孫勝平

（漢川市疾病預(yù)防控制中心檢驗(yàn)科，湖北 孝感 431600）

艾滋?。╝cquired immunodeficiency syndrome, AIDS）又被稱為獲得性免疫缺陷綜合征，其因艾滋病病毒（HIV）感染而引起，臨床可表現(xiàn)出身體發(fā)熱、食欲不振、呼吸困難、精神異常等癥狀，該病目前尚無(wú)有效的治療措施。 HIV抗體檢測(cè)為診斷AIDS的主要手段，免疫印跡法作為診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，其通過(guò)條帶顯色與否來(lái)判斷待測(cè)樣本血清是否發(fā)生特異性抗原 -?抗體反應(yīng)，進(jìn)而檢測(cè)HIV抗體，具有檢測(cè)全面、靈敏度、特異性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，但此檢測(cè)方法成本較高，對(duì)于大批量的臨床標(biāo)本具有一定的局限性[1-2]。膠體層析法操作簡(jiǎn)單、檢驗(yàn)迅速，適用于急診檢測(cè)，但其常受人為、環(huán)境等因素影響，檢驗(yàn)的特異度低，易導(dǎo)致漏診[3]；而酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法具有診斷準(zhǔn)確度、靈敏度、特異度等均較高的特點(diǎn)，同時(shí)適用范圍廣泛、篩查價(jià)格相對(duì)較低，目前已被廣泛應(yīng)用于乙肝、丙肝、梅毒及結(jié)核等傳染類疾病的診斷[4]?；诖?，本研究探討了膠體層析法與酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法在HIV抗體初次篩查中的臨床價(jià)值，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料回顧性分析漢川市疾病預(yù)防控制中心利用全國(guó)艾滋病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)管理系統(tǒng)于2017年3月至2021年10月收集的漢川市620例疑似AIDS患者的臨床資料，其中男性347例，女性273例；年齡29～52歲，平均（41.36±2.25）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：與HIV病毒攜帶者有性關(guān)系、血液接觸者；無(wú)臟器性疾病、傳染性疾病疑似患者等；臨床資料完整者等。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有惡性腫瘤疾病者；已確診為HIV感染者；合并其他自身免疫性疾病（如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性疾病等）者等。研究經(jīng)漢川市疾病預(yù)防控制中心醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 研究方法所有被檢者空腹、平靜狀態(tài)下進(jìn)行血液采集，血液標(biāo)本容量為5 mL，進(jìn)行離心操作（3 000 r/min，5 min）后取血清，于-20 ℃環(huán)境下待檢。①酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法：使用抗原為HIV1+2抗原包被的96孔微孔板，每板中含3個(gè)陽(yáng)性對(duì)照孔、2個(gè)陰性對(duì)照孔及2個(gè)空白對(duì)照孔，同時(shí)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行編號(hào)并選擇與之對(duì)應(yīng)的加樣孔進(jìn)行檢測(cè)。各標(biāo)本復(fù)溶后加樣100 μL，封板后在37 ℃環(huán)境中孵育60 min，使用自動(dòng)洗板機(jī)（上?？迫A試驗(yàn)系統(tǒng)有限公司，型號(hào)：KHB ST-36W）進(jìn)行反復(fù)6次洗板處理，干燥后各反應(yīng)孔加入100 μL底物避光反應(yīng)15 min，隨后各反

應(yīng)孔加入50 μL終止液終止反應(yīng)，采用自動(dòng)酶標(biāo)儀（鄭州安圖生物工程有限公司，型號(hào)：Anthos 2010）進(jìn)行吸光度檢測(cè)，波長(zhǎng)設(shè)定為450 nm，檢驗(yàn)人員將酶聯(lián)免疫吸附法相關(guān)參考值作為參照，進(jìn)而進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果評(píng)定，空白孔數(shù)據(jù)調(diào)零，進(jìn)而檢測(cè)各孔吸光度（OD）值，以O(shè)D值代表抗體水平，其中OD值>截?cái)嘀担╟ut‐off值）≥ 1，否則為陰性。②膠體層析法：取50 μL復(fù)溶后血清加入試劑卡加樣處，應(yīng)用免疫層析原理對(duì)待測(cè)血清中HIV1+2抗體進(jìn)行定性檢測(cè)。加樣后靜置15 min，當(dāng)標(biāo)本中含有HIV1+2抗體時(shí)，硒膠體 -?抗原則會(huì)與之相結(jié)合，隨之不僅出現(xiàn)抗原重組現(xiàn)象，同時(shí)還會(huì)被固相包被，最終產(chǎn)生紅線。1 h后檢測(cè)人員進(jìn)行具體結(jié)果讀取，所有檢驗(yàn)操作均需按照對(duì)應(yīng)試劑使用說(shuō)明書進(jìn)行，各項(xiàng)檢測(cè)數(shù)量均為7次。結(jié)果判讀：檢測(cè)區(qū)和對(duì)照區(qū)有紫紅色條帶為陽(yáng)性，只對(duì)照區(qū)有紫紅色條帶為陰性。③免疫印跡法：復(fù)溶后血清以1∶100比例進(jìn)行稀釋，將稀釋后血清樣品加入至硝酸纖維素膜上，在37 ℃下恒溫震蕩，使待測(cè)血清與硝酸纖維素膜充分接觸、反應(yīng)等。當(dāng)血清存在與膜條包被的HIV1+2條帶結(jié)合時(shí)，則表明血清中含有HIV1+2抗體，結(jié)果為陽(yáng)性，在此基礎(chǔ)上操作者通過(guò)加入BCIP/NBT底物使之與抗人免疫球蛋白G（IgG）酶結(jié)合，發(fā)生紫褐色的產(chǎn)色反應(yīng)，檢驗(yàn)人員據(jù)此進(jìn)行具體結(jié)果判定。結(jié)果判讀：至少有2條膜帶（gP41/gP120/gP160）與P24帶同時(shí)出現(xiàn)時(shí)判定為陽(yáng)性，未見HIV抗體特異性條帶出現(xiàn)則判定為陰性。

1.3 觀察指標(biāo)①將免疫印跡法作為金標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)比酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法、膠體層析法對(duì)HIV抗體的檢測(cè)結(jié)果、診斷效能，其中靈敏度=真陽(yáng)性例數(shù)/（真陽(yáng)性+假陰性）例數(shù)×100%，特異度=真陰性例數(shù)/（假陽(yáng)性+真陰性）例數(shù)×100%，準(zhǔn)確度=（真陽(yáng)性+真陰性）例數(shù)/總例數(shù)×100%。②通過(guò)免疫印跡法測(cè)定陽(yáng)性樣本帶型分布狀況。③對(duì)比3種檢測(cè)方法的檢測(cè)時(shí)間。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理，計(jì)數(shù)資料以[ 例(%)]表示，采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料均首先進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)，若檢驗(yàn)符合正態(tài)分布且方差齊則以(±s?)表示，三組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法與膠體層析法檢測(cè)結(jié)果比較620例疑似AIDS患者采用免疫印跡法檢測(cè)后，194例為陽(yáng)性，426例為陰性。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法檢測(cè)出192例為陽(yáng)性，428例為陰性，其中有187例為真實(shí)AIDS患者，陽(yáng)性檢出率為30.97%（192/620）；膠體層析法檢測(cè)出陽(yáng)性有190例，陰性有430例，其中182例為真實(shí)AIDS患者，陽(yáng)性檢出率30.65%（190/620），酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法的陽(yáng)性檢出率高于采用膠體層析法，但經(jīng)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表1。

表1 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法與膠體層析法檢測(cè)結(jié)果比較( 例 )

2.2 兩種檢測(cè)方式的診斷效能比較酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法檢測(cè)的特異度、靈敏度、準(zhǔn)確度均高于膠體層析法檢測(cè)，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>0.05），見表2。

表2 兩種檢測(cè)方式的診斷效能比較(%)

2.3 陽(yáng)性樣本帶型分布狀況采用免疫印跡法檢測(cè)陽(yáng)性樣本帶型分布情況可見，194例AIDS患者中，gP160、gP120出現(xiàn)率為100%，其次為P24（98.97%）和gP41（97.94%），而P39、P55的出現(xiàn)率較低，分別為44.33%、31.44%，見表3。

表3 陽(yáng)性樣本帶型分布狀況

2.4 3種檢測(cè)方法檢測(cè)時(shí)間比較酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法、膠體層析法的檢測(cè)時(shí)間均顯著短于免疫印跡法，且膠體層析法的檢測(cè)時(shí)間顯著短于酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05），見表4。

表4 3種檢測(cè)方法檢測(cè)時(shí)間比較(?±s?, min)

表4 3種檢測(cè)方法檢測(cè)時(shí)間比較(?±s?, min)

注：與酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法比，*P<0.05；與膠體層析法比，#P<0.05。

檢測(cè)方法 例數(shù) 時(shí)間酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法 620 74.32±5.49膠體層析法 620 73.11±2.33*免疫印跡法 620 150.43±12.36*#F值 19 377.331 P值 <0.05

3 討論

AIDS由感染HIV引起，人體免疫系統(tǒng)中的CD4+T淋巴細(xì)胞是HIV的主要攻擊目標(biāo)，使該細(xì)胞被大量破壞，進(jìn)而使人體免疫功能不全甚至喪失。AIDS會(huì)對(duì)患者、家庭及整個(gè)社會(huì)造成多方面的消極影響，因此，社會(huì)各界必須加強(qiáng)對(duì)AIDS的重視度，主動(dòng)做好AIDS防治工作。HIV檢測(cè)是AIDS防治工作的一個(gè)重要組成部分，因其具有特殊性，其檢測(cè)結(jié)果是否準(zhǔn)確與患者的臨床治療與身心健康密切相關(guān)，選取合適的血清學(xué)檢測(cè)方法至關(guān)重要。免疫印跡法是診斷AIDS的金標(biāo)準(zhǔn)，其檢測(cè)的靈敏度、準(zhǔn)確率均較高，但由于該方法檢測(cè)成本高，在大批量樣本HIV初篩時(shí)并不適用[5]。

目前常用的HIV抗體初篩方法包括兩種：膠體層析法和酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法，其中膠體層析法是指利用HIV抗體與硒膠體 -?抗原結(jié)合后被合成肽、重組抗原捕捉固定、顯色的原理，對(duì)HIV抗體進(jìn)行定性檢測(cè)，具有檢測(cè)費(fèi)用低廉、反應(yīng)快速等特點(diǎn)，但采用該方法檢測(cè)的敏感性較低，尤其是脂血、溶血標(biāo)本檢測(cè)背景影響結(jié)果判讀，造成誤診的發(fā)生，且對(duì)于窗口期患者抗體含量不高時(shí)易出現(xiàn)漏診現(xiàn)象[6-7]。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法是指將特異性HIV抗原抗體與酶相互結(jié)合起來(lái)，當(dāng)受檢血清樣本與特異性HIV抗原抗體發(fā)生免疫反應(yīng)后，酶催化相應(yīng)的底物水解，繼而發(fā)生顯色反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)HIV抗體檢測(cè)，此種檢測(cè)方式具有操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性高、檢測(cè)效率高、檢測(cè)準(zhǔn)確性高等特點(diǎn)[8-9]。盡管酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法不受脂血、溶血樣本影響，穩(wěn)定性高，但由于大批量樣本操作時(shí)步驟繁瑣，且類風(fēng)濕因子、異嗜性抗原的存在會(huì)使其結(jié)果存在不確定性，因此在檢測(cè)前需要了解被檢者免疫狀態(tài)，以免影響檢測(cè)進(jìn)度。本研究結(jié)果顯示，酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法檢測(cè)的特異度、靈敏度、準(zhǔn)確度均高于膠體層析法檢測(cè)，但經(jīng)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明采用膠體層析法、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法在HIV抗體初次篩查中均具有較高的應(yīng)用價(jià)值，與邵為榮[10]研究結(jié)果基本一致。本研究結(jié)果還顯示，采用免疫印跡法檢測(cè)陽(yáng)性樣本帶型分布情況可見，194例AIDS患者中，gP160、gP120出現(xiàn)率為100%，說(shuō)明HIV在該類人群中較為活躍、傳染性較強(qiáng)，需加強(qiáng)HIV監(jiān)測(cè)；其次為P24、gP41出現(xiàn)率較高，對(duì)于此類人群需做進(jìn)一步隨訪，盡最大可能發(fā)現(xiàn)感染者。本研究結(jié)果還顯示，酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法的檢測(cè)時(shí)間顯著長(zhǎng)于膠體層析法，可見對(duì)于單樣本或復(fù)查樣本的檢測(cè)時(shí)可選擇膠體層析法檢測(cè)，對(duì)于大批量樣本初篩時(shí)可選擇酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法以降低檢測(cè)成本。

酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法與膠體層析法兩種檢驗(yàn)方法在HIV抗體初次篩查中各具有特點(diǎn)，對(duì)HIV抗體初次篩查均具有一定的應(yīng)用價(jià)值，對(duì)此相關(guān)人員在規(guī)范操作、保證檢測(cè)質(zhì)量的同時(shí)可根據(jù)標(biāo)本狀態(tài)、檢測(cè)標(biāo)本量、被檢者免疫狀況等因素合理選擇檢測(cè)方法，及時(shí)進(jìn)行有效綜合的檢測(cè)，取長(zhǎng)補(bǔ)短，提高HIV抗體篩查質(zhì)量與效率。另外，還需加強(qiáng)對(duì)相關(guān)干擾因素重視度，不斷提高檢驗(yàn)人員綜合水平，促使其及時(shí)按照相關(guān)規(guī)則、流程、要求等進(jìn)行具體檢驗(yàn)，減少干擾因素對(duì)其影響，提高檢驗(yàn)效率。

綜上，膠體層析法、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法各有優(yōu)點(diǎn)，這兩種檢測(cè)方法在HIV抗體初次篩查中準(zhǔn)確度、靈敏度、特異度均較高；酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法的檢測(cè)時(shí)間顯著長(zhǎng)于膠體層析法，因此，在進(jìn)行HIV初抗體篩查時(shí)，應(yīng)根據(jù)檢測(cè)的具體情況，靈活運(yùn)用兩種檢測(cè)方式。