查。

1.4 色譜條件 色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7μm），柱溫為40 ℃，流動相為乙腈-0.1%甲酸溶液（梯度洗脫，見表1），流速為0.4 mL/min，進樣量為2 μL。

表1 流動相梯度洗脫程序

1.5 質(zhì)譜條件 離子源為ESI源，采用正離子檢測方式；毛細管電壓為2 kv，離子源溫度為150 ℃，脫溶劑氣溫度為500 ℃，錐孔氣流量為50 L/Hr，脫溶劑氣流量為1,000 L/Hr；采用多離子監(jiān)測模式，他莫昔芬、N-去甲他莫昔芬和內(nèi)標地西泮的MS參數(shù)見表2。

表2 他莫昔芬、N-去甲他莫昔芬和地西泮的質(zhì)譜參數(shù)

1.6 溶液的制備 （1）他莫昔芬標準溶液的配制：精密稱取他莫昔芬標準品粉末10 mg，甲醇溶解后轉(zhuǎn)至10 mL量瓶中定容并混勻，即得到質(zhì)量濃度為1 mg/mL的標準溶液，于4 ℃保存?zhèn)溆谩＞芊Q取適量標準溶液用甲醇稀釋成1、2.5、5、10、25、50、100、250、500、1,000 ng/mL系列溶液。（2）N-去甲基他莫昔芬標準溶液的配制：精密稱取N-去甲基他莫昔芬標準品粉末1 mg，甲醇溶解后轉(zhuǎn)至10 mL量瓶中定容并混勻，即得到質(zhì)量濃度為100 μg/mL的標準溶液，于4 ℃儲存?zhèn)溆?。精密稱取適量標準溶液用甲醇稀釋成1、2.5、5、10、25、50、100、250、500、1,000 ng/mL系列溶液。（3）內(nèi)標標準溶液的配制：精密量取1 mg 地西泮標準品至100 mL量瓶中，甲醇定容并混勻，即得質(zhì)量濃度為10 μg/mL地西泮母液。再精密量取5 mL上述母液至另一100 mL量瓶中，加入甲醇稀釋并定容，即得質(zhì)量濃度為500 ng/mL的內(nèi)標標準溶液，于4 ℃存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 實驗方案和樣本采集處理 將20只雌性SD大鼠實驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機分為空白對照組（0.3% CMCNa+0.24% DMSO）、氟哌噻噸組（0.21 mg/kg）、美利曲辛組（4.21 mg/kg）和黛力新組（氟哌噻噸0.21 mg/kg+美利曲辛4.21 mg/kg），每組各5只。各組給藥劑量依據(jù)黛力新說明書臨床等效最大給藥劑量折算，藥物配制時先使用0.5 mL DMSO溶解，再使用0.3% CMC-Na溶液溶解稀釋。各組大鼠在給藥前禁食12 h，但提供自由飲水，相應(yīng)藥物灌胃30 min后，各組均再灌胃他莫昔芬10 mg/kg（0.3% CMCNa溶解）。在給藥結(jié)束后0.083、0.25、0.5、1、2、3、4、6、8、12、24 h，大鼠尾靜脈采集血樣0.3 mL至含肝素的離心管中，以13,000 r/min離心10 min，獲取血漿樣品。取樣品50 μL至1.5 mL離心管中，加入150 μL乙腈沉淀蛋白，加入30 μL的內(nèi)標溶液，充分渦旋2 min后，以13,000 r/min離心5 min，取上清2 μL進樣分析。

1.8 方法學驗證 （1）專屬性：分別取大鼠空白血漿、他莫昔芬組血漿樣品和黛力新處理組大鼠2 h后血漿樣品適量，按照上述樣本方法處理，依據(jù)色譜條件和質(zhì)譜條件分析樣本，得到色譜圖，見圖1。他莫昔芬、N-去甲基他莫昔芬以及內(nèi)標的保留時間分別為1.31、1.30、1.31 min。與對照色譜圖比較，峰型良好，無干擾物，有良好的專屬性。（2）線性范圍及定量下限考察：取空白血漿180 μL，分別加入相應(yīng)質(zhì)量濃度的他莫昔芬（或N-去甲基他莫昔芬）標準系列溶液20 μL，渦旋混勻，配制成質(zhì)量濃度為0.1、0.25、0.5、1、2.5、5、10、25、50、100 ng/mL的他莫昔芬（或N-去甲基他莫昔芬）系列標準品的血漿樣品溶液，樣品處理后進樣檢測記錄色譜圖。以系列他莫昔芬（或N-去甲基他莫昔芬）標準血漿樣品濃度為橫坐標（x），待測物和內(nèi)標的峰面積比為縱坐標（y）進行線性回歸，得他莫昔芬的標準曲線方程為y=0.0310x+0.0097（R2=0.9961），N-去甲基他莫昔芬的標準曲線方程為y=0.0293x+0.0015（R2=0.9994）。兩種藥物濃度在0.1～100 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，定量下限0.1 ng/mL（信噪比為10∶1）。（3）精密度與準確度：分別配制低（0.1 ng/mL）、中（2.5 ng/mL）、高（100 ng/mL）標準血漿濃度的他莫昔芬（或N-去甲基他莫昔芬），每個濃度平行制備6份。按照上述色譜質(zhì)譜條件進樣分析，同日內(nèi)不同時間點連續(xù)測量6次考察日內(nèi)精密度，連續(xù)3 d進樣考察日間精密度。通過實測濃度和標示濃度的比較來考察準確度。結(jié)果顯示，他莫昔芬和N-去甲基他莫昔芬的日內(nèi)日間精密度均＜15%，準確度RE分別為-6.67%～1.43%和-4.18%～4.03%，結(jié)果均符合生物樣本定量分析標準，見表3。（4）基質(zhì)效應(yīng)：取適量空白血漿進行樣本處理，處理得到的上清液配制成低（0.1 ng/mL）、中（2.5 ng/mL）、高（100 ng/mL）濃度樣品，各濃度平行6份，取2 μL按照色譜質(zhì)譜條件進樣檢測，記錄峰面積為A1（或B1）。用甲醇分別配制低、中、高濃度的他莫昔芬（或N-去甲基他莫昔芬）純標準溶液，直接進樣檢測，記峰面積為A2（或B2）。以A1/A2（或B1/B2）分別計算基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果顯示他莫昔芬和N-去甲基他莫昔芬的基質(zhì)效應(yīng)均符合要求，見表4。（5）穩(wěn)定性試驗：按照“1.8.2”配制低（0.1 ng/mL）、中（2.5 ng/mL）、高（100 ng/mL）三種濃度的他莫昔芬和N-去甲基他莫昔芬空白血漿溶液，分別考察樣品在室溫、4 ℃、-80 ℃凍融3次和-80 ℃放置30 d后的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，各濃度樣品在上述四種條件下RSD值均＜15%，他莫昔芬和N-去甲基他莫昔芬血漿樣品存貯在上述條件下穩(wěn)定性良好，見表5。

表3 血漿樣品中他莫昔芬和N-去甲基他莫昔芬的精密度與準確度（n=6）

圖1 他莫昔芬、N-去甲基他莫昔芬以及內(nèi)標色譜圖

表4 血漿樣品中他莫昔芬和N-去甲基他莫昔芬的基質(zhì)效應(yīng)（n=6）

表5 各貯備條件下血漿樣品中他莫昔芬和N-去甲基他莫昔芬的穩(wěn)定性（n=6）

1.9 數(shù)據(jù)處理方法 應(yīng)用Origin 8軟件分析各采血點的血藥濃度并繪制藥時曲線。采用DAS 2.0軟件，選擇非房室模型進行擬合分析，得到大鼠血漿他莫昔芬及其代謝物的藥動學參數(shù)。使用SPSS 24.0軟件對主要藥代動力學參數(shù)進行統(tǒng)計學分析，計量資料符合正態(tài)分布以（±s）表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05表示有統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果

UPLC-MS/MS法測定各組大鼠血液中不同時間點他莫昔芬和N-去甲基他莫昔芬的濃度，繪制平均藥時曲線，見圖2和圖3。依據(jù)血藥濃度求算的藥動學參數(shù)，見表6和表7。結(jié)果顯示，與對照組比較，氟哌噻噸能顯著降低他莫昔芬的AUC（0-∞）（P＜0.05）和Cmax（P＜0.05），增加他莫昔芬CLz/F（P＜0.05）。美利曲辛對他莫昔芬在大鼠體內(nèi)過程無明顯影響。黛力新顯著降低他莫昔芬的Cmax（P＜0.05），明顯降低他莫昔芬的AUC和CLz/F，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），提示氟哌噻噸和黛力新對他莫昔芬體內(nèi)代謝有不同程度的誘導作用。由圖3、表7可知，與對照組比較，聯(lián)用氟哌噻噸能顯著降低N-去甲基他莫昔芬的AUC（0-t）（P＜0.05）和Cmax（P＜0.05），增加N-去甲基他莫昔芬CLz/F（P＜0.05）。美利曲辛能顯著增加N去甲基他莫昔芬在大鼠體內(nèi)的清除率CLz/F（P＜0.05），增加表觀分布容積Vz/F（P＜0.05）。黛力新降低N-去甲基他莫昔芬的AUC（0-t）（P＜0.05），增加N-去甲基他莫昔芬的CLz/F，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），提示氟哌噻噸、美利曲辛和黛力新對N-去甲基他莫昔芬體內(nèi)代謝均有不同程度的誘導作用。

圖2 四組大鼠中他莫昔芬的藥時曲線（n=5）

圖3 四組大鼠中N-去甲基他莫昔芬的藥時曲線（n=5）

表6 4組大鼠血漿中他莫昔芬的主要藥動學參數(shù)[（±s），n=5]

表6 4組大鼠血漿中他莫昔芬的主要藥動學參數(shù)[（±s），n=5]

注：與他莫昔芬組比較，*P＜0.05

參. 他莫昔芬. 他莫昔芬+氟哌噻噸組他莫昔芬+美利曲辛組他莫昔芬+黛力新組AUC（0-t）（ug·h/L）1,169.64±256.92 755.36±144.55 1,034.03±266.26 890.24±114.50 AUC（0-∞）（ug·h/L）1,193.00±268.39 779.86±137.79*. 1,073.81±264.15 923.92±143.52 MRT（0-t）（h. 8.18±1.18 7.16±1.03 7.64±0.74 7.78±1.05 MRT（0-∞）（h. 8.55±1.27 7.69±0.94 8.40±1.25 8.56±1.45 t1/2z（h. 3.54±0.43 3.46±0.84 4.48±0.99 4.13±1.43 Tmax（h. 5.20±2.28 6.40±0.89 6.00±1.41 5.20±1.79 CLz/F（L/kg. 0.009±0.002 0.013±0.003*. 0.010±0.002 0.011±0.001 Vz/F[L/（h·kg）] 0.045±0.013 0.064±0.007 0.065±0.030 0.064±0.017 Cmax（ug/L. 137.74±37.28 93.71±21.24*. 123.02±16.62 92.74±12.63*

表7 大鼠血漿中N-去甲基他莫昔芬的藥動學參數(shù)（n=5）

3 討論

他莫昔芬在體內(nèi)第一步代謝主要經(jīng)過CYP2D6和細胞色素P450 3A酶（CYP3A）代謝成中間體N-去甲基他莫昔芬，進而再由CYP2D6第二步代謝為主要活性代謝產(chǎn)物Endoxifen來發(fā)揮抗腫瘤作用[6-7]。研究顯示，他莫昔芬活性代謝產(chǎn)物血藥濃度低，臨床長期服用4個月才能達到較高的穩(wěn)態(tài)血藥濃度[8-9]，所以本實驗方法未能檢測到Endoxifen血藥濃度與單劑量他莫昔芬給藥后大鼠體內(nèi)Endoxifen血藥濃度偏低有關(guān)，但其中間代謝產(chǎn)物N-去甲基他莫昔芬在某種程度會直接影響Endoxifen的血藥濃度[10]，并與他莫昔芬表現(xiàn)的不良反應(yīng)有關(guān)[11]。因此，該實驗通過測定他莫昔芬和N-去甲基他莫昔芬的藥物濃度變化來闡明藥物代謝變化情況，還建立了同時測定大鼠血漿中他莫昔芬和N-去甲基他莫昔芬的UPLC-MS/MS定量分析方法，相較于胡東莉等[12]的測量方法，該方法采用分離度更好的1.7 μm色譜柱，樣品處理采用更為簡便的蛋白沉淀法，具有更好的分離度與峰形，其靈敏度滿足血漿檢測要求，且已成功用于藥動學實驗研究。

他莫昔芬第二步代謝實驗結(jié)果顯示，氟哌噻噸、美利曲辛和黛力新均能不同程度地誘導N-去甲基他莫昔芬轉(zhuǎn)化成Endoxifen，說明黛力新的誘導作用是氟哌噻噸和美利曲辛共同作用的結(jié)果。N-去甲基他莫昔芬主要通過CYP2D6酶轉(zhuǎn)化為活性成分Endoxifen，且研究顯示抗抑郁藥會通過影響CYP2D6酶活性來影響他莫昔芬的體內(nèi)代謝過程[13]，因此筆者猜測氟哌噻噸和美利曲辛可能通過誘導CYP2D6酶活性來促進N-去甲基他莫昔芬的代謝過程，而該誘導作用理論上能減少N-去甲基他莫昔芬的血藥濃度，增加活性代謝產(chǎn)物Endoxifen，前者與藥物的不良反應(yīng)相關(guān)，后者與藥物的療效相關(guān)，可見黛力新對他莫昔芬具有減毒增效的作用。

他莫昔芬第一步代謝實驗結(jié)果顯示，氟哌噻噸和黛力新對他莫昔芬的第一步代謝過程有不同程度的誘導作用，但黛力新的誘導作用較氟哌噻噸弱，說明黛力新對他莫昔芬代謝的誘導作用與其中的氟哌噻噸有關(guān)，且在聯(lián)用美利曲辛后氟哌噻噸的誘導作用有所減弱。初步代謝過程涉及的代謝酶，除CYP2D6外還有CYP3A等其他肝藥酶代謝通道。由此推測，美利曲辛對其他肝藥酶通道的抑制作用使得黛力新對他莫昔芬初步代謝過程的誘導作用弱化。

綜上所述，黛力新對他莫昔芬和N-去甲基他莫昔芬的體內(nèi)代謝過程不僅無抑制作用，還顯示出一定的誘導作用，而且該誘導作用可能與藥物對肝藥酶的影響有關(guān)，理論上會提高他莫昔芬的療效和降低不良反應(yīng)，但該觀點仍需進一步研究驗證支持。