宋彥顯，閔玉濤，彭 聰，馬慶一

(1．鄭州工程技術(shù)學(xué)院 化工食品學(xué)院，河南 鄭州 450044；2．鄭州市速凍面米食品質(zhì)量與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州450044；3．鄭州輕工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450002)

淫羊藿(Epimedium brevicornu Maxim)為小檗科淫羊藿屬植物，又稱仙靈脾、放杖草等，是國家衛(wèi)生部批準(zhǔn)的可用于保健食品的中草藥之一。黃酮是淫羊藿的主要功能成分之一[1-4]，近年來研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿黃酮具有抗疲勞、補(bǔ)腎壯陽、祛風(fēng)濕、抗衰老、抗腫瘤、降血糖、抑制酪氨酸酶活性、抗炎抑菌、減少動脈硬化風(fēng)險(xiǎn)、防治骨質(zhì)疏松等生物活性[5-7]。淫羊藿及其黃酮在抗疲勞方面的研究方興未艾，但對其作用機(jī)制的研究尚不多見[8-9]。

已有文獻(xiàn)報(bào)道劇烈運(yùn)動可導(dǎo)致血清睪酮水平降低，從而導(dǎo)致機(jī)體疲勞[10-11]。提高睪酮濃度或抵抗睪酮濃度下降已成為諸多物質(zhì)抗疲勞活性的作用機(jī)理之一，據(jù)此機(jī)理開發(fā)抗疲勞功能食品已成為研究的熱點(diǎn)[12-13]。本文以淫羊藿為原料，經(jīng)提取純化，制備淫羊藿黃酮，考察淫羊藿黃酮對大鼠血清內(nèi)源睪酮水平的影響，探究淫羊藿抗疲勞作用機(jī)理，為淫羊藿保健食品和藥物開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

淫羊藿：購于鄭州中藥城,經(jīng)河南省中醫(yī)藥大學(xué)楊懷霞老師鑒定為小檗科(BerbeHdaceae)淫羊藿屬(EpimediumL．)植物；SD大白鼠：SPF級，雄性，體重300～320g，購于河南省實(shí)驗(yàn)動物中心，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號SCXK(豫)2017-0001；大鼠睪酮(T)酶聯(lián)免疫試劑盒：96T，天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司，批號20110402；蘆丁：色譜純，中國藥品生物制品鑒定所；AB-8大孔吸附樹脂：BR級，上海源葉科技生物有限公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

723可見分光光度計(jì)：上海第三分析儀器廠；HH-S11-2電熱恒溫水浴鍋：北京長安科學(xué)儀器廠；ZFQ85A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海醫(yī)械專機(jī)廠；TG328A電光分析天平：上海天平儀器廠；2XZ-0.5旋片式真空泵：浙江黃巖真空泵廠；ZF-C三用紫外燈：上?？岛坦怆妰x器有限公司；FFC-15粉碎機(jī)：山東即墨農(nóng)業(yè)機(jī)械廠；XK96-B快速混勻器：泰州姜堰新康醫(yī)療器械有限公司；4MK2自動清洗機(jī)：Thermo公司；Multiskan FC酶標(biāo)儀：賽默飛世爾公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 淫羊藿黃酮的提取與純化

取15g粉碎至40目的淫羊藿置于500mL圓底燒瓶中，加水300mL，回流提取1h，趁熱抽濾，提取3次，合并3次濾液，加乙醇至體積分?jǐn)?shù)為70%，離心除去沉淀，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇。

AB-8大孔樹脂經(jīng)預(yù)處理后，取水提醇沉后的黃酮濃縮液進(jìn)行純化。上樣量為30mL，先用2倍柱體積的蒸餾水洗脫，隨后再以70%乙醇洗脫，洗脫速度為2 mL/min。采用三氯化鐵跟蹤檢測，合并所有正反應(yīng)的洗脫液，濃縮、定容并測定黃酮含量。

1.3.2 淫羊藿黃酮的定性分析

根據(jù)文獻(xiàn)[14]對淫羊藿黃酮進(jìn)行定性分析。

1.3.3 淫羊藿總黃酮含量的測定

精確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶解，稀釋成0.2mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確移取1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液分別置于25mL容量瓶中，用30% 乙醇稀釋至12.5mL，加入5%NaNO2溶液0.5mL,靜置6min 后加入0.5mL 10%Al(NO3)3溶液，靜置6min，再加入4.0mL 4%NaOH溶液，30%乙醇溶液定容至25mL。堿性條件下顯色12 min，以不加蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液為空白，510nm處測定吸光度值，以吸光度值為縱坐標(biāo)，蘆丁濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

準(zhǔn)確移取淫羊藿黃酮樣品溶液2.0 mL置于25mL容量瓶中， 按上述操作以不加樣品為空白，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程，計(jì)算黃酮含量。

1.3.4 酶聯(lián)免疫分析法測定大鼠血清睪酮含量

將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至20pmol/mL，以倍比稀釋液(0.5，2.5，1.25，0.625，0.313，0.156 pmol/mL) 做對照(用前15min配制)。將不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液100μL加樣至酶標(biāo)板中，輕輕混勻，加蓋，37℃反應(yīng)2h，洗滌液洗板5次，各加底物溶液90μL，37℃避光顯色30min，加終止液50μL終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀在630nm波長處依次測定各孔的光密度(OD值)，以標(biāo)準(zhǔn)物濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

將50只SD雄性大白鼠分成10組，每組5只，按表1將黃酮水作為必需的飲用水進(jìn)行飼養(yǎng)(第1組為對照組)，各組全部供給同樣食物。15天后，尾部取血，30min內(nèi)離心(3000r/min，15min)，取血清測定睪酮含量。

表1 淫羊藿黃酮水的濃度

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

510nm處繪制的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

蘆丁是黃酮測定常用的標(biāo)準(zhǔn)品，由圖1可知，蘆丁濃度越高，在510nm處的吸光度值越大，兩者呈較好的線性關(guān)系，回歸方程為：y=0.3132x，R2=0.9995，可用于淫羊藿黃酮濃度的測定。

2.2 淫羊藿黃酮的提取

510nm處分別測定各次水提、醇沉、純化后樣品的吸光度值，每個(gè)樣品作3個(gè)平行對照，根據(jù)蘆丁濃度和平均吸光度值回歸方程計(jì)算濃度，計(jì)算含量和得率，結(jié)果如表2所示。

表2 淫羊藿黃酮提取純化各階段含量和濃度

總黃酮的提取方法主要有超聲波輔助提取法、超高壓提取法、索氏提取法、水煎煮法等[15-16]。超聲波輔助提取法和超高壓提取法提取率高，但需要專業(yè)設(shè)備，成本高，不適于工業(yè)化生產(chǎn)；索氏提取法不能用于大規(guī)模生產(chǎn)；與乙醇回流法相比，水溶法的提取率略高，但雜質(zhì)偏多；將水溶法與醇沉結(jié)合起來既可以提高提取率，又可以除去雜質(zhì)，其成本相對較低，適合于工業(yè)化生產(chǎn)。因此，本文采用水溶法提取淫羊藿總黃酮。由表2 可知，第3次水提后的黃酮含量已較低，綜合考慮回收的黃酮數(shù)量與耗費(fèi)的時(shí)間、人力和能量，在工業(yè)化生產(chǎn)中采用兩次水煎法提取黃酮即可。

醇沉后的黃酮含量略有下降，可能是在測定的波長范圍內(nèi)有吸收的干擾雜質(zhì)被除去的緣故。另外，少量黃酮與雜質(zhì)之間可能存在的共沉淀也是不可忽視的因素。本文水煎煮法的提取率為5.65%，醇沉后得率為4.57%，較為理想。

2.3 AB-8大孔吸附樹脂純化淫羊藿黃酮

由表2可知，純化后的淫羊藿黃酮濃度為 8.507mg/mL，相比純化前濃度提高5.1倍，純化得率為77.52%。在純化過程中，大孔吸附樹脂吸收了干擾雜質(zhì)，使黃酮的純度升高，含量略有下降。樹脂使用3次后，總黃酮吸附量下降約41.23%，需要重生后使用。AB-8大孔吸附樹脂純化黃酮得率高，效果好，可以作為黃酮純化的選擇之一。

2.4 淫羊藿黃酮的定性分析

采用鹽酸-鎂粉法、三氯化鐵反應(yīng)、薄層層析法對淫羊藿不同提取階段的產(chǎn)物進(jìn)行顯色反應(yīng)檢測，結(jié)果如表3所示。

表3 淫羊藿不同提取階段產(chǎn)物顯色反應(yīng)結(jié)果

在鹽酸-鎂粉實(shí)驗(yàn)中，一些黃酮類化合物,如黃酮醇、二氫黃酮及二氫黃酮醇類，在鎂粉-鹽酸作用下，易被氫化還原，迅速生成紫紅色(個(gè)別藍(lán)色)，試管中出現(xiàn)大量的氣泡，同時(shí)呈現(xiàn)紅色-紫紅色。三氯化鐵為常用的酚類顯色劑，多數(shù)黃酮類化合物因分子中含有酚羥基，可產(chǎn)生正反應(yīng)，呈現(xiàn)綠、藍(lán)、黑、紫等顏色。在洗脫400mL左右時(shí)，開始呈現(xiàn)綠色，大約600mL時(shí)呈現(xiàn)黑色，之后呈綠色。收集400～500mL時(shí)，三氯化鐵已不再顯色。薄層層析板在紫外燈下，出現(xiàn)1個(gè)主點(diǎn)，2個(gè)輔點(diǎn)。用三氯化鋁顯色后，主點(diǎn)為橙紅色熒光點(diǎn)。以上檢測結(jié)果均證明了淫羊藿中黃酮的存在。

2.5 大鼠睪酮基準(zhǔn)物的標(biāo)準(zhǔn)曲線

用酶標(biāo)儀于波長630nm處測定各稀釋鼠睪酮標(biāo)準(zhǔn)品吸光度(OD值)，以鼠睪酮標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2所示。

圖2 大鼠睪酮基準(zhǔn)物的標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖2可知，大鼠睪酮基準(zhǔn)物濃度和630nm處吸光度值呈較好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=23.409x，吸光度和濃度呈很好的線性關(guān)系，R2=0.9843，可以作為大鼠睪酮測定的依據(jù)。

2.6 雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法測定大鼠血清睪酮含量

大鼠尾部取血，測定630nm處吸光度值，根據(jù)大鼠睪酮基準(zhǔn)物的標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程，計(jì)算大鼠血清睪酮含量，以平均值和對照組的差值作圖，如圖3所示。

圖3 大鼠血清中的睪酮含量變化

由圖3所示，飲用淫羊藿黃酮水后大鼠的睪酮水平都有不同程度的提高，隨著淫羊藿水溶性黃酮量的提高，大鼠的睪酮水平不斷提高，相比對照組最多提高了8.934 pmol/mL。結(jié)果表明，淫羊藿黃酮能促進(jìn)大鼠的血睪酮分泌，提高大鼠的血睪酮濃度，是淫羊藿黃酮抗疲勞的機(jī)理之一。

3 結(jié)論

采用水提結(jié)合醇沉法提取淫羊藿黃酮，提取率較高，成本低，可應(yīng)用于功能性飲料工業(yè)化生產(chǎn)中。大孔樹脂AB-8純化淫羊藿黃酮效率高，是一種黃酮純化的有效方法。淫羊藿黃酮作為淫羊藿抗疲勞活性成分之一，促進(jìn)大鼠的血睪酮分泌，提高大鼠的血睪酮濃度，是其作用機(jī)理之一，可開發(fā)淫羊藿抗疲勞運(yùn)動飲料等抗疲勞產(chǎn)品。淫羊藿黃酮化合物種類較多，需進(jìn)一步分離純化各成分并進(jìn)行抗疲勞活性研究，鑒定活性成分結(jié)構(gòu)，研究其構(gòu)效關(guān)系。