孫亞群， 彭慶杰， 王強強， 蘇亞珊，2， 陳科明，， 李廣永， 吳 際， 何 瑞

（1.寧夏醫(yī)科大學生育力保持教育部重點實驗室，銀川 750004； 2.寧夏醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，銀川 750004；3.寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院泌尿外科，銀川 750004）

肥胖癥、2 型糖尿病等代謝紊亂性疾病是嚴重威脅人類健康的重要問題，越來越多的證據(jù)[1-4]表明，代謝紊亂與不孕癥密切相關，影響著全世界約10%的育齡夫婦。由于下丘腦-垂體-卵巢軸的失調，肥胖女性比正常體質量的女性更容易發(fā)生排卵障礙[5-6]，引起內分泌紊亂及不孕。多囊卵巢綜合征是典型代謝內分泌紊亂與生殖內分泌紊亂進而影響卵巢功能的疾病。卵巢的主要功能包括卵泡發(fā)育，卵母細胞的產生、成熟和釋放，以及調節(jié)生殖和非生殖功能的雌性激素和肽激素的合成[7]。在糖尿病-肥胖綜合征及多囊卵巢綜合征中，進行性高血糖-高胰島素血癥與周期性卵巢卵泡募集模式的抑制、無排卵、無周期性、卵巢類固醇激素合成和釋放抑制、血管減少和組織缺血、卵泡閉鎖增強以及組織過早萎縮和退化有關[8-9]。糖脂代謝紊亂可以引起卵巢微環(huán)境改變，影響卵巢細胞功能，進而影響卵巢功能。已有研究[8-9]發(fā)現(xiàn)，肥胖和高血糖患者卵巢細胞退化可能與糖毒性和進行性細胞脂毒性作用的存在有關，但目前缺乏代謝紊亂相關的卵巢細胞模型，具體機制尚不清楚。本研究通過在中國倉鼠卵巢細胞（Chinese hamster ovary cells，CHO 細胞）的培養(yǎng)液中加入葡萄糖及油酸，模擬肥胖2 型糖尿病患者高糖高脂的代謝紊亂微環(huán)境，建立CHO細胞代謝紊亂損傷模型，并初步探討其機制，為代謝紊亂損傷卵巢功能的研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞

CHO 細胞（公認的卵巢細胞系）購自BNCC公司。將CHO 細胞傳代于含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM/F-12 培養(yǎng)基，置于含5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 主要試劑

DMEM/F-12 培養(yǎng)基（貨號SH30023.01）購于HyClone 公司；彩色蛋白Marker、蛋白上樣緩沖液、蛋白酶抑制劑、RIPA 裂解液購于上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒、蘇木素-伊紅染色液購于上海碧云天生物技術有限公司；CCK-8 試劑盒購于索萊寶生物科技有限公司；油酸（貨號O1383）購于Sigma 公司；DMEM高糖培養(yǎng)基（貨號SH30022.01）購于HyClone 公司；p-mTOR 一抗（貨號2971）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）一抗（貨號2983）、p-AMPK 一抗（貨號2535）、AMPK 一抗（貨號2532）、Caspase-3 一抗（貨號9662）購于Cell Signaling Technology公司；PCNA 一抗（貨號ab18197）購于Abcam 公司；β-actin 一抗（貨號sc-47778）購于Senta Cruz Biotechnology 公司；異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標記山羊抗兔IgG 免疫熒光二抗（貨號A23220）購于Abbkine 公司。

1.3 儀器與設備

Multiskan GO 酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）、超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）、熒光倒置顯微鏡（德國Bresser 公司）、高速臺式離心機（上海力申科學儀器有限公司）、CO2培養(yǎng)箱（上海力申科學儀器有限公司）、GelDoc XR+凝膠成像分析系統(tǒng)、165-8001 型垂直電泳槽（美國Bio-Rad 公司）。

1.4 溶液配制

油酸溶液：量取9.7 μL 油酸置于1.5 mL 的EP 管中，打開蓋子并放在超凈臺中，用紫外線燈照射消毒約30 min，然后加入40 μL 已消毒的DMSO 溶液，振蕩使其充分溶解，即為備用的62.5 μmol·L-1油酸[10]母液。在造模前，先用50 mL的DMEM/F-12（含有1%雙抗、10%胎牛血清）來稀釋上面的母液至造模所需的相應濃度，放于4 ℃保存。高糖培養(yǎng)基：用44.5 mL DMEM 高糖培養(yǎng)基，加入0.45 mL 雙抗、4.5 mL 胎牛血清，放于4 ℃保存。高糖高油酸溶液：用50 mL 的DMEM高糖培養(yǎng)基稀釋高油酸的母液至造模所需的相應濃度，放于4 ℃保存。本實驗采用25 mmol·L-1的葡萄糖[11-12]和62.5 μmol·L-1的油酸干預細胞建立代謝紊亂細胞模型，所用試劑及濃度均參照課題組前期實驗，并參考文獻[10-12]。

1.5 細胞分組與實驗方法

1.5.1 CCK-8 實驗 用DMEM/F-12 培養(yǎng)基培養(yǎng)CHO 細胞，將培養(yǎng)皿中覆蓋率達80%～90%細胞離心收集，對細胞混懸液進行計數(shù)，按每孔100 μL 接種于96 孔板，每組設4 個復孔，5×103個/孔，并把培養(yǎng)板放置在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，在倒置顯微鏡下觀察，觀察CHO 細胞的貼壁及其生長狀況。待細胞增殖鋪滿每孔的60%后，棄上清液并用無血清DMEM/F-12 培養(yǎng)基干預，給予饑餓處理4 h。磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗細胞2 次，于每孔再分別滴加相應的培養(yǎng)基［對照組（C 組）：DMEM/F-12 培養(yǎng)基，單獨高油酸模型組（O 組）：62.5 μmol·L-1油酸的DMEM/F-12 培養(yǎng)基，單獨高糖模型組（G 組）：25 mmol·L-1的DMEM高糖培養(yǎng)基，高糖高油酸聯(lián)合模型組（GO組）：25 mmol·L-1DMEM 高糖培養(yǎng)基與62.5 μmol·L-1油酸］，然后繼續(xù)孵育24 h 后按照試劑盒說明每一孔滴加10 μL 的CCK-8 檢測液，并在37 ℃的條件下孵育2 h，在讀數(shù)之前放置搖床上，低速振蕩緩慢混合均勻。在酶標儀450 nm 處測量其各孔的相應光密度（OD）值，實驗重復3 次，計算細胞增殖率。細胞增殖率（%）=［（實驗孔OD值-空白孔OD 值）（/對照孔OD值-空白孔OD值）］×100%；空白孔：CCK-8、培養(yǎng)基，對照孔：CCK-8、培養(yǎng)基、細胞，實驗孔：CCK-8、培養(yǎng)基、細胞、受試化合物。進行以上4 組細胞活力檢測。選取對細胞存活抑制最強的高糖高油酸聯(lián)合模型組進行進一步的細胞活力檢測以及細胞免疫熒光染色。

1.5.2 HE 染色實驗 取5×103個/孔細胞混懸液，按每孔1 mL 接種于含有細胞爬片的24 孔板中培養(yǎng)，在倒置顯微鏡下進行觀察。待細胞增殖鋪滿每孔的60%后，棄上清液并用無血清DMEM/F-12 培養(yǎng)基干預，給予饑餓處理4 h。PBS 清洗細胞2 次，于每孔再分別滴加相應的培養(yǎng)基（C 組：DMEM/F-12 培養(yǎng)基，O 組：62.5 μmol·L-1油酸的DMEM/F-12 培養(yǎng)基，G 組：25 mmol·L-1的DMEM 高糖培養(yǎng)基，GO 組：25 mmol·L-1DMEM高糖培養(yǎng)基與62.5 μmol·L-1油酸），每組設3 個復孔，然后繼續(xù)孵育24 h 后棄上清液，PBS 清洗細胞3 次，加入4%多聚甲醛固定20 min 后再用PBS 清洗細胞3 次。蘇木素加入24 孔板5 min，流水沖洗1 min，分化液分化1 s，水洗1 min，顯微鏡下觀察染核情況。伊紅加入24 孔板2 min，梯度乙醇脫水各10 s，二甲苯Ⅰ5 min，二甲苯Ⅱ5 min，中性樹脂封片，顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。

1.5.3 細胞免疫熒光染色實驗 取5×103個/孔細胞混懸液，按每孔1 mL 接種于含有細胞爬片的24 孔板中培養(yǎng)，在倒置顯微鏡下進行觀察。待細胞增殖鋪滿每孔的60%后，棄上清液并用無血清DMEM/F-12 培養(yǎng)基干預，給予饑餓處理4 h。PBS 清洗細胞2 次，于每孔再分別滴加相應的培養(yǎng)基（C 組：DMEM/F-12 培養(yǎng)基，O 組：62.5 μmol·L-1油酸的DMEM/F-12 培養(yǎng)基，G 組：25 mmol·L-1的DMEM 高糖培養(yǎng)基，GO 組：25 mmol·L-1DMEM高糖培養(yǎng)基與62.5 μmol·L-1油酸），每組設3 個復孔，然后繼續(xù)孵育24 h 后棄上清液，PBS 清洗細胞3 次，加入4%多聚甲醛固定20 min 后再用PBS 清洗細胞3 次。0.5% Triton X-100 處理細胞5 min，PBS 清洗細胞3 次，每次3 min。正常山羊血清室溫封閉30 min 后，一抗4 ℃孵育過夜，PBS清洗細胞3 次，每次3 min。熒光標記二抗室溫濕盒避光孵育1 h，PBS 清洗細胞3 次，每次3 min。DAPI 室溫濕盒避光孵育5 min，PBS 清洗5 min，無菌水洗2 次，每次5 min。最后用含DAPI 的抗熒光淬滅劑封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.5.4 Western blot 實驗 取5×103個/孔細胞混懸液，按每孔2 mL 接種于6 孔板中培養(yǎng)，在倒置顯微鏡下進行觀察。待細胞增殖鋪滿每孔的60%后，棄上清液并用無血清DMEM/F-12 培養(yǎng)基干預，給予饑餓處理4 h。PBS 清洗細胞2 次，于每孔再分別滴加相應的培養(yǎng)基（C 組：DMEM/F-12培養(yǎng)基，O 組：62.5 μmol·L-1油酸的DMEM/F-12培養(yǎng)基，G 組：25 mmol·L-1的DMEM 高糖培養(yǎng)基，GO 組：25 mmol·L-1DMEM 高糖培養(yǎng)基與62.5 μmol·L-1油酸），每組設3 個復孔，然后繼續(xù)孵育24 h 后棄上清液，PBS 清洗細胞3 次，提取細胞總蛋白，加細胞裂解液（RIPA∶PMSF=1∶50），置于冰上裂解，離心分離上清液，采用BCA 法對蛋白濃度定量，蛋白變性后分裝于EP 管中，保存?zhèn)溆?；蛋白上樣每?0 μg 總蛋白，電泳（80 V 分離膠，100 V 濃縮膠）至溴酚藍完全跑出，采用濕轉法恒流200 mA 冰浴轉膜，將蛋白移至PVDF 膜上；5%脫脂奶粉封閉膜2 h；4 ℃搖床孵育一抗過夜，避光常溫孵育二抗（1:2 000）2 h，顯色劑顯色后，凝膠成像儀拍照，測灰度值，實驗獨立重復3 次。Image Lab 軟件進行條帶灰度值分析。以β-actin 為內參，計算蛋白相對表達量。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多個樣本組間比較采用方差分析；兩組間比較采用獨立樣本t 檢驗。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 高油酸、高糖以及高糖高油酸處理對CHO細胞形態(tài)、數(shù)量及增殖的影響

高油酸、高糖以及高糖高油酸聯(lián)合干預細胞24 h 后，HE 染色顯示，與C 組比較，CHO 細胞形態(tài)出現(xiàn)變化：O 組細胞呈現(xiàn)兩種形態(tài)，一部分細胞進一步拉長，呈現(xiàn)細長梭形，另一部分細胞收縮變圓，呈現(xiàn)圓球形；G 組以及GO 組細胞幾乎全部變圓，相鄰細胞間隙增大。CCK-8 實驗結果顯示，與C 組比較，O 組、G 組以及GO 組CHO細胞數(shù)量均減少（P 均＜0.05）。待細胞增殖鋪滿每孔的60%后，給予無血清DMEM/F-12 培養(yǎng)基饑餓處理4 h，之后給予細胞高油酸、高糖以及高糖高油酸聯(lián)合處理24 h，細胞增殖率分別為91.94%、53.02%、45.59%，均低于C 組（99.98%，P 均＜0.05），與C 組相比，高糖高油酸聯(lián)合處理24、36 和48 h時均可降低細胞增殖率（P 均＜0.05），細胞增殖率降低達到50%，故認為高糖高油酸聯(lián)合作用24 h 為最佳處理時間，見圖1。

圖1 各組CHO 細胞形態(tài)、數(shù)量及增殖的變化

2.2 Western blot 檢測高油酸、高糖以及高糖高油酸處理對CHO 細胞半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）、增殖細胞核抗原（PCNA）蛋白表達的影響

與C 組相比，O 組、G 組以及GO 組CHO 細胞Caspase-3 蛋白表達水平均升高（P 均＜0.05）；與C組相比，G 組以及GO 組CHO 細胞PCNA 的蛋白表達水平均降低（P 均＜0.05），見圖2。

圖2 各組CHO 細胞Caspase-3、PCNA 的蛋白表達及定量分析

2.3 高油酸、高糖以及高糖高油酸處理對CHO細胞p-mTOR、p-AMPK 表達的影響

與C 組相比，高油酸、高糖以及高糖高油酸處理后，G 組CHO 細胞p-mTOR 蛋白表達水平升高（P 均＜0.05）；與C 組相比，O 組、G 組以及GO組CHO 細胞p-AMPK 的蛋白相對表達水平均降低（P 均＜0.05），見圖3。

圖3 各組CHO 細胞p-mTOR、p-AMPK 的蛋白表達及定量分析

2.4 細胞免疫熒光染色檢測高糖高油酸處理對CHO 細胞Caspase-3、PCNA 表達的影響

細胞免疫熒光染色對高糖高油酸聯(lián)合處理的CHO 細胞進行Caspase-3 凋亡以及PCNA 增殖鑒定結果顯示，綠色熒光標記的細胞為Caspase-3 以及PCNA 陽性表達的細胞，藍色熒光區(qū)域為DAPI。與C 組相比，GO 組Caspase-3 表達增加，PCNA 表達減少（P 均＜0.05），且細胞核發(fā)生固縮，熒光顯示不均勻，見圖4。

圖4 高糖高油酸聯(lián)合處理CHO 細胞Caspase-3、PCNA 蛋白的免疫熒光染色及定量分析

3 討論

已有研究[13]發(fā)現(xiàn)，肥胖、糖尿病患者卵巢功能受損，高糖高油酸環(huán)境誘導卵巢細胞過度凋亡，早期階段閉鎖卵泡數(shù)量增加并且卵泡發(fā)育遲緩，打破了細胞增殖和凋亡之間的平衡，導致卵泡發(fā)育異常和卵巢功能衰竭。短期和長期高血糖對發(fā)育中的排卵前卵母細胞有影響，導致周圍細胞凋亡增加、外源性凋亡途徑上調[14]。此外，糖尿病通過誘導卵巢細胞凋亡和抑制卵巢血管生成觸發(fā)卵巢功能異常[15]，但具體機制尚不清楚。因目前缺乏體內高糖高油酸微環(huán)境的模型，因此，本研究利用高糖高油酸處理卵巢細胞系CHO 細胞，研究高糖高油酸微環(huán)境對CHO 細胞作用及機制，并建立模擬肥胖糖尿病所致CHO 細胞高糖高油酸微環(huán)境的體外模型。

通過高油酸、高糖及高糖高油酸聯(lián)合處理體外培養(yǎng)的CHO 細胞，以高油酸處理誘發(fā)脂代謝紊亂微環(huán)境，以高糖培養(yǎng)基處理誘發(fā)糖代謝紊亂微環(huán)境，以及高糖高油酸聯(lián)合處理誘發(fā)糖脂代謝紊亂微環(huán)境，實驗結果顯示，高糖、高油酸及聯(lián)合狀態(tài)下CHO 細胞數(shù)量均變少，細胞存活率降低，但是單獨高油酸效果不如高糖及高糖與高油酸聯(lián)合明顯，說明糖代謝紊亂相比較脂代謝紊亂，對CHO 細胞影響更大，而高糖高油酸聯(lián)合對CHO細胞影響最為明顯，細胞過度凋亡，且增殖減少，與研究[13]報道的肥胖、糖尿病患者體內卵巢細胞增殖與凋亡失衡相一致。因此認為通過在培養(yǎng)基中加入葡萄糖和油酸，造成高糖高油酸微環(huán)境，可以成功建立模擬肥胖2 型糖尿病患者糖脂代謝紊亂的體內微環(huán)境的卵巢細胞模型。為進一步探究機制，檢測高油酸、高糖及高糖高油酸聯(lián)合處理卵巢細胞系CHO 細胞過程中細胞凋亡相關基因（Caspase-3）和PCNA 的表達。有研究[16]認為，Caspase-3 在Caspase 介導的細胞凋亡中充當執(zhí)行者，Caspase-3 的表達與細胞的凋亡率呈正相關，PCNA 是細胞增殖早期事件的敏感標記物。本研究結果顯示，高油酸、高糖及高糖高油酸聯(lián)合處理后Caspase-3 表達增加，PCNA 表達降低，意味著細胞凋亡增加，而增殖減少。相比較高油酸所模擬的高脂環(huán)境，高糖更容易對CHO 細胞產生影響，而高糖和高油酸聯(lián)合處理24 h 造成的糖脂代謝紊亂，對CHO 卵巢細胞的影響更明顯，也最符合肥胖伴有2 型糖尿病的糖脂代謝紊亂機體微環(huán)境。

AMPK-mTOR 是能量代謝的經(jīng)典信號通路，與生殖密切相關[17]，為進一步探尋高糖高油酸微環(huán)境影響卵巢細胞系CHO 細胞的作用機制，本研究對AMPK-mTOR 信號通路進行研究。腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）是能量代謝、細胞生長和自噬的重要調節(jié)劑，同時也是能量穩(wěn)態(tài)的外周和中樞調節(jié)劑，參與脂質、蛋白質和碳水化合物代謝[18]。肥胖癥、2 型糖尿病和代謝綜合征是能量平衡障礙，AMPK 對細胞和全身水平進行調節(jié)[19]。作為細胞和全身代謝的調節(jié)者，AMPK 已經(jīng)成為治療代謝紊亂（如肥胖病和2 型糖尿?。┑陌悬c[20]。在糖尿病和肥胖癥的幾種嚙齒動物模型中，AMPK 的藥理學激活導致多種代謝途徑的重塑，并導致疾病結果的實質性改善[21-25]。AMPK 與卵泡發(fā)育息息相關，研究[26-28]報道，不同物種的卵母細胞的不同細胞類型（卵母細胞、卵丘細胞、顆粒細胞和卵泡膜細胞）和黃體中鑒定出AMPK。mTOR是一種細胞質絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于磷酸肌醇3-激酶、PI3K 相關激酶家族，是細胞代謝、生長、增殖和存活的中心調節(jié)劑。研究表明，AMPK 信號通路的失調與代謝綜合征等疾病狀態(tài)有關[29]，高葡萄糖水平[30]以及過量飽和的脂肪酸[31-33]可抑制AMPK；mTOR 可被營養(yǎng)物質（葡萄糖、氨基酸和脂質）、生長因子、胰島素和炎性細胞因子激活[34-35]。本研究結果顯示，高糖高油酸可抑制AMPK 的表達并激活mTOR，可能是高糖高油酸調控CHO 細胞增殖和凋亡的重要途徑。

綜上所述，本研究通過在體外培養(yǎng)卵巢細胞系CHO 細胞時給予過量葡萄糖和油酸，模擬肥胖病、糖尿病、多囊卵巢綜合征等疾病造成的卵巢細胞系糖脂代謝紊亂微環(huán)境，并初步探討其導致細胞損傷的機制，為肥胖病、糖尿病、多囊卵巢綜合征等代謝紊亂性疾病卵巢損傷的研究提供了良好的體外細胞模型，并為代謝紊亂與生殖的相關機制研究提供了新的方法。