陳銘奇 黃俊山 曾雪愛 王秀峰 張瑜

(福建省中醫(yī)藥科學(xué)院，福建省中醫(yī)睡眠醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黃俊山福建省名老中醫(yī)藥專家傳承工作室，福州，350003)

隨著對(duì)冬奧冠軍谷愛凌的報(bào)道，10 h睡眠成了大眾關(guān)注的熱點(diǎn)。近年來由于社會(huì)的快速發(fā)展，工作節(jié)奏越來越快，再加上疫情給大眾生活和工作帶來的壓力，越來越多的人正受到睡眠剝奪(Sleep Deprivation，SD)的威脅。睡眠剝奪是指各種原因所致的睡眠減少或睡眠時(shí)間嚴(yán)重不足，主要與睡眠時(shí)間和睡眠類型異常明確相關(guān)，包括完全睡眠剝奪、長期睡眠受限及睡眠片段化[1]。睡眠是人體消除疲勞，維持注意力和認(rèn)知能力的重要途徑[2]。睡眠受多種神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)，包括興奮性神經(jīng)遞質(zhì)如多巴胺(DA)、去甲腎上腺素(NE)、5-羥色胺(5-HT)及抑制性神經(jīng)遞質(zhì)如γ-氨基丁酸(GABA)?，F(xiàn)代研究表明GABA是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的抑制性遞質(zhì)，產(chǎn)生鎮(zhèn)靜催眠作用[3]。朱砂作為傳統(tǒng)中藥有良好的安神定志、清心解毒的功效，使其在中醫(yī)臨床治療失眠的過程中具有不可替代的地位。而對(duì)朱砂毒性的認(rèn)識(shí)經(jīng)歷了《神農(nóng)本草經(jīng)》時(shí)的“無毒”到明清時(shí)代的“有毒”，再到當(dāng)今的“限量”使用。硫化汞是朱砂的主要成分，硫化汞存在β和α 2種晶形，紅色的α型硫化汞微粒粒徑約為6～10 μm，性質(zhì)穩(wěn)定，是朱砂中硫化汞的主要晶形，在體內(nèi)可發(fā)生酸效應(yīng)和絡(luò)合效應(yīng)[4]。目前關(guān)于朱砂鎮(zhèn)靜安神的研究多集中在毒性研究和一次性服藥后的藥時(shí)曲線，對(duì)于朱砂發(fā)揮重鎮(zhèn)安神作用是否通過GABA進(jìn)行調(diào)節(jié)，以及連續(xù)多日服用外周血汞濃度變化方面的研究較少。綜上所述，本研究將對(duì)不同劑量的朱砂對(duì)睡眠剝奪大鼠γ-氨基丁酸(GABA)的調(diào)節(jié)作用以及連續(xù)7 d的治療期內(nèi)外周血汞的代謝曲線進(jìn)行觀察，為臨床更好應(yīng)用朱砂提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 健康雄性(Sprague-Dawley，SD)大鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量(260±20)g，50只，由上海斯萊實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，飼養(yǎng)于福建省中醫(yī)藥科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)室溫度控制在20～25 ℃，濕度在50%～60%，12 h:12 h固定照明節(jié)律，普通維持飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水。大鼠購入后適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后開始實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 藥物 朱砂(亳州市京皖中藥飲片廠，水飛炮制品)，根據(jù)歷版朱砂用量，本項(xiàng)目將朱砂劑量分為3種：0.1 g作為Ⅰ低劑量組的用量，0.5 g作為Ⅱ中劑量組的用量，1.5 g作為Ⅲ高劑量組的用量，大鼠用量為成人6倍(按體質(zhì)量計(jì)算)。

1.1.3 試劑與儀器 大鼠GABA ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物研究所)。大鼠腦立體定位儀(美國Stoelting公司)、BP211D電子天平(德國Sartarius)、超純水系統(tǒng)(美國MilliPoreTGL-16B)、高速臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)、改良多平臺(tái)水環(huán)境睡眠剝奪裝置、MA-3000汞分析儀；酶標(biāo)儀(美國BioTek，800TS)。

1.2 方法

1.2.1 睡眠剝奪大鼠模型復(fù)制 改良多平臺(tái)水環(huán)境法進(jìn)行睡眠剝奪大鼠造模。在直徑80 cm的水箱內(nèi)放高6 cm，直徑3 cm的圓形小平臺(tái)12個(gè)，每個(gè)平臺(tái)間隔15 cm，箱內(nèi)注水后水面低于平臺(tái)1 cm，水箱頂部用鐵絲網(wǎng)蓋住，大鼠可自由進(jìn)食、飲水、活動(dòng)，進(jìn)入睡眠時(shí)由于骨骼肌的松弛會(huì)掉入水中驚醒造成睡眠剝奪。每日換水添食，室溫保持在23～25 ℃，并給予每天24 h擬光照環(huán)境。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和給藥 將睡眠剝奪成功的50只大鼠隨機(jī)分為3組：空白組10只、模型組10只、朱砂高、中、低劑量觀察組各10只。根據(jù)《中華人民共和國藥典》2015年版，本項(xiàng)目將朱砂劑量分為3種：0.1 g作為低劑量觀察組的用量，0.5 g作為中劑量觀察組的用量，1.5 g作為高劑量觀察組的用量，大鼠用量為成人6倍(按體質(zhì)量計(jì)算)。采用隨機(jī)法分3個(gè)劑量組，用散劑混合蒸餾水灌胃。各組均按15 mL/kg體質(zhì)量灌胃，每天09:00灌胃1次，共7天。模型組：10只，用蒸餾水灌胃。

1.2.3 采樣 本實(shí)驗(yàn)采用微透析技術(shù)將透析探針埋入動(dòng)物的腦中，透析探針可除去分子量大于30 000的分子，對(duì)周圍組織損傷很小，取樣量少，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生存率有所保障。雄性SD大鼠以水合氯醛(400 mg/kg)腹腔麻醉，固定在立體定位儀上，將透析套管定位于右側(cè)紋狀體(前囟前0.2 mm，旁開3.5 mm，皮層下5.2 mm)并用小螺釘固定。開啟透析灌流系統(tǒng)，調(diào)節(jié)恒流泵控制液流速30 μL/min，透析探針與人工腦脊液灌流系統(tǒng)直接相接。灌流平衡120 min后，每15 min收集1管，每管30 μL，共收集3管透析液。收集的透析液立即放入-20 ℃冰箱保存。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)及指標(biāo)的觀察

1.2.4.1 給藥前后各組一般狀況 觀察睡眠剝奪7 d后及朱砂治療7 d后各組大鼠的毛色光澤，精神情緒，體質(zhì)量變化等情況。

1.2.4.2 ELISA檢測(cè)腦脊液和血液中GABA含量 給藥結(jié)束后第2天，各組大鼠麻醉后眼眶采血及腦脊液微透析，每只獨(dú)立分裝在凍存管，-20 ℃冰箱貯存待檢。隨后根據(jù)ELISA說明書檢測(cè)GABA含量。

1.2.4.3 EPA7473熱分解齊化原子吸收光度法檢測(cè)連續(xù)7 d血汞含量 給藥開始后第2天起，每天上午09:00對(duì)高、中、低劑量組大鼠進(jìn)行眼眶采血，離心保存在-80 ℃冰箱待檢。然后根據(jù)EPA7473熱分解法進(jìn)行汞原子檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 給藥后各組一般情況 空白組大鼠精神活潑、活動(dòng)規(guī)律；模型組出現(xiàn)明顯失眠特征，表現(xiàn)為白天夜晚活動(dòng)頻繁、睡眠減少、精神疲憊，對(duì)外界聲光刺激異常敏感、情緒易激、攻擊性強(qiáng)，且皮毛失去光澤毛流散亂，體形消瘦、體質(zhì)量明顯減輕。觀察組一般行為狀態(tài)較模型組有所改善，精神較好、活動(dòng)較規(guī)律。與空白組比較，模型組、低劑量觀察組、水觀察組大鼠體質(zhì)量顯著性降低(P<0.01)；與模型組比較，高、中劑量觀察組大鼠體質(zhì)量均有明顯增加(P<0.01)；與水觀察組比較，高、中、低劑量觀察組體質(zhì)量有明顯增加(P<0.05)。見圖1。

圖1 不同觀察組大鼠的體質(zhì)量比較

2.2 外周血中GABA含量變化 與空白組比較，模型組和不同劑量朱砂觀察組的大鼠血液中GABA含量未見明顯變化(P>0.05)。

2.3 腦脊液中GABA含量變化 與空白組比較，模型組、高、中、低劑量觀察組和水觀察組大鼠腦脊液中GABA的含量顯著減少(P<0.01)；與模型組比較，空白組、高、中、低劑量觀察組和水觀察組大鼠腦脊液中的GABA含量不同(P<0.01)；與水觀察組比較，高劑量觀察組的大鼠腦脊液有明顯差異(P<0.01)。見圖2。

圖2 不同觀察組大鼠腦脊液中GABA含量比較

2.4 觀察組外周血中汞含量變化 觀察組在連續(xù)服用不同劑量朱砂5 d內(nèi)血汞濃度總體呈上升趨勢(shì)，以高劑量組最明顯，低劑量組次之，中劑量組最慢(P<0.01)。到第7天后血汞濃度總體有下降趨勢(shì)，高劑量組的大鼠血汞含量較中、低劑量組顯著升高(P<0.01)。見圖3。

圖3 觀察組連續(xù)7 d的血汞含量變化曲線

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，睡眠剝奪對(duì)大鼠的情緒狀態(tài)和體質(zhì)量的改變是非常明顯的并且難以自行恢復(fù)，這與朱寅秋的研究結(jié)果相符[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，急性睡眠剝奪與睡眠抑制均會(huì)使個(gè)體變得更易怒[6]，產(chǎn)生更多抑郁焦慮的消極情緒[7]。盡管經(jīng)過朱砂的治療情緒障礙和體質(zhì)量能夠改善，但相比睡眠剝奪給身體和情緒造成的傷害其治療作用還是相對(duì)比較有限的。根據(jù)《2020年中國人睡眠質(zhì)量報(bào)告》顯示近3億中國人睡眠質(zhì)量差，近67.24%的人出現(xiàn)失眠癥狀。經(jīng)歷了疫情后，中國人入睡時(shí)間延遲了2～3 h。這是一個(gè)非常嚴(yán)重的問題，并且需要立即得到關(guān)注與干預(yù)。睡眠剝奪包含了各種自發(fā)的和被動(dòng)造成的睡眠缺失狀態(tài)。長期的睡眠剝奪不僅造成機(jī)體生長發(fā)育的不良、情緒心理障礙，同時(shí)也可能是年輕人猝死的一個(gè)重要因素。

本研究發(fā)現(xiàn)，睡眠剝奪能夠使大鼠腦脊液中GABA含量顯著降低，并且在后期也較難自行恢復(fù)，可見睡眠剝奪對(duì)大腦的損傷是顯著的、不可逆的。而高劑量的朱砂治療能夠使腦脊液中GABA含量有較明顯的改善，但作用有限。這與以往實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道結(jié)果相符[8]。γ-氨基丁酸(GABA)作為腦內(nèi)主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，是由L-谷氨酸在谷氨酸脫羧酶(GAD)作用下脫羧形成，對(duì)中樞神經(jīng)元有普遍抑制和調(diào)節(jié)作用[9]。另外本研究發(fā)現(xiàn)，睡眠剝奪對(duì)大鼠外周血中GABA含量的改變無顯著差異。已有研究發(fā)現(xiàn)除了神經(jīng)系統(tǒng)外，GABA還廣泛分布于脂肪、肝臟、肌肉等外周組織[10]。這可能與外周組織的調(diào)控有關(guān)，外周血中的GABA含量能夠受到外周組織調(diào)控而保持相對(duì)穩(wěn)定。

本研究發(fā)現(xiàn)，中、低劑量朱砂對(duì)腦脊液中GABA含量不能起到明顯的調(diào)節(jié)作用；只有高劑量朱砂能夠較明顯促進(jìn)腦脊液中GABA生成；但連續(xù)7 d朱砂治療顯示的高劑量朱砂能夠使外周血中汞含量明顯高于中、低劑量組。這可能說明了GABA并不是朱砂改善睡眠的主要作用靶點(diǎn)?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)[11-13]朱砂除對(duì)GABA有影響外，朱砂還可降低其他興奮性神經(jīng)遞質(zhì)如5-HT、NE、天冬氨酸、甘氨酸含量。王旗等[14]通過小鼠高架水迷宮試驗(yàn)證實(shí)了朱砂有抗焦慮作用。測(cè)定小鼠腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)，朱砂對(duì)5-HT有劑量依賴性抑制作用，但對(duì)DA和NE無明顯影響。

朱砂作為中醫(yī)重鎮(zhèn)安神藥中的典型代表，以其“色赤通心，重能鎮(zhèn)怯，寒能勝熱，甘以生津，抑陰火之浮游，以養(yǎng)上焦之元?dú)?，為安神之第一品?！爆F(xiàn)代臨床研究也證實(shí)了朱砂及其復(fù)方在鎮(zhèn)靜催眠、抗焦慮、抗恐懼、外用消炎等具有良好療效，但在臨床口服多以復(fù)方配伍使用，單味藥口服較少即使低劑量口服也不能保證其安全性，其發(fā)揮作用的主要靶點(diǎn)在腦組織中，其濃度與安全劑量、蓄積代謝的藥代動(dòng)力學(xué)還有待進(jìn)一步驗(yàn)證，其解毒方面的研究將是后面的主要研究方向。