古米娜·卡米力，區(qū)頌邦，杜鳳嬌，王文軍*，李瑞岐，*

(1.喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，喀什 840000；2.中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院生殖內(nèi)分泌專(zhuān)科，廣州 510120)

細(xì)胞體外培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)生微生物污染可以說(shuō)自該技術(shù)發(fā)展以來(lái)就一直存在，胚胎體外培養(yǎng)自然也在其中，因此預(yù)防微生物污染是輔助生殖技術(shù)(ART) 實(shí)驗(yàn)室的基本原則[1]。國(guó)內(nèi)有多個(gè)生殖中心對(duì)胚胎污染事件進(jìn)行過(guò)報(bào)道[2-12]，這些研究中體外受精(IVF) 胚胎培養(yǎng)中污染發(fā)生率在0.04%～1.32%之間，平均污染發(fā)生率為0.27%，其中有1項(xiàng)研究報(bào)道了在ICSI周期發(fā)生污染的情況，發(fā)生率為0.02%[5]。國(guó)外學(xué)者報(bào)道的IVF周期污染發(fā)生率在0.18%～0.68%之間[13-17]，平均污染發(fā)生率為0.44%，ICSI周期污染發(fā)生率與國(guó)內(nèi)報(bào)道一致，為0.02%[16]。雖然發(fā)生比例比較低，但是一旦發(fā)生，危害性極大，往往導(dǎo)致患者無(wú)胚胎可用，進(jìn)而整個(gè)周期被取消，對(duì)患者的經(jīng)濟(jì)和心里均會(huì)造成極大的損害。

在發(fā)生胚胎污染時(shí)，目前常用的方法是使用含抗生素的培養(yǎng)基充分洗滌，最大可能地去除胚胎表面的微生物[8-11]。雖然洗滌的方法在一定程度上可以挽救被污染的胚胎，但是由于胚胎透明帶的特殊結(jié)構(gòu)[18]，往往很難將微生物徹底去除，多數(shù)情況下在洗滌后仍會(huì)有微生物的生長(zhǎng)。那么在發(fā)生污染時(shí)，將胚胎的透明帶去除或者削薄是否可以挽救被污染的胚胎？目前尚未見(jiàn)有此類(lèi)研究報(bào)道。本研究將對(duì)此問(wèn)題進(jìn)行探討，以期為處理被污染的胚胎提供更有效的處理措施。

資料與方法

一、研究對(duì)象

本研究中樣本來(lái)自中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院生殖中心，多精受精卵來(lái)自21例行IVF助孕患者的捐贈(zèng)，患者年齡在24～40歲之間。

該研究獲得中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院倫理審批(2022-KY-05)。

二、研究方法

1.胚胎感染過(guò)程：本實(shí)驗(yàn)在獨(dú)立細(xì)胞培養(yǎng)室進(jìn)行，使用獨(dú)立培養(yǎng)箱(APC-30D，ASTEC，日本)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后對(duì)培養(yǎng)箱內(nèi)部進(jìn)行消毒處理。多精受精卵各分3次收集，收集后的受精卵培養(yǎng)于G1-plus培養(yǎng)液(Vitrolife，瑞典)，并在胚胎培養(yǎng)液滴中，靠近胚胎的部位加入約1 μl含菌培養(yǎng)液，共培養(yǎng)4 h。之后隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組兩組，并分別進(jìn)行處理。大腸桿菌組共感染20枚多精受精卵，糞腸球菌組共感染24枚多精受精卵。

首次感染細(xì)菌來(lái)源于發(fā)生胚胎污染的胚胎培養(yǎng)液，之后的細(xì)菌來(lái)源于上次實(shí)驗(yàn)后收集的含細(xì)菌培養(yǎng)液。

2.污染后處理：根據(jù)污染處理方案分為兩組。(1)對(duì)照組：采用常規(guī)培養(yǎng)液洗滌的方法，用平衡過(guò)的G1-plus培養(yǎng)液在培養(yǎng)皿中做5個(gè)約50 μl的液滴，將被污染的胚胎在每個(gè)液滴的不同位置反復(fù)吹洗，每過(guò)一個(gè)液滴更換一支新的巴氏吸管；洗滌后胚胎培養(yǎng)于平衡過(guò)的G1-plus培養(yǎng)液中。(2)實(shí)驗(yàn)組：首先將被污染的胚胎用平衡過(guò)的G1-plus培養(yǎng)液吹洗3～5次，多個(gè)胚胎可一起吹洗，之后放于平衡過(guò)的G1-plus培養(yǎng)液中等待去除透明帶。去除透明帶時(shí)，用預(yù)熱至37℃的臺(tái)式酸在培養(yǎng)皿中做一個(gè)約20 μl的液滴，旁邊做3個(gè)20 μl的G1-plus培養(yǎng)液滴。將單個(gè)胚胎放入臺(tái)式酸液滴中(Tyrode’s Solution，T1788，Sigma，美國(guó))，并用吸管單方向撥動(dòng)胚胎，當(dāng)觀察到透明帶開(kāi)始消失時(shí)，立即將胚胎取出放于G1-plus培養(yǎng)液中，更換新的巴氏吸管后，快速在3個(gè)G1-plus培養(yǎng)液滴中輕柔吹洗，之后培養(yǎng)于G1-plus培養(yǎng)液中。每個(gè)胚胎依次按照上述方式進(jìn)行處理。

3.胚胎培養(yǎng)：各組胚胎處理完畢后，受精卵(有個(gè)別已卵裂) 培養(yǎng)于G1-plus中。D3時(shí)將胚胎移入平衡過(guò)的G2-plus培養(yǎng)液(Vitrolife，瑞典)培養(yǎng)至D6。培養(yǎng)環(huán)境為37℃、6%CO2，飽和濕度。

4.觀察指標(biāo)：觀察各組的胚胎再次污染率、D2胚胎卵裂率、D4胚胎融合率(含部分卵裂球融合) 以及囊胚形成率。

污染判定：培養(yǎng)液渾濁，20倍鏡下可見(jiàn)大量微生物。

三、統(tǒng)計(jì)方法

使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以率(%)表示，采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用3次實(shí)驗(yàn)的總值(率)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組間的統(tǒng)計(jì)分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、污染模型

多精受精卵在經(jīng)過(guò)大腸桿菌或糞腸球菌污染培養(yǎng)液處理4 h后，在胚胎培養(yǎng)液滴中均出現(xiàn)大量細(xì)菌生長(zhǎng)。

二、去透明帶對(duì)大腸桿菌污染胚胎的洗滌效果及發(fā)育的影響

該部分研究分3批次進(jìn)行，每次收集的多精受精卵數(shù)分別為7、7、6，具體分組如表1所示。經(jīng)相應(yīng)污染處理措施后，對(duì)照組D2觀察到3批次胚胎均再次發(fā)生污染，D2卵裂率為80.00%(8/10)，胚胎在D3均全部發(fā)生退化，沒(méi)有進(jìn)行囊胚培養(yǎng)；實(shí)驗(yàn)組3批次均未發(fā)生再次污染，D2時(shí)胚胎全部發(fā)生卵裂，并在D3時(shí)全部進(jìn)行囊胚培養(yǎng)，D4胚胎融合率為60.00%(6/10)，其中3個(gè)胚胎卵裂球完全融合、3個(gè)胚胎部分融合，其中1個(gè)胚胎未融合的卵裂球與融合部分發(fā)生分離(表1)。

表1 去透明帶對(duì)大腸桿菌污染胚胎的洗滌效果及發(fā)育的影響

三、去透明帶對(duì)糞腸球菌污染胚胎的洗滌效果及發(fā)育的影響

利用同樣的方法，我們檢測(cè)了發(fā)生糞腸球菌污染時(shí)，去透明帶防止再次污染的效率以及對(duì)胚胎發(fā)育的影響。對(duì)照組共11枚受精卵，總污染率為81.82%(9/11)，總卵裂率為72.73%(8/11)，其中2枚沒(méi)有再次污染的胚胎行囊胚培養(yǎng)后，在D4時(shí)未形成桑椹胚，無(wú)囊胚形成；實(shí)驗(yàn)組共14枚受精卵，總污染率為14.29%(2/14)，D3將未被污染的12枚胚胎進(jìn)行囊胚培養(yǎng)后有6枚發(fā)生融合，融合率為50.00%(6/12)，其中2枚完全融合、4枚部分融合，沒(méi)有卵裂球游離現(xiàn)象發(fā)生，共有2枚囊胚形成，囊胚率為16.67%(表2)。

表2 去透明帶對(duì)糞腸球菌污染胚胎的的洗滌效果及發(fā)育的影響

討 論

在本研究中我們嘗試通過(guò)去除被污染胚胎透明帶的方法，阻止細(xì)菌對(duì)胚胎的再次污染。結(jié)果顯示，針對(duì)發(fā)生大腸桿菌和糞腸球菌污染的胚胎，去除透明帶能夠有效防止再次污染的發(fā)生，并且也能夠較好地維持胚胎的后續(xù)發(fā)育。Shu等[17]也嘗試了對(duì)被污染的胚胎進(jìn)行去透明帶的方法，不過(guò)其報(bào)道中是將被污染的胚胎培養(yǎng)至囊胚，在凍融胚胎移植周期(FET) 將胚胎的透明帶全部去掉后進(jìn)行移植，使2例患者獲得了妊娠，妊娠過(guò)程沒(méi)有發(fā)現(xiàn)不良反應(yīng)。本研究與之區(qū)別是在污染發(fā)現(xiàn)時(shí)及時(shí)將透明帶去除，防止粘在透明帶上的細(xì)菌對(duì)胚胎造成再次污染，影響胚胎發(fā)育。

胚胎培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)生微生物污染在ART中屬于較為嚴(yán)重的不良事件，會(huì)對(duì)胚胎的發(fā)育以及患者的利益產(chǎn)生較大影響，甚至產(chǎn)生醫(yī)療糾紛。在這些細(xì)菌污染中，50%以上都是由大腸桿菌引起的，其次還有糞腸球菌、肺炎克雷伯桿菌等，多數(shù)來(lái)源于精液[12，15]。真菌污染較為常見(jiàn)的是念珠菌，有研究顯示，念珠菌污染對(duì)胚胎的發(fā)育影響較小，胚胎可以進(jìn)行移植[13，16]。而細(xì)菌污染發(fā)生后，其增殖代謝要消耗大量的養(yǎng)分，同時(shí)產(chǎn)生多種有害的代謝產(chǎn)物，如酶、抗原及內(nèi)毒素等，會(huì)嚴(yán)重影響胚胎的發(fā)育，甚至影響胚胎染色體的整倍性[15]。有研究顯示，某些細(xì)菌在體內(nèi)共培養(yǎng)12 h后可導(dǎo)致小鼠卵母細(xì)胞DNA碎片化，提示這是影響卵母細(xì)胞和/或胚胎質(zhì)量的機(jī)制之一[19]。

李俐琳等[4]的報(bào)道顯示，多種污染微生物均可對(duì)胚胎產(chǎn)生致死效應(yīng)，例如大腸桿菌、草綠色溶血鏈球菌、表皮葡萄球菌、產(chǎn)吲哚黃桿菌、銅綠假單胞菌、腦膜膿毒性金黃桿菌等，有些是在受精過(guò)程中導(dǎo)致卵子死亡，有些是在培養(yǎng)過(guò)程中導(dǎo)致胚胎死亡。同一種細(xì)菌可以在不同的時(shí)間點(diǎn)對(duì)卵子或者胚胎造成死亡，這可能與細(xì)菌的亞型或者濃度有關(guān)。羅清炳等[7]報(bào)道了10個(gè)污染周期，其結(jié)果顯示，在受精過(guò)程中發(fā)生污染后，卵子的受精情況未受影響，但是胚胎的卵裂率和優(yōu)胚胎率均顯著降低，并且所有移植周期均未獲得妊娠。在聶睿等[9]報(bào)道的38例胚胎污染中，13例胚胎死亡或退化，3例胚胎發(fā)育停滯，2例胚胎發(fā)育遲緩，1例未卵裂。一些處理方法雖然可以挽救部分被污染的胚胎，但是多數(shù)情況下處理后的胚胎仍舊發(fā)生污染，最終無(wú)胚胎可用。我們以往的研究結(jié)果[2]顯示，在胚胎全部污染的42例中，有34例最終無(wú)可用胚胎；在移植的6例中，僅1例獲得妊娠?？梢?jiàn)，污染發(fā)生后及時(shí)并有效的處理對(duì)胚胎的后續(xù)發(fā)育至關(guān)重要。

本研究提供了一種新的污染胚胎處理方法，并且可重復(fù)性較好，可以在保持胚胎發(fā)育潛能的前提下，有效避免再次污染的發(fā)生。但是本方法存在一定的局限性及可能的風(fēng)險(xiǎn)：第一，該方法處理后的胚胎需要進(jìn)行囊胚培養(yǎng)，不適合卵裂期胚胎移植；第二，去除透明帶是在強(qiáng)酸溶液中進(jìn)行，操作時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能會(huì)損傷卵膜或者卵裂球胞質(zhì)膜，影響胚胎發(fā)育；第三，在胚胎早期將透明帶去除可能會(huì)導(dǎo)致胚胎在分裂過(guò)程中卵裂球間的接觸松散甚至分離。為了避免以上可能的風(fēng)險(xiǎn)，我們建議操作者盡量縮短胚胎在臺(tái)式酸中的作用時(shí)間，在操作時(shí)，觀察到透明帶出現(xiàn)變化后立即將胚胎吸出。另外，建議處理后的胚胎采用有獨(dú)立孔的time-lapse培養(yǎng)皿進(jìn)行培養(yǎng)或者采用懸滴(倒置) 培養(yǎng)，盡可能防止卵裂球的離散。

另外，在發(fā)生細(xì)菌污染時(shí)，用含其他抗生素的培養(yǎng)基進(jìn)行處理也是去除污染源的一種方法。薛生娟等[10]報(bào)道了2例使用含0.15 mg/ml青、鏈霉素的HEPES培養(yǎng)液洗滌后成功挽救被大腸桿菌污染胚胎的案例。另外也有多項(xiàng)利用含慶大霉素培養(yǎng)基成功挽救被細(xì)菌污染胚胎的報(bào)道[8，11]。因此，我們推薦，在胚胎培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)生細(xì)菌污染時(shí)，可先用含不同種類(lèi)抗生素的培養(yǎng)基進(jìn)行洗滌，在沒(méi)有效果后改用本方法做進(jìn)一步處理。

綜上所述，胚胎培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)生微生物污染后，去除胚胎透明帶可以高效阻斷污染的再次發(fā)生。鑒于微生物污染多發(fā)生于IVF周期，建議在原核觀察當(dāng)天(D1)常規(guī)對(duì)IVF受精皿進(jìn)行觀察，對(duì)可疑有細(xì)菌污染的受精皿，當(dāng)天下午觀察胚胎培養(yǎng)皿是否確有細(xì)菌生長(zhǎng)，以便早發(fā)現(xiàn)早處理，盡可能減少細(xì)菌對(duì)胚胎的不利影響，有利于胚胎的后續(xù)發(fā)育。