姜雪，李夢(mèng)縈，林芳旭，石瓊瑤，劉宇，郭藝紅

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心 河南省生殖與遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450052)

卵巢儲(chǔ)備功能是指卵泡生長(zhǎng)、發(fā)育并形成可受精的卵母細(xì)胞的能力，包括卵巢內(nèi)卵母細(xì)胞的質(zhì)量和數(shù)量，常被用來(lái)評(píng)估女性生育能力[1]。影響卵巢儲(chǔ)備功能的因素包括年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)[2]、遺傳因素、免疫因素、醫(yī)源性因素、環(huán)境污染以及心理因素等。當(dāng)各種因素導(dǎo)致卵巢內(nèi)卵母細(xì)胞數(shù)量減少和(或)質(zhì)量下降，生育能力下降甚至不孕，稱為卵巢儲(chǔ)備功能下降(decreased ovarian reserve，DOR)。DOR發(fā)病率逐年上升，而且在接受輔助生殖技術(shù)(ART)助孕治療中具有卵巢低反應(yīng)、獲卵數(shù)少、卵母細(xì)胞質(zhì)量差等特點(diǎn)常導(dǎo)致助孕結(jié)局不理想[3-4]。

目前，對(duì)DOR定義尚未形成共識(shí)，臨床上多以年齡、抗苗勒管激素(AMH)、月經(jīng)周期第2～3天基礎(chǔ)FSH(bFSH)和基礎(chǔ)竇卵泡計(jì)數(shù)(AFC)聯(lián)合評(píng)估卵巢儲(chǔ)備功能[5]。作為評(píng)估卵巢儲(chǔ)備功能的重要指標(biāo)，AMH、FSH、AFC也常被用來(lái)研究與ART生殖結(jié)局的相關(guān)性[6-7]，也包括宮腔內(nèi)人工授精(IUI)[8]。年齡是影響卵巢儲(chǔ)備功能的重要因素，一般認(rèn)為35歲是卵泡數(shù)量消耗的拐點(diǎn)，>35歲女性的卵母細(xì)胞數(shù)量減少速度加快，卵巢儲(chǔ)備功能急劇下降[9]。鑒于DOR可發(fā)生于任何年齡段的育齡期女性，本研究擬在不同年齡段中探討卵巢儲(chǔ)備功能對(duì)夫精宮腔內(nèi)人工授精(AIH)妊娠結(jié)局的影響。

資料與方法

一、研究對(duì)象

回顧性分析2016年1月至2019年6月于我院生殖醫(yī)學(xué)中心行AIH助孕7 431個(gè)周期患者的臨床資料，數(shù)據(jù)來(lái)源于鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心臨床生殖醫(yī)學(xué)管理系統(tǒng)/電子病歷數(shù)據(jù)庫(kù)(CCRM/EMRCD)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)子宮輸卵管造影或?qū)m腔鏡檢查顯示患者雙側(cè)輸卵管通暢；(2)男方精液滿足《人類輔助生殖技術(shù)規(guī)范》[10]中制定的AIH適應(yīng)證。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)染色體異常；(2)子宮內(nèi)膜異位癥、宮腔粘連、生殖系統(tǒng)解剖異?；颊撸?3)高泌乳素血癥、甲狀腺功能減退或亢進(jìn)、垂體或甲狀腺腫瘤等內(nèi)分泌疾??；(4)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)等不良孕產(chǎn)史；(5)失訪或核心數(shù)據(jù)(如年齡、AHM等)缺失。

共納入7 431個(gè)周期。根據(jù)血清bFSH和AMH水平分為兩組：FSH≤10 U/L和(或)AMH≥1.0 ng/ml患者為卵巢儲(chǔ)備功能正常(NOR)組(n=6 532)，F(xiàn)SH>10 U/L和(或)AMH<1.0 ng/ml患者[11]為DOR組(n=899)。

二、研究方法

1.治療方案：根據(jù)患者月經(jīng)周期是否規(guī)律以及排卵功能決定治療方案。月經(jīng)規(guī)律且能正常排卵的患者，采用自然周期IUI。于月經(jīng)周期第7～9天采用陰道超聲診斷儀(陰道探頭頻率為5.0 MHz)連續(xù)監(jiān)測(cè)卵泡發(fā)育情況和子宮內(nèi)膜發(fā)育情況。對(duì)于有排卵障礙、月經(jīng)周期不規(guī)律的患者采用人工周期IUI。采用枸櫞氯米芬(高特制藥，塞浦路斯) 、來(lái)曲唑(江蘇恒瑞) 、促性腺激素(Gn)或者聯(lián)合使用誘導(dǎo)排卵，具體劑量根據(jù)患者的個(gè)體差異決定，月經(jīng)周期第10～12天開始通過(guò)陰道超聲連續(xù)監(jiān)測(cè)卵泡發(fā)育情況和子宮內(nèi)膜發(fā)育情況，根據(jù)卵泡監(jiān)測(cè)結(jié)果調(diào)整來(lái)曲唑或Gn用量。

2.精液處理：根據(jù)世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)第五版的標(biāo)準(zhǔn)[10]進(jìn)行精液標(biāo)本采集及分析。男方在禁欲3～7 d后，采用手淫法采集精液，置于37 ℃、二氧化碳培育箱里液化后用密度梯度離心法處理精液，制備0.5～1.0 ml 精液用于AIH。

3.夫精宮腔內(nèi)人工授精(AIH)及黃體支持：患者排空膀胱后，取膀胱截石位，行外陰常規(guī)清洗和消毒后鋪無(wú)菌巾，用棉球和生理鹽水擦凈宮頸，置陰道窺器，暴露宮頸，用一次性注射器將0.5～1.0 ml精子混懸液體通過(guò)一次性人工授精管緩緩注入宮腔，精液推注完畢后導(dǎo)管停留2～3 min后退出。術(shù)后囑患者適當(dāng)抬高臀部，仰臥休息30 min后自行離開。優(yōu)勢(shì)卵泡直徑達(dá)16 mm后自發(fā)排卵者當(dāng)日立即行AIH。優(yōu)勢(shì)卵泡直徑達(dá)到18～20 mm或監(jiān)測(cè)到尿黃體生成素(LH)>45 U/L 時(shí)，肌肉注射HCG(珠海麗珠)5 000～10 000 U，24～36 h后行AIH，48 h后陰道超聲檢查監(jiān)測(cè)排卵情況，如還未排卵，根據(jù)監(jiān)測(cè)排卵情況補(bǔ)做1次。排卵后當(dāng)日開始給予肌肉注射黃體酮(浙江仙琚)20～40 mg/d進(jìn)行黃體支持，連續(xù)用藥15 d。妊娠后繼續(xù)使用至術(shù)后8周逐漸減量停藥，若排卵前雌激素水平較低或子宮內(nèi)膜厚度<8 mm，則于黃體酮進(jìn)行黃體支持時(shí)同時(shí)應(yīng)用補(bǔ)佳樂(lè)(拜耳，德國(guó))1～2 mg/d。

4.妊娠診斷及隨訪：人工授精后第16天測(cè)血HCG，當(dāng)血HCG>5 U/L時(shí)為HCG陽(yáng)性，人工授精后第35天B超發(fā)現(xiàn)孕囊和原始心管搏動(dòng)確診為臨床妊娠；臨床妊娠包括宮內(nèi)妊娠和異位妊娠，宮腔內(nèi)未探及孕囊而附件區(qū)探及孕囊或包塊回聲為異位妊娠；活產(chǎn)指至少有1個(gè)妊娠28周后出生的存活嬰兒；流產(chǎn)指妊娠不足28周、胎兒體重不足1 000 g而終止妊娠。所有妊娠患者均隨訪至分娩。

5.觀察指標(biāo)：主要觀察指標(biāo)為臨床妊娠率，次要指標(biāo)為異位妊娠率、活產(chǎn)率和流產(chǎn)率。臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/AIH周期數(shù)×100%，異位妊娠率=異位妊娠周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%，活產(chǎn)數(shù)=活產(chǎn)周期數(shù)/AIH周期數(shù)×100%，流產(chǎn)率=流產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料用頻數(shù)(率)[n(%)]表示，組間比較采用卡方(χ2)檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的計(jì)量資料用中位數(shù)和四分位間距[M(P25，P75)]表示，組間比較采用The Mann-Whitney U 檢驗(yàn)；采用二元Logistic回歸分析不同年齡段卵巢儲(chǔ)備功能對(duì)AIH妊娠結(jié)局的影響，計(jì)算比值比(OR)、調(diào)整后比值比(aOR)及95%CI。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、患者一般資料比較

年齡是影響卵巢儲(chǔ)備功能的重要因素，一般認(rèn)為35歲是卵泡數(shù)量消耗的拐點(diǎn)，因此，根據(jù)年齡分為<35歲組(n=6 129)和≥35歲組(n=1 302)。

1.<35歲年齡段：DOR組(n=482)與NOR組(n=5 647)比較，DOR組男女雙方年齡、血bFSH水平和自然周期占比均顯著高于NOR組(P<0.05)，而BMI、血bLH水平、AMH、AFC、人工周期占比均顯著低于NOR組(P<0.05)(表1)。

表1 <35歲不同卵巢儲(chǔ)備功能組患者基本情況比較[M(P25，P75)，n(%)]

2.≥35歲年齡段：DOR組(n=417)與NOR組(n=885)比較，DOR組男女雙方年齡、血bFSH水平和既往妊娠次數(shù)均顯著高于NOR組(P<0.05)，而不孕年限、血AMH水平和AFC均顯著低于NOR組(P<0.05)，兩組間BMI、既往自然流產(chǎn)次數(shù)和治療方案占比均無(wú)顯著差異(P>0.05)(表2)。

表2 ≥35歲不同卵巢儲(chǔ)備功能組患者基本情況比較[M(P25，P75)，n(%)]

二、不同卵巢儲(chǔ)備功能患者AIH助孕結(jié)局的年齡分層分析

在<35歲年齡段中，DOR組的臨床妊娠率(10.2% vs. 16.5%)、流產(chǎn)率(0.0% vs. 13.4%)和活產(chǎn)率(10.2% vs. 13.9%)均顯著低于NOR組(P<0.05)，而兩組間異位妊娠率比較無(wú)顯著差異(P>0.05)，其中NOR組929例臨床妊娠中出現(xiàn)1例孕晚期死胎引產(chǎn)；在≥35歲年齡段中，兩組間臨床妊娠率、異位妊娠率和活產(chǎn)率比較均無(wú)顯著差異(P>0.05)，而DOR組的流產(chǎn)率(0.0% vs. 30.8%)顯著低于NOR組(P<0.05)(表3)。

表3 不同卵巢儲(chǔ)備功能組患者AIH妊娠結(jié)局的年齡分層分析(%)

僅以年齡組比較，與<35歲組相比，≥35歲組的臨床妊娠率(16.0% vs. 9.4%)及活產(chǎn)率(13.6% vs. 7.1%)顯著降低，而流產(chǎn)率(12.7% vs. 23.0%)顯著升高(P<0.05)(表3)。

三、不同年齡段患者臨床妊娠率和活產(chǎn)率的Logistic回歸分析

Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，在<35歲年齡段中，在矯正混雜因素如男女雙方年齡、女性BMI、不孕年限、治療方案前，DOR患者的臨床妊娠率[OR=0.58，95%CI(0.42，0.78)，P<0.001]、活產(chǎn)率[OR=0.70，95%CI(0.52，0.96)，P=0.024]均顯著低于NOR患者(P<0.05)；在矯正各種混雜因素后，DOR患者的臨床妊娠率顯著低于NOR患者[aOR=0.68，95%CI(0.50，0.94)，P=0.019]，而兩組間活產(chǎn)率比較無(wú)顯著差異(P>0.05)(表4)。

表4 <35歲患者臨床妊娠率和活產(chǎn)率的Logistic回歸分析

Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，在≥35歲年齡段中，在矯正混雜因素前、后，DOR患者與NOR患者間臨床妊娠率和活產(chǎn)率比較均無(wú)顯著差異(P>0.05)(表5)。

表5 ≥35歲患者臨床妊娠率和活產(chǎn)率的Logistic回歸分析

討 論

近年來(lái)，社會(huì)壓力的增加、生育年齡的推遲、環(huán)境的惡化等多種因素威脅著女性生殖健康，導(dǎo)致女性卵巢儲(chǔ)備功能下降、生育困難甚至不孕。ART的快速發(fā)展為DOR不孕患者帶來(lái)了生育的希望。輔助生殖方法的選擇至關(guān)重要，其中AIH方法簡(jiǎn)單便捷、創(chuàng)傷性小，在臨床上廣泛應(yīng)用，但因其受多種因素影響，目前臨床妊娠率仍較低[12]。本研究通過(guò)探討卵巢儲(chǔ)備功能對(duì)AIH妊娠結(jié)局的影響，為DOR患者選擇合適的助孕方案提供參考。

女性生育能力從30歲開始下降，35歲之后卵巢儲(chǔ)備功能急劇下降，美國(guó)婦產(chǎn)科醫(yī)師學(xué)會(huì)及美國(guó)生殖醫(yī)學(xué)會(huì)建議年齡>35歲的女性應(yīng)該在超過(guò)6個(gè)月自然受孕失敗的情況下盡快進(jìn)行生育力評(píng)估并接受治療[13]。高齡女性在控制性促排卵(COH)過(guò)程中卵巢反應(yīng)較差，相較于青年女性表現(xiàn)為低妊娠率、高妊娠丟失率、高妊娠并發(fā)癥發(fā)生率等不理想的妊娠結(jié)局[14]。本研究結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)，≥35歲時(shí)患者在接受AIH助孕后臨床妊娠率及活產(chǎn)率顯著低于<35歲患者，而流產(chǎn)率顯著增高(P<0.05)。然而，女性的實(shí)際年齡與卵巢狀態(tài)并不相符，臨床存在一些即使年齡較大但卵巢儲(chǔ)備功能依然良好的女性，而青年女性也可發(fā)生DOR。Zhang等[15]研究發(fā)現(xiàn)，低AMH水平的年輕女性行IVF-ET后的妊娠結(jié)局顯著優(yōu)于高AMH水平的高齡女性。隨著女性年齡的增長(zhǎng)，卵巢內(nèi)原始卵泡池不斷消耗導(dǎo)致卵泡數(shù)量減少，同時(shí)造成內(nèi)分泌環(huán)境紊亂以及損傷，不斷積累導(dǎo)致卵母細(xì)胞質(zhì)量下降，可能是造成高齡女性DOR的主要原因[16]，而青年女性過(guò)早減退的卵巢儲(chǔ)備功能尚無(wú)統(tǒng)一解釋。有研究發(fā)現(xiàn)，<38歲DOR患者行IVF后，雖然活產(chǎn)率顯著降低，但其胚胎形成率、非整倍體率以及整倍體胚胎移植活產(chǎn)率與卵巢儲(chǔ)備功能正常(NOR)患者比較無(wú)顯著差異[17]。相反，另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，在調(diào)整年齡因素后，DOR患者囊胚整倍體率顯著降低，表明卵母細(xì)胞質(zhì)量隨數(shù)量的減少而降低[18]。高齡女性和青年女性發(fā)生DOR的分子機(jī)制不同，對(duì)ART治療后妊娠結(jié)局的影響也不同。因此，在分析卵巢儲(chǔ)備功能對(duì)妊娠結(jié)局的影響時(shí)，應(yīng)考慮年齡對(duì)妊娠結(jié)局的影響。

AMH為肽類生長(zhǎng)因子，屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)超家族的成員之一，主要由竇前卵泡及早期竇狀卵泡的顆粒細(xì)胞分泌，其水平能反映竇卵泡池的大小[19]，且不隨女性月經(jīng)周期發(fā)生變化[20]，能更穩(wěn)定、更敏感地反映卵巢儲(chǔ)備功能程度。國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究按照AMH劃分卵巢儲(chǔ)備功能，分析助孕結(jié)局。Wang等[21]通過(guò)一項(xiàng)橫斷面研究分析了204例接受控制性卵巢刺激治療的AIH患者的妊娠結(jié)局，發(fā)現(xiàn)無(wú)論患者年齡大小，血AMH水平低時(shí)臨床妊娠率也較低。在其他研究中有著類似結(jié)論[22-23]。與之相反，Seckin等[24]一項(xiàng)回顧性研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)論對(duì)于青年患者還是高齡患者，AMH水平都不能預(yù)測(cè)其IUI妊娠結(jié)局。有研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于行AIH助孕的<35歲患者，無(wú)論是自然周期還是人工周期，低AMH水平(<1.0 ng/ml)與高AMH水平(≥1.0 ng/ml)的妊娠結(jié)局相似[8]。雖然AMH是與卵巢儲(chǔ)備功能相關(guān)性最強(qiáng)的標(biāo)志物，其也有一定局限性[25]，并且在預(yù)測(cè)IUI妊娠結(jié)局方面單獨(dú)應(yīng)用AMH的預(yù)測(cè)價(jià)值并不優(yōu)于年齡、AFC、bFSH[23]。實(shí)際上，每種單一指標(biāo)預(yù)測(cè)卵巢功能都有一定局限性，實(shí)際年齡和卵巢生物學(xué)年齡可能不相符，bFSH水平測(cè)定要求在月經(jīng)早期，而基礎(chǔ)AFC易受到操作者主觀因素的影響。在臨床中仍需結(jié)合多個(gè)指標(biāo)來(lái)對(duì)患者的卵巢儲(chǔ)備功能進(jìn)行評(píng)估，進(jìn)而評(píng)估卵巢儲(chǔ)備功能對(duì)ART的影響。

目前，對(duì)DOR的診斷尚無(wú)國(guó)際統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，許多研究應(yīng)用2011年歐洲人類生殖和胚胎學(xué)會(huì)對(duì)卵巢反應(yīng)不良制定的Bologna標(biāo)準(zhǔn)[26]中的卵巢儲(chǔ)備異常試驗(yàn)來(lái)診斷DOR，即AFC<5～7個(gè)或AMH<0.5～1.1 ng/ml。本研究依據(jù)2015年美國(guó)疾病控制和預(yù)防中心診斷DOR的標(biāo)準(zhǔn)，將FSH>10 U/L和(或)AMH<1.0 ng/ml的女性納入DOR組。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無(wú)論患者的年齡大小，DOR組的異位妊娠率與NOR組比較無(wú)顯著差異(P>0.05)。Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，在矯正各種混雜因素后，在<35歲的青年女性中，DOR組的臨床妊娠率顯著低于NOR組(P<0.05)，而兩組間活產(chǎn)率比較無(wú)顯著差異(P>0.05)；對(duì)于≥35歲的高齡女性，卵巢儲(chǔ)備功能對(duì)臨床妊娠率、活產(chǎn)率無(wú)顯著影響(P>0.05)。一項(xiàng)回顧性研究發(fā)現(xiàn)，DOR是行IVF-ET后發(fā)生異位妊娠的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[27]；另一項(xiàng)以AMH<1.0 ng/ml和(或)FSH>10 U/L為DOR診斷標(biāo)準(zhǔn)的研究也得出同樣結(jié)論[28]。Tiegs等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在IUI周期中，DOR組與NOR組的異位妊娠率及臨床流產(chǎn)率無(wú)顯著差異。但本研究發(fā)現(xiàn)，NOR患者的流產(chǎn)率顯著高于DOR患者(P<0.05)，可能是由于DOR組周期數(shù)相對(duì)過(guò)少且臨床妊娠率低導(dǎo)致次要觀察指標(biāo)例數(shù)更少，DOR組甚至無(wú)流產(chǎn)周期。

本研究首先通過(guò)年齡分層進(jìn)行亞組分析，充分排除年齡對(duì)卵巢儲(chǔ)備功能以及妊娠結(jié)局的影響，并進(jìn)一步矯正了男女雙方年齡、女方BMI、治療方案等可能影響妊娠結(jié)局的多種因素，使結(jié)果更具說(shuō)服力。由于本研究為回顧性分析，其固有偏倚可能影響研究結(jié)果；其次受到納入研究數(shù)量的限制，DOR組的周期數(shù)較少，卵巢儲(chǔ)備功能對(duì)流產(chǎn)、異位妊娠等不良妊娠結(jié)局的影響尚不能形成明確結(jié)論，還需后期進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量研究；最后，本研究缺少一些男方資料如BMI、精液分析數(shù)據(jù)，今后補(bǔ)全這方面資料可能會(huì)使我們的研究更加完善。

綜上所述，我們的研究結(jié)果提示，在AIH周期中，<35歲DOR患者的臨床妊娠率較低，對(duì)于這類人群應(yīng)根據(jù)患者具體情況盡快計(jì)劃妊娠，避免發(fā)展為早發(fā)性卵巢功能不全等疾??；對(duì)于≥35歲DOR患者，卵巢儲(chǔ)備功能對(duì)AIH臨床妊娠率無(wú)顯著影響，但無(wú)論卵巢儲(chǔ)備功能如何，均表現(xiàn)為低臨床妊娠率，應(yīng)盡早進(jìn)行快速生育力評(píng)估并接受個(gè)體化助孕治療。