陳穎，柯雪，滕文頂，張攀

(電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦女兒童醫(yī)院 成都市婦女兒童中心醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，成都 610091)

凍融胚胎移植(frozen-thawed embryo transfer，F(xiàn)ET)作為體外受精-胚胎移植(IVF-ET)的衍生技術(shù)，降低了卵巢過(guò)度刺激綜合征、多胎妊娠的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)避免了胚胎的浪費(fèi)。近些年FET技術(shù)發(fā)展迅速，目前我國(guó)FET周期數(shù)已遠(yuǎn)超鮮胚移植周期數(shù)[1-2]，因此如何優(yōu)化FET流程尤為重要。目前對(duì)于卵裂期胚胎解凍后的培養(yǎng)時(shí)間尚無(wú)定論，有的生殖中心常規(guī)操作為培養(yǎng)2 h后移植[3]，有的中心則培養(yǎng)18～20 h后進(jìn)行移植[4-7]。尤其針對(duì)不同質(zhì)量卵裂期胚胎的相關(guān)研究，更是缺乏大樣本數(shù)據(jù)分析。因此，本研究回顧性分析了我中心行卵裂期胚胎凍融移植的492個(gè)周期，探討不同質(zhì)量卵裂期胚胎解凍后培養(yǎng)時(shí)間與妊娠結(jié)局的關(guān)系。

資料與方法

一、研究對(duì)象及分組

回顧性分析我中心2019年1月至2020年12月行第3天(D3)胚胎凍融移植的病例資料。

納入標(biāo)準(zhǔn)：女方年齡<35歲；采用標(biāo)準(zhǔn)長(zhǎng)方案進(jìn)行控制性卵巢刺激，行IVF或ICSI授精。

排除標(biāo)準(zhǔn)：反復(fù)種植失??；復(fù)發(fā)性流產(chǎn)；子宮異常，如子宮腺肌病、薄型子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜息肉、宮腔粘連、宮腔積液等。

共納入492個(gè)周期，根據(jù)解凍前胚胎評(píng)級(jí)分為A組(有優(yōu)胚組，n=221)和B組(無(wú)優(yōu)胚組，n=271)；兩組再根據(jù)胚胎解凍后距離移植的時(shí)間，各分為兩個(gè)亞組，即培養(yǎng)2 h的A1組(n=96)和B1組(n=123)；培養(yǎng)18 h的A2組(n=125)和B2組(n=148)。

二、研究方法

1.內(nèi)膜準(zhǔn)備及解凍時(shí)機(jī)：(1)自然周期方案：有正常排卵的患者，經(jīng)陰道B超監(jiān)測(cè)卵泡發(fā)育，結(jié)合血清雌二醇(E2)、黃體生成素(LH)、孕酮(P)檢測(cè)，于確認(rèn)排卵當(dāng)日起肌肉注射黃體酮注射液(20 mg/支，浙江仙琚)40 mg/d；(2)降調(diào)節(jié)激素替代方案：無(wú)規(guī)律排卵、子宮內(nèi)膜異位癥或者慢性子宮內(nèi)膜炎治療后的患者，于月經(jīng)周期第2～7天內(nèi)注射醋酸亮丙瑞林微球(貝依，3.75 mg/支，上海麗珠)3.75 mg，注射后第15～21天經(jīng)陰道B超復(fù)查及性激素達(dá)到降調(diào)節(jié)標(biāo)準(zhǔn)(E2<183.5 pmol/L、FSH<5 U/L、LH<5 U/L，子宮內(nèi)膜雙層厚度<5 mm)即開(kāi)始口服戊酸雌二醇(補(bǔ)佳樂(lè)，1 mg/粒，拜耳，法國(guó))4～6 mg/d，每5～7 d做一次B超監(jiān)測(cè)，根據(jù)子宮內(nèi)膜厚度決定是否增加戊酸雌二醇用量，至子宮內(nèi)膜雙層厚度≥7 mm，且口服時(shí)間超過(guò)14 d后，加用黃體酮注射液60～80 mg/d肌肉注射。兩種內(nèi)膜準(zhǔn)備方案均于黃體酮注射的第4天安排實(shí)驗(yàn)室解凍胚胎。培養(yǎng)2 h組上午解凍上午移植，培養(yǎng)18 h組下午解凍次日上午移植。

2.卵裂期胚胎評(píng)級(jí)：根據(jù)卵裂球細(xì)胞數(shù)、均一度、碎片比例等進(jìn)行胚胎質(zhì)量評(píng)級(jí)。D3優(yōu)質(zhì)胚胎定義為：來(lái)源于2PN受精卵，D2細(xì)胞數(shù)為4～6個(gè)，D3細(xì)胞數(shù)為7～9個(gè)，碎片比例<20%，細(xì)胞大小基本均勻，透明帶完整，胞質(zhì)均勻清晰，無(wú)顆粒及多核現(xiàn)象。D3可利用胚胎定義為：來(lái)源于2PN、0PN和1PN受精卵，D2細(xì)胞數(shù)≥2個(gè)，D3細(xì)胞數(shù)>4個(gè)，碎片比例<50%，細(xì)胞大小均勻或不均勻。

3.胚胎玻璃化冷凍與解凍：胚胎培養(yǎng)采用序貫式培養(yǎng)基(COOK，澳大利亞)。主要培養(yǎng)基包括受精培養(yǎng)液、卵裂培養(yǎng)液和囊胚培養(yǎng)液，使用前均在37℃、6%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)平衡過(guò)夜。

胚胎玻璃化冷凍：使用試劑為加藤胚胎冷凍試劑(KITAZATO，日本)，室溫下將胚胎從卵裂培養(yǎng)液移入平衡(ES)液，在ES液中平衡7～10 min，當(dāng)卵裂球復(fù)原90%左右，將胚胎移入玻璃化(VS)液，60 s內(nèi)將胚胎裝載至冷凍載桿(KITAZATO，日本)，并置入液氮中保存。

胚胎解凍：選用加藤胚胎解凍試劑(KITAZATO，日本)，將裝有胚胎的載桿置入37℃預(yù)溫的解凍液WS1中，輕晃載桿確認(rèn)胚胎落入解凍液中，在載桿進(jìn)入解凍液1 min后，將胚胎依次轉(zhuǎn)入解凍液WS2、WS3、WS4中，先后停留3 min、5 min、3 min，其中WS2液和WS3液于常溫下進(jìn)行，WS1液和WS4液置于37℃熱臺(tái)進(jìn)行。隨后將胚胎移入過(guò)夜平衡好的含5%人血清白蛋白(HSA)的囊胚培養(yǎng)微滴中，在6% CO2、5% O2、89% N2的三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)等待移植。

激光輔助孵化(LAH)：胚胎移植前1～2 h進(jìn)行LAH操作。使用非接觸式激光破膜系統(tǒng)(MTG，德國(guó))，選擇卵周間隙較大或碎片較多處，將激光靶心對(duì)準(zhǔn)削薄區(qū)透明帶外緣，調(diào)整激光的能量與靶心大小，深度為透明帶厚度的2/3，長(zhǎng)度為透明帶周長(zhǎng)的1/4，而后發(fā)射激光進(jìn)行薄化處理。

4.妊娠判斷及觀察指標(biāo)：移植后14 d測(cè)血β-HCG值；移植后4～6周，彩超檢查見(jiàn)宮內(nèi)或?qū)m外孕囊定義為臨床妊娠，孕囊數(shù)即著床個(gè)數(shù)。

觀察指標(biāo)：臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%；著床率=孕囊數(shù)/移植胚胎數(shù)×100%；活產(chǎn)率=活產(chǎn)的分娩數(shù)/移植周期數(shù)×100%；早期流產(chǎn)率=孕12周內(nèi)自然流產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%；異位妊娠率=異位妊娠周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、患者基本情況比較

本研究共納入492個(gè)D3胚胎FET周期，患者年齡為22～34歲。

根據(jù)解凍前胚胎評(píng)級(jí)分為A組(有優(yōu)胚組，n=221)和B組(無(wú)優(yōu)胚組，n=271)；兩組再根據(jù)胚胎解凍后培養(yǎng)時(shí)間各分為2 h和18 h兩個(gè)亞組，即培養(yǎng)2 h的A1組(n=96)和B1組(n=123)；培養(yǎng)18 h的A2組(n=125)和B2組(n=148)。

有優(yōu)胚組(A組)解凍后不同培養(yǎng)時(shí)間亞組(A1組和A2組)間，以及無(wú)優(yōu)胚組(B組)解凍后不同培養(yǎng)時(shí)間亞組(B1組和B2組)間，患者年齡、不孕年限、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、抗苗勒管激素(AMH)水平、原發(fā)不孕占比、ICSI周期占比、內(nèi)膜準(zhǔn)備方案(自然周期占比)，以及移植日子宮內(nèi)膜厚度、移植胚胎數(shù)、解凍前優(yōu)胚數(shù)比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表1，表2)。

二、患者臨床結(jié)局比較

A1組臨床妊娠率、著床率顯著高于A2組(P<0.05)，A1組活產(chǎn)率高于A2組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，兩組間早期流產(chǎn)率、異位妊娠率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；B1組與B2組間各項(xiàng)觀察指標(biāo)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表3，表4)。

表3 有優(yōu)胚的FET周期妊娠結(jié)局的比較(%)

表4 無(wú)優(yōu)胚的FET周期妊娠結(jié)局的比較(%)

三、Logistic回歸分析

以臨床妊娠為因變量，胚胎培養(yǎng)2 h、年齡、不孕類(lèi)型、不孕年限、BMI、AMH、內(nèi)膜準(zhǔn)備方案、內(nèi)膜厚度、解凍前優(yōu)胚數(shù)、移植胚胎數(shù)、授精方式為協(xié)變量，進(jìn)行Logistic回歸分析。結(jié)果表明，有優(yōu)胚組胚胎解凍后培養(yǎng)時(shí)間是臨床妊娠率的獨(dú)立影響因素[OR=1.972，95%CI(1.090，3.566)，P=0.025](表5)。

表5 Logistic回歸分析

討 論

FET技術(shù)隨著輔助生殖技術(shù)的快速發(fā)展應(yīng)運(yùn)而生。胚胎冷凍保存可以降低卵巢過(guò)度刺激綜合征、多胎妊娠的風(fēng)險(xiǎn)，提高累積妊娠率，為生育力保存及胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(cè)提供技術(shù)支持[8]。1985年以來(lái)，玻璃化冷凍技術(shù)廣泛應(yīng)用于臨床，冷凍胚胎復(fù)蘇率顯著升高，凍融胚胎移植臨床結(jié)局也得到很大改善[9]。影響FET活產(chǎn)率的主要因素包括胚胎質(zhì)量、子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備方案、胚胎移植數(shù)和BMI等[10]。

關(guān)于冷凍胚胎解凍后體外培養(yǎng)時(shí)間對(duì)妊娠結(jié)局的影響爭(zhēng)議不斷。有研究認(rèn)為當(dāng)日解凍移植和過(guò)夜培養(yǎng)后移植，臨床妊娠率、著床率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[11-14]。尹軼莎等[15]發(fā)現(xiàn)自然周期排卵后第3天與第4天移植D3凍融胚胎臨床結(jié)局無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；激素替代周期中孕酮轉(zhuǎn)化內(nèi)膜4 d后移植D3胚胎可以獲得很好的妊娠結(jié)局[16]。然而Guo等[17]則認(rèn)為，解凍后縮短體外培養(yǎng)時(shí)間可以降低培養(yǎng)相關(guān)應(yīng)激，保持胚胎發(fā)育的良好潛力。一項(xiàng)1 326例患者的回顧性分析發(fā)現(xiàn)，過(guò)夜培養(yǎng)可能提高優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎的臨床妊娠率，但降低優(yōu)質(zhì)囊胚的臨床妊娠率[18]。另一項(xiàng)對(duì)1 571例患者優(yōu)質(zhì)囊胚FET的回顧性研究則顯示，D5優(yōu)質(zhì)囊胚解凍后培養(yǎng)2～4 h移植可提高臨床妊娠率、著床率和持續(xù)妊娠率，降低早期流產(chǎn)率[19]。2019年Wang等[3]也提出培養(yǎng)2 h較過(guò)夜培養(yǎng)可以提高D3優(yōu)質(zhì)胚胎的著床率。研究結(jié)論存在相當(dāng)?shù)牟灰恢滦浴?/p>

本研究?jī)H對(duì)卵裂期胚胎展開(kāi)分析。雖然選擇性單囊胚移植可以提高單次移植的妊娠率，降低多胎妊娠及異位妊娠的風(fēng)險(xiǎn)，但對(duì)于D3可利用胚胎較少的患者，囊胚培養(yǎng)可能增加周期取消率，降低累積妊娠率[8]，因此仍有大量患者選擇卵裂期胚胎移植。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外尚缺乏對(duì)不同質(zhì)量卵裂期胚胎FET的大樣本研究。本研究?jī)H納入<35歲的患者，根據(jù)胚胎質(zhì)量進(jìn)行分組。經(jīng)過(guò)分析發(fā)現(xiàn)解凍前有優(yōu)胚的患者，體外培養(yǎng)2 h后移植，著床率更高。Logistic回歸分析顯示，胚胎解凍后培養(yǎng)2 h是該類(lèi)患者臨床妊娠率的獨(dú)立影響因素。說(shuō)明延長(zhǎng)體外培養(yǎng)時(shí)間不能改善D3優(yōu)質(zhì)凍融胚胎移植的妊娠結(jié)局。而非優(yōu)質(zhì)胚胎或許受自身發(fā)育潛能的限制，解凍后體外培養(yǎng)時(shí)間對(duì)妊娠結(jié)局影響不明顯。產(chǎn)生上述結(jié)果的原因，可能與體外環(huán)境影響[20]及母胎界面的相互作用有關(guān)。

體外培養(yǎng)環(huán)境對(duì)胚胎發(fā)育與安全性的影響一直備受關(guān)注。培養(yǎng)液的成分與pH值、O2、CO2、光照、溫濕度、空氣質(zhì)量以及設(shè)備儀器等都可能影響胚胎發(fā)育潛能和安全性[21-22]。同時(shí)，應(yīng)激與對(duì)體外環(huán)境的適應(yīng)會(huì)影響胚胎發(fā)育，引起妊娠丟失[23]。單純體外培養(yǎng)可使小鼠8細(xì)胞期胚胎 DNA雙鏈斷裂損傷增多，DNA損傷相關(guān)基因Casp3、Fas表達(dá)水平上調(diào)，并導(dǎo)致促進(jìn)胚胎發(fā)育和種植的LIF因子表達(dá)水平下調(diào)[24-25]。體外培養(yǎng)還可能影響胚胎對(duì)DNA損傷的修復(fù)能力，并導(dǎo)致某些參與氧化應(yīng)激和脂質(zhì)代謝的基因表達(dá)水平發(fā)生改變[26-27]。所以，體外培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能對(duì)胚胎產(chǎn)生不利的影響。

另外，在胚胎-子宮內(nèi)膜上皮的接觸過(guò)程中，胚胎來(lái)源的溶血磷脂酰膽堿(LPC)受內(nèi)膜上皮自分泌運(yùn)動(dòng)因子(ATX)的催化作用，產(chǎn)生溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid，LPA)。Yu等[28]研究發(fā)現(xiàn)LPA可能是支持胚胎體外發(fā)育的關(guān)鍵物質(zhì)，LPA通過(guò)激活yes相關(guān)蛋白(YAP)，啟動(dòng)了合子基因的轉(zhuǎn)錄，在小鼠胚胎體外培養(yǎng)過(guò)程中加入LPA，可顯著提高胚胎發(fā)育速度，并獲得更高的著床率及活產(chǎn)率。同時(shí)，LPA可以結(jié)合子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞受體(LPA1)，促進(jìn)內(nèi)膜和胎盤(pán)血管生成[29]；還可以通過(guò)激活內(nèi)膜上皮細(xì)胞的受體(LPA3)，促使胚胎周?chē)膬?nèi)膜上皮中肝素結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子(HB-EGF)和環(huán)加氧酶-2(COX-2)等母體因子上調(diào)，誘導(dǎo)蛻膜化，降低內(nèi)源性大麻素(eCBs)的局部濃度，促進(jìn)胚胎著床[30-31]。因此，及時(shí)進(jìn)行胚胎-母體接觸，可能有利于胚胎發(fā)育和改善內(nèi)膜容受性。

綜上所述，對(duì)于有優(yōu)質(zhì)D3胚的患者行FET，胚胎解凍后經(jīng)2 h培養(yǎng)即移植入體內(nèi)，較培養(yǎng)18 h后移植可以獲得更好的妊娠結(jié)局。本研究為回顧性研究且樣本量不足，結(jié)論尚需擴(kuò)大樣本量，通過(guò)進(jìn)一步前瞻性隨機(jī)對(duì)照研究加以證實(shí)。