朱元昌，馬壯鴻，姜薇，譚芳，曾泳梅，鄧偉芬

(深圳恒生醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，深圳 518000)

隨著不孕不育的發(fā)生率逐年升高，輔助生殖技術(shù)(ART)成為不孕不育癥治療的重要手段。在過去的幾十年里，ART取得持續(xù)長足的進步，臨床成功率已提升至50%以上[1]，然而有部分患者即使經(jīng)過多次體外受精-胚胎移植(IVF-ET)仍未成功妊娠，在臨床上被稱為反復(fù)種植失敗(RIF)。RIF通常是指≥2個新鮮或凍融周期，移植≥4枚優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎或≥2枚優(yōu)質(zhì)囊胚而未獲得臨床妊娠的現(xiàn)象，在臨床中發(fā)生率為10%～15%[2-4]。RIF的發(fā)生會給患者帶來沉重的心理負擔(dān)，同時也給臨床工作帶來巨大的挑戰(zhàn)。

為了改善RIF患者的妊娠結(jié)局，近年來生殖領(lǐng)域?qū)W者一直在努力，并取得了一些不錯的進展，例如利用胚胎植入前非整倍體檢測(PGT-A)、子宮內(nèi)膜容受性基因表達譜檢測以及子宮內(nèi)膜微生態(tài)的檢測等，以排除由胚胎非整倍體[5]、子宮內(nèi)膜種植窗與胚胎發(fā)育不同步和內(nèi)膜菌群失調(diào)引起宮腔微環(huán)境改變而導(dǎo)致的種植失敗[6-7]。這些檢測方法和臨床手段在一定程度上能解決部分RIF患者的問題，改善妊娠結(jié)局。但由于檢測時長、價格、資質(zhì)及取樣對內(nèi)膜存在損傷等原因，無論是PGT-A、子宮內(nèi)膜容受性檢測還是內(nèi)膜微生態(tài)的檢測，在檢測的當(dāng)個周期均不能進行新鮮周期移植，需推后移植時間，延長了患者達到臨床妊娠的時長。因此，尋找一種無創(chuàng)、價格合適、對中心資質(zhì)和設(shè)備要求不苛刻的方法十分重要，學(xué)者們一直在嘗試各種不同的方法，其中序貫移植是較為有應(yīng)用前景的一種。序貫移植通常是指在取卵后第3天(D3)給患者移植1枚卵裂期胚胎，在同一個周期的D5/D6給患者移植1枚囊胚的移植方法。有文獻報道，與常規(guī)的卵裂期或囊胚移植相比較，序貫移植能夠改善RIF患者的臨床妊娠結(jié)局[8]。本研究回顧性分析近兩年就診于我院的RIF患者，探討胚胎序貫移植對RIF患者臨床妊娠結(jié)局的改善作用，為序貫移植的推廣以及如何提高RIF患者的臨床妊娠的成功率提供參考。

資料與方法

一、研究對象與分組

回顧性分析2020年1月1日至2021年8月31日在我院生殖醫(yī)學(xué)科行IVF-ET治療的RIF患者的臨床資料。

納入標準：(1)符合RIF診斷標準的定義；(2)同一周期內(nèi)移植1枚D3卵裂期胚胎和1枚D5/D6的囊胚，或移植2枚D3卵裂期胚胎或D5/D6囊胚。

排除標準：存在子宮畸形(單角子宮、鞍型子宮等)、子宮腺肌癥、疤痕子宮、宮腔粘連以及夫婦雙方或一方染色體異常者。

本研究共納入符合標準的122個移植周期。根據(jù)是否進行序貫移植分成序貫組(57個周期，同一周期內(nèi)移植1枚D3卵裂期胚胎和1枚D5/D6的囊胚)和非序貫組(65個周期，同一周期內(nèi)移植2枚D3卵裂期胚胎或2枚D5/D6囊胚)。此外，根據(jù)傾向性匹配的原則，按照與序貫組1∶5的比例選取與RIF患者女方年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)及抗苗勒管激素(AMH)水平相匹配的同期就診的非RIF患者作為對照組(移植2枚D3卵裂期胚胎或者移植2枚D5/D6囊胚)，共納入在本院行首次移植的對照組285個周期。

二、研究方法

1.控制性促排卵：入選周期控制性促排卵采用長方案和拮抗劑方案為主，當(dāng)至少有2個卵泡直徑超過18 mm或者有3個卵泡直徑超過17 mm時給予肌肉注射HCG(珠海麗珠制藥)5 000 U，36 h后在B超引導(dǎo)下經(jīng)陰道行取卵術(shù)。

2.精液處理和授精：女方患者取卵當(dāng)天丈夫采用手淫法取精。待精液完全液化后采用密度梯度離心15 min，離心力500g；洗滌后通過上游法獲得優(yōu)選精子，計算上游后精子的濃度和活力并置于培養(yǎng)箱中待用。授精的最終濃度(四孔板每孔中卵母細胞≤6枚)為1.0×105/ml。

3.短時受精與原核(PN)觀察：人工授精后置于37℃、6%CO2培養(yǎng)箱進行孵育，4～5 h后去除顆粒細胞，觀察卵母細胞極體(PB)個數(shù)；若極體數(shù)量為2，則顯示受精成功。第2天早上，即授精后16～18 h后觀察PN情況。若為2PN和2PB，表示正常受精；若為1PN，則為1PN受精；若為3個或以上PN，則為多原核受精。

4.胚胎發(fā)育及臨床結(jié)局的評價：根據(jù)卵裂球的細胞數(shù)目、大小、形態(tài)、碎片比例、空泡、多核、發(fā)育速度等綜合評估胚胎質(zhì)量。D3優(yōu)質(zhì)胚胎需要同時滿足以下條件：D1為2PN受精；D2胚胎細胞數(shù)為3～5個，綜合評級為I或Ⅱ級；D3細胞數(shù)為7～9個或融合狀，綜合評級為I或Ⅱ級。優(yōu)質(zhì)囊胚定義為：D1為2PN受精，D5/D6囊胚分期在3期及以上，滋養(yǎng)層細胞和內(nèi)細胞團評分為A或B。序貫移植患者在D3移植1枚卵裂期胚胎，2～3 d后再次移植1枚D5/D6的囊胚；非序貫移植患者在D3移植2枚卵裂期胚胎或在D5/D6移植2枚囊胚。移植12 d后(囊胚移植10 d后)進行尿試紙和血清HCG檢測，若血清HCG>25 U/L記為HCG陽性；移植35 d后超聲檢查觀察到孕囊及原始心血管搏動者記為臨床妊娠。根據(jù)孕囊個數(shù)及繼續(xù)妊娠情況統(tǒng)計臨床妊娠率、胚胎種植率、多胎率以及隨訪12周內(nèi)的早期流產(chǎn)率。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

一、各組間基礎(chǔ)資料比較

序貫組、非序貫組及對照組間男女雙方的平均年齡、不孕年限、AMH水平、BMI以及原發(fā)不孕比例等基礎(chǔ)資料均無顯著性差異(P>0.05)。序貫組和非序貫組平均移植次數(shù)及平均取卵次數(shù)較為接近(P>0.05)，且均顯著高于對照組(P<0.05)(表1)。

二、各組間胚胎發(fā)育參數(shù)比較

各組間平均獲卵數(shù)、2PN受精率、多PN受精率、2PN卵裂率、D3優(yōu)胚率、可利用D3胚胎率、囊胚形成率、可利用囊胚率以及優(yōu)質(zhì)囊胚率均無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

三、各組間臨床妊娠結(jié)局比較

與非序貫組相比，序貫組的臨床妊娠率及種植率有升高趨勢，多胎率及早期流產(chǎn)率有下降趨勢；但各組間移植胚胎數(shù)、HCG陽性率、臨床妊娠率、多胎妊娠率、種植率及早期流產(chǎn)率均無顯著性差異(P>0.05)(表3)。

為了進一步分析不同年齡段序貫移植的臨床結(jié)局，將納入研究對象按照不同年齡分為≤30歲、>30～<36歲、36～≤40歲、>40歲亞組，并進行分層分析。統(tǒng)計結(jié)果顯示，各組間的基礎(chǔ)資料均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05，數(shù)據(jù)未再贅述)?！?0歲、>30～<36歲、36～≤40歲的患者中，序貫組、非序貫組和對照組的HCG陽性率、臨床妊娠率、多胎妊娠率、種植率及早期流產(chǎn)率均無顯著性差異(P>0.05)。而>40歲的患者中，序貫組和對照組的HCG陽性率、臨床妊娠率和種植率顯著高于非序貫組(P<0.05)，早期流產(chǎn)率略低于非序貫組(P>0.05)；與對照組相比，序貫組的臨床妊娠率與種植率有升高的趨勢，流產(chǎn)率有下降的趨勢，但尚無顯著性差異(P>0.05)。提示序貫移植有利于改善高齡患者的臨床妊娠結(jié)局(表4)。

表4 不同年齡段各組間臨床妊娠結(jié)局比較(%)

討 論

RIF是ART中常見的并發(fā)癥，也是目前ART中的臨床難點和研究熱點[9]。本研究數(shù)據(jù)顯示，序貫移植可以顯著改善年齡超過40歲RIF患者的臨床妊娠率以及胚胎種植率，這與Monteleone等[10]的報道類似，提示在高齡RIF患者中通過序貫移植能夠改善臨床妊娠結(jié)局，這為RIF患者移植方案的選擇提供了參考與指導(dǎo)。

胚胎的成功種植依賴于高發(fā)育潛能的胚胎以及容受性良好的子宮內(nèi)膜，兩者缺一不可[11]。多次種植失敗的患者除了自身的胚胎因素外，有越來越多的學(xué)者關(guān)注到子宮內(nèi)膜容受性在胚胎種植失敗中扮演的作用。簡單來說就是子宮內(nèi)膜是否能夠與“外來的”胚胎建立有效的“對話與應(yīng)答”以及“應(yīng)答”后能否順利接受種植前的胚胎[12]。有數(shù)據(jù)顯示，約25%的RIF患者是由于子宮內(nèi)膜的發(fā)育不同步導(dǎo)致的[13]。而序貫移植可能是解決子宮內(nèi)膜種植窗不同步的有效方法，主要原因是序貫移植是在同一周期內(nèi)先后分2次移植，通常是D3移植1枚卵裂期胚胎，D5/D6再移植1枚囊胚；第1次移植胚胎后對子宮內(nèi)膜造成了刺激，促進了子宮內(nèi)膜與胚胎的同步化發(fā)展，第2次移植時，子宮內(nèi)膜就能迅速識別胚胎，為胚胎的著床做好充分準備，從而有效提高胚胎種植率以及臨床妊娠率[14]。

序貫移植不僅能改善胚胎著床的同步化問題，同時在RIF患者的移植策略上也有相應(yīng)的優(yōu)勢。如果RIF患者移植兩枚D3卵裂期胚胎，仍不能獲得滿意的臨床妊娠結(jié)局，可能讓患者再次承受巨大的心理壓力；如果選擇囊胚移植，則需要所獲得胚胎全部養(yǎng)囊，尤其是當(dāng)患者D3可利用胚胎數(shù)目少、胚胎質(zhì)量較差的情況下可能無法形成可利用的囊胚；且即使患者條件好可以形成囊胚，移植2枚囊胚后多胎妊娠的風(fēng)險大大增加。序貫移植較好地解決了這一難題，在改善臨床妊娠率的前提下還降低了多胎妊娠的風(fēng)險[15]。本研究結(jié)果中3組間多胎妊娠率雖無顯著性差異，但序貫組的多胎妊娠率仍表現(xiàn)出低于其他兩組的趨勢。

本研究結(jié)果顯示，序貫組與非序貫組兩組間的臨床妊娠率以及胚胎種植率均無顯著性差異(P>0.05)，提示序貫移植可能并不適用于所有的RIF人群。因此，本研究進一步將研究人群按照年齡段進行分層分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在年齡≤40歲的RIF患者中，序貫移植并沒有顯著改善RIF患者的臨床結(jié)局。但對年齡超過40歲的RIF患者，與非序貫組相比，序貫移植能夠顯著提高臨床妊娠率和胚胎種植率(P<0.05)；與對照組相比，序貫組的臨床妊娠率與種植率有升高的趨勢，且流產(chǎn)率有下降的趨勢(P>0.05)。其可能的原因是由于序貫移植能夠促進母胎對話，促進子宮內(nèi)膜的同步化發(fā)展，更有利于胚胎種植。有文獻報道，序貫移植不僅可以促進子宮內(nèi)膜與胚胎的同步性，還能改善子宮內(nèi)膜的容受性，從而提高胚胎種植率，改善臨床結(jié)局[16-17]。但由于本研究隨訪時間有限，部分患者尚未到活產(chǎn)時間，故未能對各組患者的活產(chǎn)率進行比較，研究數(shù)據(jù)不夠全面，后續(xù)研究中應(yīng)該盡量完善。

綜上所述，序貫移植對于>40歲的高齡RIF患者來說是一種有效的移植策略，其不僅可以改善子宮內(nèi)膜與胚胎種植的同步性，還能在一定程度上改善子宮內(nèi)膜容受性，繼而改善妊娠結(jié)局；但該結(jié)論還需要以后大樣本的臨床研究加以驗證。