欒康，姜宏，汪存利，殷慧群，朱杰，曹振毅，吳燕

(中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第901醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，合肥 230031)

胚胎在種植前經(jīng)歷了受精、細(xì)胞分裂、融合、細(xì)胞分化及囊腔擴(kuò)張等過程，人類早期胚胎發(fā)育過程中的卵裂球融合(致密化)一般發(fā)生于受精后第4天(D4)，D3出現(xiàn)致密化表明其發(fā)育進(jìn)程較快，是胚胎發(fā)育過程中的非典型現(xiàn)象，僅有少量報(bào)道[1-2]。本文通過回顧性分析同一取卵周期中D3致密化胚與優(yōu)質(zhì)卵裂胚的囊胚形成率及臨床結(jié)局，旨在進(jìn)一步探討D3致密化胚的發(fā)育及種植潛能。

資料與方法

一、研究對(duì)象

回顧性分析2014年1月至2021年5月在解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第901醫(yī)院生殖中心行IVF/ICSI助孕的547個(gè)取卵周期及其331個(gè)移植周期患者的臨床資料。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)女方年齡<40 歲；(2)D3有致密化胚胎形成。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者染色體異常；(2)中、重度子宮內(nèi)膜異位癥，子宮肌瘤；(3)卵巢功能不全；(4)先天性子宮畸形。

根據(jù)D3移植胚胎形態(tài)分為致密化胚(包括新鮮及凍融胚胎移植周期)移植組(n=26)和優(yōu)質(zhì)卵裂胚(包括新鮮及凍融胚胎移植周期)移植組(n=105)，比較兩組的臨床結(jié)局，并采用二元Logistic回歸分析早期流產(chǎn)率的影響因素；根據(jù)囊胚移植周期中D3胚胎來源，分為致密化胚來源組(n=67)和優(yōu)質(zhì)卵裂胚來源組(n=133)，比較D3致密化胚組與優(yōu)質(zhì)卵裂胚組的囊胚形成率及各組的臨床結(jié)局。

二、研究方法

1.控制性促排卵及體外受精/胚胎培養(yǎng)：采用本中心常規(guī)使用的拮抗劑或長(zhǎng)方案促排卵[3]，注射HCG后36～38 h經(jīng)陰道超聲取卵，行常規(guī)IVF或卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)受精，18～20 h觀察原核，G1-plus(Vitrolife，瑞典)培養(yǎng)至D3。

根據(jù)細(xì)胞數(shù)和碎片率評(píng)定胚胎質(zhì)量，分為Ⅰ級(jí)(細(xì)胞大小均勻，碎片率<5%)、Ⅱ級(jí)(細(xì)胞大小均勻，碎片率5%～20%)、Ⅲ級(jí)(細(xì)胞大小不均，碎片率為 21%～50%)和Ⅳ級(jí)(細(xì)胞大小嚴(yán)重不均，碎片率>50%)。D3胚胎細(xì)胞數(shù)7～10的Ⅰ級(jí)和Ⅱ級(jí)胚胎(7/Ⅰ～10/Ⅱ)定義為優(yōu)質(zhì)卵裂胚；卵裂球間隙因致密化(形似融合)而界限不清晰，數(shù)目難以判斷的Ⅰ～Ⅱ級(jí)胚胎定義為致密化胚。將細(xì)胞數(shù)≥4的Ⅲ級(jí)以上胚胎轉(zhuǎn)移至G2-plus(Vitrolife，瑞典)中繼續(xù)培養(yǎng)至第5～6天，并評(píng)定囊胚質(zhì)量[4]，≥2期囊胚納入囊胚數(shù)計(jì)算，D5囊胚≥3期、D6囊胚≥4期且內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層評(píng)分不含C級(jí)囊胚視為優(yōu)質(zhì)囊胚，其余為可利用囊胚。

2.胚胎移植及臨床妊娠判定：無新鮮周期移植禁忌證的患者，經(jīng)醫(yī)生與患者協(xié)商選擇移植D3致密化胚或優(yōu)質(zhì)卵裂胚，或D5移植優(yōu)質(zhì)囊胚或可利用囊胚。對(duì)不宜行新鮮周期移植的患者(高OHSS風(fēng)險(xiǎn)、扳機(jī)日孕酮水平>4.77 nmol/L、內(nèi)膜厚度<7 mm、輸卵管積水或?qū)m腔積液)，D3玻璃化冷凍1或2枚優(yōu)質(zhì)卵裂胚或致密化胚，剩余胚胎行囊胚培養(yǎng)，D5或D6玻璃化冷凍優(yōu)質(zhì)及可利用囊胚(激光輔助皺縮后)。解凍周期采用自然周期或激素替代準(zhǔn)備子宮內(nèi)膜。按照玻璃化解凍程序解凍胚胎，培養(yǎng)2 h后觀察卵裂胚細(xì)胞數(shù)及囊胚囊腔恢復(fù)情況，選擇D3存活致密化胚或卵裂胚及囊腔恢復(fù)30%以上囊胚移植。

移植35 d后行B超監(jiān)測(cè)，見孕囊及胎心搏動(dòng)者判定為臨床妊娠，孕12周內(nèi)自然流產(chǎn)定義為早期流產(chǎn)，妊娠至12周及以上定義為持續(xù)妊娠。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。本研究計(jì)量資料經(jīng)Shaqiro-Wilk檢驗(yàn)提示均不符合正態(tài)分布，故采用中位數(shù)(第25百分位，第75百分位)[M(P25，P75)]表示，組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用百分率(%)表示，采用χ2檢驗(yàn)或連續(xù)校正性χ2檢驗(yàn)；多因素影響采用二元Logistic回歸分析。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、D3致密化胚和優(yōu)質(zhì)卵裂胚的囊胚形成率及優(yōu)質(zhì)囊胚形成率比較

D3致密化胚與優(yōu)質(zhì)卵裂胚的囊胚形成率[69.57%(608/874) vs. 67.14%(1 661/2 474)]及優(yōu)質(zhì)囊胚形成率[36.16%(316/874) vs. 33.83%(837/2 474)]比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

二、D3致密化胚組和優(yōu)質(zhì)卵裂胚組一般資料及臨床結(jié)局比較

根據(jù)D3移植胚胎形態(tài)分為致密化胚(包括新鮮及凍融胚胎移植周期)移植組(n=26)和優(yōu)質(zhì)卵裂胚(包括新鮮及凍融胚胎移植周期)移植組(n=105)。

1.基礎(chǔ)資料：兩組患者間年齡、不孕年限、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、基礎(chǔ)性激素水平(FSH、LH、E2)、Gn用量、促排卵方案比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表1)。

表1 致密化胚組和優(yōu)質(zhì)卵裂胚組患者基礎(chǔ)資料比較[M(P25，P75)，%]

2.胚胎移植及妊娠結(jié)局：兩組間新鮮移植周期占比、移植日內(nèi)膜厚度、移植胚胎數(shù)、臨床妊娠率、胚胎種植率、持續(xù)妊娠率比較，均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，但致密化胚組早期流產(chǎn)率顯著高于優(yōu)質(zhì)卵裂胚組(P<0.05)(表2)。

表2 致密化胚組和優(yōu)質(zhì)卵裂胚組胚胎移植及妊娠結(jié)局比較[M(P25，P75)，%]

三、不同胚胎來源囊胚移植患者一般資料及臨床結(jié)局比較

根據(jù)囊胚移植周期中D3胚胎來源，分為致密化胚來源組(n=67)和優(yōu)質(zhì)卵裂胚來源組(n=133)。

1.基礎(chǔ)資料：兩組間患者年齡、不孕年限、BMI、基礎(chǔ)性激素水平(FSH、LH、E2)、Gn用量、促排卵方案比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表3)。

表3 不同胚胎來源囊胚移植患者基礎(chǔ)資料比較[M(P25，P75)，%]

2.胚胎移植及妊娠結(jié)局：兩組間新鮮移植周期占比、優(yōu)質(zhì)囊胚占比、移植日內(nèi)膜厚度、臨床妊娠率、胚胎種植率、持續(xù)妊娠率比較，均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，但致密化胚來源組移植胚胎數(shù)顯著低于優(yōu)質(zhì)卵裂胚來源組(P<0.001)(表4)。

表4 不同胚胎來源囊胚移植患者胚胎移植及妊娠結(jié)局比較[M(P25，P75)，%]

四、D3致密化胚組和優(yōu)質(zhì)卵裂胚組早期流產(chǎn)率二元Logistic回歸分析

采用二元Logistic回歸分析驗(yàn)證D3致密化胚組和優(yōu)質(zhì)卵裂胚組早期流產(chǎn)率的影響因素。結(jié)果顯示，移植胚胎數(shù)﹑年齡﹑不孕年限﹑BMI﹑基礎(chǔ)FSH﹑基礎(chǔ)LH﹑基礎(chǔ)E2﹑內(nèi)膜厚度及促排卵方案對(duì)早期流產(chǎn)率均無顯著影響(P>0.05)，而移植胚胎質(zhì)量(優(yōu)質(zhì)卵裂胚或致密化胚)是早期流產(chǎn)率的影響因素(P<0.05)(表5)。

表5 D3致密化胚組和優(yōu)質(zhì)卵裂胚組早期流產(chǎn)率二元Logistic回歸分析

討 論

胚胎卵裂球致密化起始于8細(xì)胞階段，形成于受精后第4天。此后外層細(xì)胞分化為滋養(yǎng)層細(xì)胞參與胚胎著床，內(nèi)層細(xì)胞分化為內(nèi)細(xì)胞團(tuán)發(fā)育為胎兒。因此，致密化胚連接卵裂胚與囊胚兩個(gè)重要胚胎發(fā)育階段，對(duì)胚胎發(fā)育及著床起重要作用。胚胎質(zhì)量受患者年齡、促排方案及實(shí)驗(yàn)室操作等多種因素影響，D3發(fā)生胚胎致密化是一種非典型現(xiàn)象，具體機(jī)制尚不明確。培養(yǎng)液為胚胎提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)并維持其發(fā)育的微環(huán)境。van Langendonckt 等[5]的研究顯示，不同種類的序貫培養(yǎng)液D3致密化胚占比存在明顯差異，G1.2培養(yǎng)液D3致密化胚占比高于Sydney IVF培養(yǎng)液(9.5% vs. 4.8%)。Fawzy等[6]的研究發(fā)現(xiàn)，單一培養(yǎng)液Global/HAS中添加50 ng/ml胰島素后，D3致密化胚胎占比顯著高于未添加組(49% vs. 19%)。同時(shí)，國(guó)內(nèi)也有研究顯示，單一培養(yǎng)液D3致密化胚占比為10%～15%[7]。上述研究表明，胚胎培養(yǎng)體系能夠影響D3致密化胚的占比。另有研究表明，胚胎致密化受多種細(xì)胞信號(hào)通路調(diào)控，相關(guān)通路過早激活可使卵裂球間融合提前[8-9]。因此，推測(cè)D3致密化胚的形成可能與胚胎培養(yǎng)體系導(dǎo)致相關(guān)細(xì)胞通路提前激活有關(guān)。

關(guān)于D3致密化胚臨床結(jié)局的相關(guān)文獻(xiàn)較少且結(jié)論并不一致。有研究表明移植1枚D3致密化胚臨床妊娠率顯著高于移植1枚優(yōu)質(zhì)卵裂胚(50% vs. 30%，P<0.05)[2]，而劉秀鳳等[1]則認(rèn)為新鮮周期移植1枚D3致密化胚胎與移植1 枚優(yōu)質(zhì)卵裂胚的臨床妊娠率并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。人類卵裂胚約一半以上為非整倍體，而D4桑椹胚具有自我糾正機(jī)制，部分包含非整倍體卵裂球的胚胎可形成整倍體囊胚[10-11]。胚胎致密化一般起始于8細(xì)胞階段，但有研究發(fā)現(xiàn)，部分胚胎在8細(xì)胞之前即開始致密化，而幾乎所有提前致密化的胚胎至少有一個(gè)卵裂球出現(xiàn)多核[12]，而多核的出現(xiàn)常與胚胎非整倍體﹑低發(fā)育及種植潛能差相關(guān)[13]。另有研究表明，發(fā)育過快或過慢的胚胎非整倍體率均明顯增高[14]。因此，胚胎過早發(fā)生致密化，胚胎糾錯(cuò)機(jī)制未被激活，可能導(dǎo)致D3致密化胚非整倍體率增高。本研究結(jié)果顯示，D3致密化胚與優(yōu)質(zhì)卵裂胚的囊胚形成率及優(yōu)質(zhì)囊胚形成率、臨床妊娠率、胚胎種植率、持續(xù)妊娠率均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但致密化胚組早期流產(chǎn)率顯著高于優(yōu)質(zhì)卵裂胚組，可能與D3致密化胚非整倍體率較高有關(guān)。進(jìn)一步二元Logistic回歸分析也證實(shí)，早期流產(chǎn)率與D3移植胚胎質(zhì)量有關(guān)，表明移植D3致密化胚有較高的流產(chǎn)率。

囊胚培養(yǎng)是胚胎的篩選過程，發(fā)育潛能較差或染色體異常的胚胎常不能形成囊胚而被淘汰。同時(shí)，由于胚胎具有自我糾錯(cuò)機(jī)制，囊胚培養(yǎng)過程中部分染色體異常胚胎也可能形成整倍體囊胚[15]。此外，囊胚移植在生理上更接近胚胎自然著床時(shí)間，子宮內(nèi)膜與胚胎發(fā)育的同步性更佳，其臨床結(jié)局明顯優(yōu)于卵裂胚移植[16]。有研究顯示，D3低質(zhì)量胚胎與優(yōu)質(zhì)胚胎來源的囊胚其種植率、妊娠率及活產(chǎn)率并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，囊胚移植臨床結(jié)局與 D2或D3 胚胎質(zhì)量無相關(guān)性[17-18]。Egashira等[19]的研究結(jié)果顯示，凍融胚胎移植周期中移植多核胚胎與正常胚胎來源的囊胚臨床妊娠率并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(59.1% vs. 52.8%)。本研究結(jié)果也顯示，移植D3致密化胚與優(yōu)質(zhì)卵裂胚來源的囊胚其臨床妊娠率、種植率、早期流產(chǎn)率、持續(xù)妊娠率均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明不同形態(tài)及質(zhì)量的卵裂胚發(fā)育到囊胚階段均可獲得相似的臨床結(jié)局，囊胚質(zhì)量可作為選擇胚胎的首選標(biāo)準(zhǔn)。

綜上所述，D3致密化胚早期流產(chǎn)率顯著高于優(yōu)質(zhì)卵裂胚，而發(fā)育至囊胚后與優(yōu)質(zhì)卵裂胚來源的囊胚妊娠結(jié)局相似。因此，D3胚胎移植時(shí)應(yīng)優(yōu)先選擇優(yōu)質(zhì)卵裂胚，而致密化胚應(yīng)行囊胚培養(yǎng)后移植。本研究的樣本量較少，研究結(jié)果有待大樣本RCT研究進(jìn)一步驗(yàn)證。