劉耀陽， 孫 岳， 劉太陽， 郝 瑋， 王秋實， 劉志宏

（寧夏醫(yī)科大學公共衛(wèi)生與管理學院，銀川 750004）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種以粥樣斑塊和纖維斑塊形成為特征的慢性炎癥性疾病[1]?！丁敖】抵袊?030”規(guī)劃綱要》也指出AS是我國一項亟待解決的公共衛(wèi)生問題。研究[2]表明，炎性反應參與AS 病變形成及進展過程，巨噬細胞作為炎性環(huán)境浸潤的最主要的免疫細胞之一，在AS 斑塊形成起始、進展、結(jié)局及斑塊破裂等一系列過程中均發(fā)揮重要作用[3]。在斑塊內(nèi)微環(huán)境的作用下，巨噬細胞一般活化為經(jīng)典活化型的M1 型以及替代活化型的M2 型，分別發(fā)揮致炎與抗炎的作用[4-5]。不同活化形式的巨噬細胞在能量代謝途徑存在明顯差異，M1 型活化過程中以糖酵解為主要供能途徑，M2 型活化過程中以氧化磷酸化為主要供能途徑。目前已證實巨噬細胞與代謝的關(guān)聯(lián)[6]，它可能通過抑制巨噬細胞糖酵解，促進巨噬細胞氧化磷酸化，調(diào)控并維持不同亞群巨噬細胞活化[7]，減輕AS 病變。

丙酮酸脫氫酶復合體（pyruvate dehydrogenase complex，PDHC）是定位在線粒體中的多酶復合物[8-9]，與細胞能量代謝相關(guān)，其中丙酮酸脫氫酶E1-α（pyruvate dehydrogenase E1-α，PDHA1）功能失調(diào)是導致PDHC 缺陷的主要原因[10]，PDHA1 表達水平的差異能夠引起巨噬細胞代謝的變化，進而打破M1/M2 型巨噬細胞活化平衡，在巨噬細胞炎性反應中發(fā)揮十分重要的調(diào)控作用。載脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）基因敲除小鼠廣泛應用于AS 動物模型及其并發(fā)癥的研究[11-12]。因此，為深入研究巨噬細胞中PDHA1 對能量代謝的影響、對巨噬細胞的調(diào)控維持作用及在AS 發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮的作用和分子機制，本課題組擬利用Cre-Loxp 重組酶系統(tǒng)技術(shù)，構(gòu)建并鑒定PDHA1 巨噬細胞條件性敲除小鼠和ApoE 基因敲除小鼠雜交的雙基因敲除小鼠模型，以期為進一步探究巨噬細胞PDHA1 在動脈粥樣硬化疾病發(fā)病中的作用及機制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗動物為PDHA1loxp1/loxp1小鼠、ApoE-/-小鼠及特異性啟動子驅(qū)動的Lyz2-Cre 工具鼠（均購自北京唯尚立德生物科技有限公司）。所有小鼠均在寧夏醫(yī)科大學實驗動物中心層流動物房，按照無特定病原級動物飼養(yǎng)標準喂養(yǎng)。小鼠喂以充足的嚙齒類動物繁殖飼料，自由進食和飲水，室內(nèi)溫度在20～22 ℃，濕度范圍40%～60%，12 h 光照/晝夜交替。實驗獲得寧夏醫(yī)科大學實驗動物中心實驗動物福利倫理審查委員會審查批準（編號：IACUC-NYLAC- 2021- 011）。

實驗儀器與試劑：DNA 裂解液［triton X、BME、Tris（pH 8.0）、蛋白酶K100 mg·L-1，中國天根公司］，DNA Marker（北京寶日醫(yī)生物科技有限公司），RNA 提取試劑（中國天根公司），蛋白提取試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司），PDHA1引物及Cre 引物（上海生物工程有限公司合成），反轉(zhuǎn)錄與熒光定量PCR 試劑盒（美國Thermo Fisher 公司），EB 類似物（GR501-01）及藍酶（南京諾唯贊生物科技有限公司），PDHA1 抗體、βactin 抗體（美國Abcam 公司）、辣根過氧化氫酶標記二抗（北京博奧森公司），瓊脂糖粉末（美國Invitrogen 公司）、PVDF 膜（上海索萊寶生物科技有限公司），熒光定量PCR 儀（上海楓嶺生物科技有限公司），手持式勻漿機（上海弗魯克科技發(fā)展有限公司），電泳儀及凝膠成像系統(tǒng)（美國Rio-Rad 公司）。

1.2 引物的設(shè)計與選取

引物根據(jù)Genbank 公布的小鼠PDHA1 基因序列（CT010294.1）和小鼠ApoE 基因序列（CT010294.1）篩選得出，設(shè)計檢測小鼠PDHA1基因打靶位點的引物及其定量引物，PDHA1-LOXP2上下游引物檢測floxp 插入情況，Lyz2-Cre 上下游引物檢測Cre 表達情況，ApoE-PM 上下游引物檢測ApoE KO 情況，見表1。

表1 引物名稱及序列

1.3 PDHA1f/f-Lyz2-Cre+小鼠品系構(gòu)建

小鼠雌、雄交配比例為1∶2。先將F1 代雄性小鼠（PDHA1f/w）與雌性表達Cre 酶小鼠（Lyz2-Cre+）互交，分析繁殖能力，后將獲得的F2 代雜合子PDHA1f/w-Lyz2-Cre+小鼠進行自然交配，13 周左右，鑒定和篩選后獲得F3 代純合子巨噬細胞PDHA1基因條件性敲除小鼠（PDHA1f/f-Lyz2-Cre+）。

1.4 PDHA1f/f-Lyz2-Cre+-ApoE-/-雙基因敲除小鼠品系構(gòu)建

小鼠雌、雄交配比例為1∶2。首先將F3 代的PDHA1f/f-Lyz2-Cre+小鼠與ApoE 基因敲除小鼠（ApoE-/-）進行交配，獲得F4 代PDHA1f/w-Lyz2-Cre+-ApoE+/-雜合子小鼠。隨后將F4 代中的PDHA1f/w-Lyz2-Cre+-ApoE+/-雜合子小鼠互相交配，鑒定和篩選后獲得F5 代PDHA1 巨噬細胞和ApoE 雙基因敲除小鼠（PDHA1f/f-Lyz2-Cre+-ApoE-/-）和對照組小鼠（PDHA1f/f-Lyz2-Cre--ApoE-/-）。

1.5 小鼠基因型鑒定

待鑒定小鼠生長至3 周齡時取小鼠一只腳趾置于1.5 mL 的EP 管中并做好標記，每只腳趾加入120 μL Lysis mix 液（每10 mL Lysis mix 液包含1 mL 10×MGB、50 μL 100% triton X、100 μL β-巰基乙醇，其余用ddH2O 補齊），在55 ℃水浴中過夜裂解，隨后95 ℃金屬浴中變性10 min。冷卻后，11 000 r·min-1離心5 min，上清液即獲得基因組DNA，用于后續(xù)的PCR 反應。

PCR 反應體系為10.69 μL：藍酶10 μL，上、下游引物各0.3 μL，含基因組DNA 的裂解產(chǎn)物0.59 μL。鑒定ApoE 和Lyz2-Cre 的PCR 反應條件相同：第一階段95 ℃預變性5 min；第二階段95 ℃變性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸42 s，共計進行40 個循環(huán)；第三階段72 ℃延伸5 min，16 ℃保存?zhèn)溆?。取PCR 擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，上樣量為5 μL，DNA Marker 5 μL，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

當PDHA1 基因擴增產(chǎn)物僅在263 bp 出現(xiàn)條帶時，小鼠為PDHA1-floxp 純合子小鼠；僅在297 bp 出現(xiàn)條帶時，小鼠為野生型小鼠；在263 bp 和297 bp 同時出現(xiàn)條帶時，小鼠為PDHA1-floxp 雜合子小鼠。當Lyz2-Cre 基因擴增產(chǎn)物在790 bp 出現(xiàn)條帶時，小鼠的基因型則為Lyz2-Cre+；在這一區(qū)間不出現(xiàn)條帶時，鑒定為野生型小鼠。當ApoE 基因擴增產(chǎn)物僅在428 bp 出現(xiàn)條帶時，鑒定為ApoE-/-小鼠；在428 bp 和346 bp 同時出現(xiàn)條帶時，鑒定為ApoE+/-小鼠；僅在346 bp 出現(xiàn)條帶時，鑒定為野生型小鼠。

1.6 標本處理

選取小鼠，5%水合氯醛水溶液0.5 mL/只麻醉處死。剪開小鼠腹部皮毛以暴露腹腔，將小鼠肝臟組織、脾臟組織取材備用。1）脾臟組織總RNA：將組織放入1.5 mL 無RNAase 的離心管中并加入約1 mL 裂解液RZ（按每50～100 mg 組織樣品加入裂解液RZ 1 mL），使用手持勻漿機將小鼠組織均勻攪碎成懸液，而后在勻漿儀中進行勻漿處理。在4 ℃12 000 r·min-1離心5 min，取上清液至新的無RNAase 離心管；加入200 μL 氯仿后充分振蕩以使其混合均勻，于室溫條件下靜置3 min 后在4 ℃12 000 r·min-1離心5 min，取水相經(jīng)洗脫后得到RNA 保存?zhèn)溆茫?）提取肝臟組織的蛋白：將組織放入EP 管中加入混有蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑與PMSF 的裂解液（lysis buffer）1 mL，使用手持勻漿機將小鼠組織均勻攪碎成懸液，而后在勻漿儀中進行勻漿處理。待測量蛋白濃度完畢后加入SDS-PAGE loading buffer 溶液，于99 ℃條件下將蛋白溶液高溫變性10 min，而后將冷卻后的蛋白溶液置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 利用q-PCR 技術(shù)分析脾臟組織中PDHA1 Loxp2 mRNA 以及PDHA1 mRNA 相對表達

利用紫外分光光度計測定脾臟總RNA 含量以及OD260/OD280的比值，選取OD260/OD280比值為1.8～2.1 的提取RNA，進行逆轉(zhuǎn)錄操作。合成cDNA作為模板進行q-PCR 反應，反應體系為20 μL，其中TB Gerrn Premix Ex TaqⅡ（2×）10 μL，上下游引物各0.8 μL，cDNA 模板2 μL，其余用滅菌水補齊。檢測PDHA1 Loxp2 mRNA 時反應條件為95 ℃10 s，60 ℃34 s，共計進行45 個循環(huán)，反應開始前95 ℃預熱30 s ；檢測PDHA1 mRNA 時反應條件為95 ℃5 s，57.2 ℃34 s，共計進行45個循環(huán)，開始前95 ℃預熱30 s。

1.8 利用Western blot 檢測兩組小鼠肝臟組織PDHA1 蛋白表達

取肝臟蛋白樣品20 μL，10%SDS-PAGE 制膠電泳恒壓80 V 后轉(zhuǎn)120 V。將載有蛋白的膠于恒流0.3 A 條件下轉(zhuǎn)膜120 min，再將轉(zhuǎn)過的PVDF 膜置于PBST 緩沖液配制的5%脫脂奶粉中封閉3 h。將PDHA1 以及β-actin 這兩種抗體按照說明書稀釋后，放入封閉后的PVDF 膜，于4 ℃下?lián)u床孵育過夜，使用PBST 緩沖液洗膜3次，每次10 min 以洗去殘存在膜上的抗體；二抗室溫孵育2 h，洗膜3 次，每次10 min 以洗去殘存在膜上的抗體。加入ECL 發(fā)光底物顯色后通過軟件Image Lab 曝光以測定灰度值。

1.9 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0 軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用t 檢驗。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠的繁殖情況

為得到PDHA1f/f-Lyz2-Cre+的最佳繁殖方案，本課題組將雄性PDHA1f/w小鼠與雌性表達Cre酶的Lyz2-Cre+小鼠互交，產(chǎn)生F2 代基因型小鼠［PDHA1f/w-Lyz2-Cre-（1/4），PDHA1w/w-Lyz2-Cre+（1/4），PDHA1w/w-Lyz2-Cre-（1/4）］；進一步將F2 代基因型小鼠PDHA1f/w-Lyz2-Cre+小鼠互相交配，產(chǎn)生F3 代基因型小鼠［PDHA1f/w-Lyz2-Cre+（3/8），PDHA1f/w-Lyz2-Cre-（1/8），PDHA1f/f-Lyz2 -Cre+（3/16），PDHA1f/f-Lyz2 -Cre-（1/16），PDHA1w/w-Lyz2-Cre+（3/16），PDHA1w/w-Lyz2-Cre-（1/16）］，其中PDHA1f/f-Lyz2-Cre+為PDHA1 巨噬細胞特異性基因敲除小鼠。

為了繁育出PDHA1f/f-Lyz2-Cre+-Apoe-/-小鼠，本課題組將前期獲得的F3 代基因型PDHA1f/f-Lyz2-Cre+小鼠與Apoe-/-小鼠進行交配，產(chǎn)生了F4 代基因型小鼠［PDHA1f/w-Lyz2-Cre+-Apoe+/-（1/2）、PDHA1f/w-Lyz2-Cre--Apoe+/-（1/2）］，隨后將選取基因型為PDHA1f/w-Lyz2-Cre+-Apoe+/-雌、雄小鼠進行自然交配，將產(chǎn)生的F5 代基因型小鼠［PDHA1f/f-Lyz2-Cre+-Apoe-/-小鼠、PDHA1f/f-Lyz2-Cre+-Apoe+/-小鼠及PDHA1f/w-Lyz2-Cre+-Apoe-/-］進行交配，約13 周后篩選鑒定出F6 代目標基因型PDHA1f/f-Lyz2-Cre+-Apoe-/-小鼠。以上繁育方案的分離比例均符合基本孟德爾遺傳定律，表明巨噬細胞條件性敲除PDHA1 基因后對小鼠繁殖能力無明顯影響。

2.2 小鼠基因型鑒定結(jié)果

將小鼠腳趾基因組DNA 進行擴增后電泳，共鑒定小鼠22 只，其中雄鼠14 只，雌鼠8 只。小鼠PDHA1-Floxp 基因型鑒定結(jié)果見圖1，在263 bp處陽性表達為PDHA1-floxp 純合子小鼠，在263 bp 和297 bp 處均陽性表達為PDHA1-floxp雜合子小鼠，僅在297 bp 處陽性表達為WT 野生型小鼠。將PDHA1-floxp 純合小鼠進行后續(xù)檢測。小鼠Lyz2-Cre 基因型鑒定結(jié)果見圖2。在790 bp 處陽性表達為Lyz2-Cre+小鼠，否則為野生型小鼠。將帶有Lyz2-Cre+基因的小鼠再進行后續(xù)鑒定，小鼠ApoE 基因型鑒定結(jié)果見圖3。僅在428 bp 處陽性表達為ApoE-/-純合子小鼠，在428 bp 和346 bp 處均陽性表達為ApoE+/-小鼠，僅在346 bp 處陽性表達為野生型小鼠。而最終鑒定為ApoE-/-純合子小鼠即為構(gòu)建成功的雙基因敲除小鼠，其中雄鼠3 只，雌鼠2 只。

圖1 PDHA1-Floxp 基因鑒定結(jié)果

圖2 Lyz2-Cre 基因鑒定結(jié)果

圖3 PCR 擴增ApoE 基因鑒定結(jié)果

2.3 PDHA1 基因條件性敲除效果鑒定

提取小鼠脾臟組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，使用PDHA1 Loxp2 mRNA 和PDHA1 引物進行PCR 擴增。與WT 小鼠相比，PDHA1 在巨噬細胞中特異性敲除的小鼠的PDHA1 Loxp2 mRNA表達升高，PDHA1 mRNA 的表達降低（P 均＜0.05），見圖4。

圖4 PDHA1 巨噬細胞特異性敲除小鼠脾臟中PDHA1 Loxp2 mRNA 和PDHA1 mRNA 的表達水平（n=6）

提取小鼠肝臟組織總蛋白，進行Western blot檢測。結(jié)果顯示：與對照組相比，PDHA1 在巨噬細胞中特異性敲除小鼠的PDHA1 蛋白含量降低（P<0.05），見圖5。

圖5 PDHA1 巨噬細胞特異性敲除小鼠肝臟中PDHA1 蛋白表達水平（n=6）

3 討論

PDHA1 是PDHC 的重要組成部分，可通過改變巨噬細胞能量代謝的方式來影響其極化方式，進而打破促炎作用與抗炎作用的平衡。PDHA1的活躍可促進M2 型活化，表現(xiàn)為AS 病變減輕，提示PDHA1 在細胞組織生長、發(fā)育、生理狀態(tài)維持方面發(fā)揮重要作用。本研究采用Cre-LoxP重組酶系統(tǒng)復制Pdha1f/f-Lyz2-Cre+小鼠，并與Apoe-/-進行交配，得到Pdha1f/f-Lyz2-Cre+-Apoe-/-巨噬細胞特異性雙基因敲除小鼠，運用q-PCR和Western blot 技術(shù)檢測巨噬細胞PDHA1 在小鼠脾臟和肝臟中的敲除效率后，發(fā)現(xiàn)脾臟和肝臟的PDHA1 mRNA 和蛋白表達水平均降低，同時利用基因型鑒定檢測了ApoE 的敲除效率，證明成功復制了Pdha1f/f-Lyz2-Cre+-Apoe-/-巨噬細胞特異性雙基因敲除小鼠模型，為后續(xù)深入研究PDHA1在AS 斑塊中的作用機制奠定基礎(chǔ)。

基因敲除技術(shù)分為完全基因敲除和條件型基因敲除。前者通過同源重組法消除個體靶基因活性，但因為PDHA1 基因?qū)ε咛グl(fā)育至關(guān)重要，該技術(shù)可致死小鼠[13]，因此本課題組采用后者中Cre-LoxP 重組酶系統(tǒng)來克服這一缺陷。Cre-LoxP重組系統(tǒng)是一種位點特異的基因重組技術(shù)，目前正廣泛應用于新型基因打靶中[14-15]，該重組酶系統(tǒng)可在特異性的時間或空間介導目的基因的敲除。其基本原理為同源重組技術(shù)，被廣泛應用于特異位點的基因敲除、基因插入、基因翻轉(zhuǎn)和基因易位，重組后的染色體常?？杀磉_出新的性狀，在真核生物和原核生物中均有廣泛應用[16]。Cre 重組酶是一種特異性位點重組酶，當目的基因序列位于兩個序列方向相同的LoxP 之間時，就可被介導特異性重組[17]，使得該基因序列被刪除。此次研究利用PDHA1f/w小鼠與Cre+小鼠雜交繁殖數(shù)代后q-PCR 技術(shù)篩選，得到了基因型為PDHA1f/f-Lyz2-Cre+小鼠[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠生長繁殖的過程當中，敲除后的小鼠在體質(zhì)量、形態(tài)等方面與對照小鼠相比并無明顯差異，表明此次基因敲除并不影響其他組織及器官的正常功能與效應。

此外，由于特異性敲除的巨噬細胞在動物體內(nèi)分布并不均勻，所以本課題組選擇了肝臟和脾臟這兩個巨噬細胞含量較多的組織進行驗證[18]。在構(gòu)建的PDHA1 基因敲除小鼠其脾臟組織中PDHA1mRNA 表達水平低于對照組，其肝臟組織中PDHA1 蛋白表達水平也較對照組下降，提示誘導性敲除PDHA1 的轉(zhuǎn)基因小鼠造模成功。

綜上所述，采用Cre-LoxP 技術(shù)可成功構(gòu)建PDHA1f/f-Lyz2-Cre+-ApoE-/-小鼠模型。該模型小鼠可為深入探討能量代謝和巨噬細胞的關(guān)系、PDHA1 在AS 發(fā)生發(fā)展中的作用機制提供動物實驗基礎(chǔ)。