高亞桃，劉智慧，李 妍，劉勝麗，郭姚蕊，馬亞賓，蔣桂娥，劉志勇，秦建華*，趙月蘭* (.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河北 保定 0700；.河北省畜牧良種工作站， 河北 石家莊 05006； .河北省唐山市動(dòng)物疫病防控中心，河北 唐山 06400)

犢牛感染性腹瀉是奶牛養(yǎng)殖過(guò)程中常見(jiàn)的一種臨床癥狀，嚴(yán)重影響犢牛健康，進(jìn)而影響優(yōu)質(zhì)畜產(chǎn)品和乳制品的生產(chǎn)，給養(yǎng)牛業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。犢牛腹瀉是由多種原因引起的，主要有感染性腹瀉和飲食性腹瀉，感染性腹瀉是引起犢牛發(fā)病和死亡的主要原因，臨床上以腹瀉、發(fā)熱等為主要特征，致使?fàn)倥Ｃ撍?、機(jī)體水鹽代謝失衡、酸中毒等，嚴(yán)重的可導(dǎo)致死亡[1-2]。感染性腹瀉主要包括病毒、細(xì)菌和寄生蟲(chóng)性腹瀉，病毒主要有牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhoea virus，BVDV)、牛冠狀病毒(bovine coronavirus，BCoV)、牛輪狀病毒(bovine rotavirus， BRV)、牛傳染性鼻氣管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV)等，細(xì)菌主要有大腸桿菌(Escherichiacoli)和沙門(mén)菌(Salmonella)等，寄生蟲(chóng)主要有牛隱孢子蟲(chóng)(Cryptosporidiumbovis)和牛球蟲(chóng)(Bovinecoccidia)等[3]。新生犢牛免疫力低下，極易感染多種病原，BVDV、BCoV、BRV、IBRV、牛隱孢子蟲(chóng)、大腸桿菌這幾種病原常呈單一感染或混合感染，嚴(yán)重危害犢牛健康。河北省是養(yǎng)殖大省，近年來(lái)，在乳制品行業(yè)中取得了可觀的經(jīng)濟(jì)效益，占據(jù)重要地位，但是犢牛腹瀉已嚴(yán)重阻礙養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展，良好地培育犢牛健康生長(zhǎng)尤為重要，因此，本研究旨在調(diào)查河北省內(nèi)致?tīng)倥８篂a主要病原及分布特征，以期為犢牛腹瀉的有效防控提供科學(xué)數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 發(fā)病情況和被檢樣品自河北省邢臺(tái)、衡水、石家莊、滄州、保定、唐山、廊坊和張家口8個(gè)地區(qū)選取發(fā)病牛場(chǎng)，犢牛表現(xiàn)為腹瀉、發(fā)熱、脫水、排稀粥樣糞便，部分帶血，且表現(xiàn)為呼吸困難、食欲廢絕等現(xiàn)象，腹瀉率高達(dá)50%，病牛腹瀉嚴(yán)重、逐漸消瘦，并有部分牛只死亡。在發(fā)病牛場(chǎng)中采集犢牛腹瀉糞便樣品775份，對(duì)其進(jìn)行BVDV、BCoV、BRV、IBRV、隱孢子蟲(chóng)和大腸桿菌6種病原的檢測(cè)。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank上登錄的BVDV 5′UTR基因、BCoVN基因、BRVVP6基因和IBRVgB基因序列，利用Primer 5.0設(shè)計(jì)4對(duì)特異性引物，并參照文獻(xiàn)中隱孢子蟲(chóng)18S rRNA引物[4]和大腸桿菌16S rRNA通用引物[5]序列合成引物，引物均由上海生工生物工程有限公司合成，合成后的引物置于-20℃保存?zhèn)溆?，引物序列信息?jiàn)表1。

表1 本試驗(yàn)所用引物序列

1.3 BVDV、BCoV、BRV、IBRV、大腸桿菌和牛隱孢子蟲(chóng)基因組的提取BVDV、BCoV和BRV 3種病原的鑒定利用RT-PCR方法，IBRV、大腸桿菌和牛隱孢子蟲(chóng)利用PCR方法進(jìn)行鑒定。

自采集的犢牛腹瀉糞便樣品中提取BVDV、BCoV、BRV和IBRV基因組，大腸桿菌基因組和隱孢子蟲(chóng)卵囊基因組。病毒基因組的提取方法參照全式金生物科技有限公司EasyPure?Viral DNA/RNA Kit進(jìn)行操作，大腸桿菌和隱孢子蟲(chóng)卵囊全基因組DNA的提取參照天根生化科技(北京)有限公司的糞便DNA試劑盒進(jìn)行操作，具體操作步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4 BVDV、BCoV、BRV、IBRV、大腸桿菌和牛隱孢子蟲(chóng)基因組的PCR擴(kuò)增將提取得到的BVDV、BCoV、BRV的RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以BVDV、BCoV、BRV的cDNA為模板，分別利用BVDV-F/R、BCoV-F/R和BRV-F/R特異性引物(表1)進(jìn)行基因片段的PCR擴(kuò)增。以提取的IBRV、牛隱孢子蟲(chóng)和大腸桿菌 DNA為模板，分別以IBRV-F/R和18S rRNA-F/R特異性引物及16S rRNA-F/R通用引物(表1)進(jìn)行基因片段的PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系均為20 μL，2×Phanta Max Master Mix 10 μL，引物上、下游各1 μL，cDNA/DNA模板各2 μL，ddH2O補(bǔ)足20 μL。將上述加樣完成的20 μL試劑吹吸混勻，利用6對(duì)引物按照以下PCR反應(yīng)條件分別進(jìn)行擴(kuò)增：預(yù)變性95℃ 5 min；變性94℃ 30 s，退火57℃ 30 s(BVDV-F/R、IBRV-F/R)，延伸72℃ 60 s，共35個(gè)循環(huán)；終延伸72℃ 10 min。預(yù)變性95℃ 5 min；變性94℃ 30 s，退火55℃ 30 s(BCoV-F/R)，延伸72℃ 45 s，共35個(gè)循環(huán)；終延伸72℃ 10 min。預(yù)變性95℃ 5 min；變性94℃ 30 s，退火56℃ 30 s(BRV-F/R)，延伸72℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)；終延伸72℃ 10 min。預(yù)變性95℃ 5 min；變性94℃ 30 s，退火55℃ 30 s(18S rRNA-F/R、16S rRNA-F/R)，延伸72℃ 60 s，共35個(gè)循環(huán)；終延伸72℃ 10 min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取5 μL PCR產(chǎn)物，用1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳鑒定。

2 結(jié)果

2.1 BVDV、BCoV、BRV、IBRV、牛隱孢子蟲(chóng)和大腸桿菌PCR檢測(cè)結(jié)果從河北省8個(gè)地區(qū)多個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)采集775份犢牛腹瀉樣本，經(jīng)提取病毒核酸，利用各種病毒特異性引物進(jìn)行PCR檢測(cè)。結(jié)果表明，775份犢牛腹瀉臨床樣品中，有205份樣品在189 bp 處出現(xiàn)明亮的特異性條帶(圖1)，BVDV檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，陽(yáng)性率為27.11%；有137份在178 bp 處出現(xiàn)明亮的特異性條帶(圖2)，BCoV檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，陽(yáng)性率為17.52%；有77份樣品在144 bp處出現(xiàn)明亮的特異性條帶(圖3)，BRV檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，陽(yáng)性率為9.85%；有29份糞便樣品在209 bp處出現(xiàn)明亮的特異性條帶(圖4)，IBRV檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，陽(yáng)性率為3.71%；有96份樣品在1 188 bp處出現(xiàn)明亮的特異性條帶(圖5)，隱孢子蟲(chóng)檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，陽(yáng)性率為12.28%；還有160份糞便樣品在1 500 bp處出現(xiàn)明亮的特異性條帶(圖6)，大腸桿菌檢測(cè)為陽(yáng)性，陽(yáng)性率為20.46%；其中有71份樣品未檢測(cè)出目的病原。從上述檢測(cè)結(jié)果可見(jiàn)，在河北省部分地區(qū)采集的奶牛腹瀉糞便中，BVDV檢測(cè)陽(yáng)性率最高為27.11%，是河北省部分奶牛場(chǎng)致?tīng)倥８篂a的主要病原之一，且唐山和張家口2個(gè)地區(qū)奶牛場(chǎng)BVDV感染率高于其他6個(gè)地區(qū)(表2)。

M.DL2000 DNA Marker；1～2.被檢樣品；3.陰性對(duì)照?qǐng)D1 BVDV PCR檢測(cè)結(jié)果

M.DL2000 DNA Marker；1～2.被檢樣品；3.陰性對(duì)照?qǐng)D2 BCoV PCR檢測(cè)結(jié)果

M. DL2000 DNA Marker；1～2.被檢樣品；3.陰性對(duì)照?qǐng)D3 BRV PCR檢測(cè)結(jié)果

M. DL2000 DNA Marker；1～5.被檢樣品；6.陰性對(duì)照?qǐng)D4 IBRV PCR檢測(cè)結(jié)果

M. DL2000 DNA Marker；1～2.被檢樣品；3.陰性對(duì)照?qǐng)D5 大腸桿菌 PCR檢測(cè)結(jié)果

M. DL2000 DNA Marker；1～2.被檢樣品；3.陰性對(duì)照?qǐng)D6 隱孢子蟲(chóng)PCR檢測(cè)結(jié)果

表2 河北省部分地區(qū)致?tīng)倥８篂a主要病原PCR檢測(cè)結(jié)果 份

2.2 多重病原檢測(cè)結(jié)果在775份樣品中，選取臨床癥狀嚴(yán)重且病程較長(zhǎng)的117份樣品進(jìn)行多種病原檢測(cè)，結(jié)果表明，6種病原之間存在二重、三重和四重感染(表3～5)。

表3 二重病原感染情況

表4 三重病原感染情況

表5 四重病原感染情況

2.3 不同采樣季節(jié)與BVDV感染情況結(jié)果從2019年1月到2021年1月對(duì)從河北省不同地區(qū)采集的奶牛糞便進(jìn)行PCR檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果表明，春季BVDV的檢出率為9.93%，夏季BVDV檢出率為6.92%，秋季BVDV的檢出率為31.92%，冬季BVDV檢出率為40.21%，在秋冬季節(jié)BVDV的檢出率較高，高于春季和夏季，尤其是冬季檢出率最高，春夏兩季BVDV的感染率沒(méi)有明顯差異(表6，圖7)。

圖7 不同季節(jié)奶牛BVDV檢測(cè)結(jié)果

表6 不同季節(jié)奶牛BVDV檢測(cè)結(jié)果

2.4 不同采樣地點(diǎn)與BVDV感染情況結(jié)果從河北省8個(gè)地區(qū)采集的775份奶牛糞便樣品，經(jīng)過(guò)PCR檢測(cè)，結(jié)果表明，不同地區(qū)BVDV的感染率存在明顯差異，其中，唐山奶牛場(chǎng)BVDV感染率最高為39.17%，張家口次之,感染率為38.16%，衡水感染率最低為8.05%，其他5個(gè)地區(qū)邢臺(tái)、石家莊、滄州、保定、廊坊奶牛場(chǎng)BVDV的感染率分別為13.24%,11.46%，23.81%，29.23%和19.57%(表7，圖8)。

表7 不同地區(qū)奶牛BVDV檢測(cè)結(jié)果

3 討論

犢牛感染性腹瀉病是由多種病原引起的嚴(yán)重危害犢牛健康的接觸性傳染病[6]，致?tīng)倥８篂a的病原主要包括病毒、細(xì)菌和寄生蟲(chóng)，嚴(yán)重影響犢牛的生長(zhǎng)發(fā)育，對(duì)養(yǎng)牛業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[7]。引起犢牛腹瀉的病毒主要有BVDV、BCoV、BRV和IBRV等[8]。BVDV屬于黃病毒科瘟病毒屬，是單股正鏈RNA病毒，感染該病毒的牛主要表現(xiàn)為腹瀉、黏膜發(fā)紺、消化道黏膜糜爛、免疫耐受和持續(xù)性感染等[2]，危害嚴(yán)重，呈世界范圍分布。BCoV屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬，為不分段的單股正鏈RNA病毒，是引起犢牛腹瀉和呼吸道感染的重要病原[9]，感染BCoV的犢牛主要表現(xiàn)為腹瀉，也可導(dǎo)致成年牛冬痢，呼吸道感染引起牛肺炎等[10]。BRV屬于呼腸孤病毒科，輪狀病毒屬，是引起犢牛腹瀉的主要病原之一，患病牛以排水樣稀糞為主要特征，多可引起繼發(fā)感染，且該病原呈世界性分布[11]。IBRV可引起牛一種急性、熱性、接觸性傳染病，該病毒是雙股DNA病毒[12]，感染該病毒的牛主要表現(xiàn)為呼吸道癥狀，也是引起牛腸炎型腹瀉的重要病原之一，患病牛有時(shí)可出現(xiàn)帶血性腹瀉，新生犢牛可表現(xiàn)為腹瀉呈水樣、脫水、精神萎靡、機(jī)體衰竭等[13]。致病性大腸桿菌(Escherichiacoli)是引起犢牛腹瀉、脫水、酸中毒等為主要特征的一種急性傳染病[14]，大腸桿菌病在各個(gè)國(guó)家都有發(fā)生，10日齡以內(nèi)的犢牛最為易感，也是導(dǎo)致1月齡左右犢牛死亡的主要原因之一。引起犢牛腹瀉的寄生蟲(chóng)主要是隱孢子蟲(chóng)，隱孢子蟲(chóng)屬于隱孢子科(Cryptosporididae)、隱孢子屬(Cryptosporidium)寄生性原蟲(chóng)，是引起腹瀉的3種最普通的腸道病原之一[15]。隱孢子蟲(chóng)病(Cryptosporidiosis)是由隱孢子蟲(chóng)寄生于人類和動(dòng)物呼吸道或消化道上皮細(xì)胞，引起以腹瀉為主要臨床癥狀的腸道原蟲(chóng)病[16]。隱孢子蟲(chóng)可感染多種脊椎動(dòng)物和人類，最易感的是幼齡動(dòng)物，是新生犢牛腹瀉的主要病原之一[17]。牛最易感的隱孢子蟲(chóng)類型主要包括微小隱孢子蟲(chóng)、安氏隱孢子蟲(chóng)、牛隱孢子蟲(chóng)、瑞氏隱孢子蟲(chóng)等4種[18]。隱孢子蟲(chóng)對(duì)外界環(huán)境抵抗力強(qiáng)，能夠在潮濕、陰冷的環(huán)境中存活約6個(gè)月，當(dāng)易感動(dòng)物接觸到有活性的卵囊時(shí)，很容易被感染。奶牛是隱孢子蟲(chóng)自然感染的主要?jiǎng)游镏?，研究者就隱孢子蟲(chóng)導(dǎo)致?tīng)倥８篂a這一問(wèn)題進(jìn)行了很多研究，但卵囊的寄生路徑、脫囊后所寄生的位置和作用機(jī)制等問(wèn)題還未完全掌握，有待進(jìn)一步研究。犢牛腹瀉病已嚴(yán)重?fù)p害犢牛健康，無(wú)論在國(guó)內(nèi)還是國(guó)外都造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[19]，因此，研究引起犢牛腹瀉的主要病原具有重要意義。

本研究對(duì)從河北省8個(gè)地區(qū)采集的775份糞便進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)BVDV 5′UTR基因、BCoVN端基因、BRVVP6基因和IBRVgB基因分別設(shè)計(jì)特異性引物，對(duì)這4種病毒進(jìn)行PCR檢測(cè)，同時(shí)參照文獻(xiàn)中隱孢子蟲(chóng)特異性引物和大腸桿菌通用引物對(duì)隱孢子蟲(chóng)和大腸桿菌進(jìn)行PCR檢測(cè)。其中BVDV檢出205份陽(yáng)性，BCoV檢出137份陽(yáng)性，BRV檢出77份陽(yáng)性，IBRV檢出29份陽(yáng)性，隱孢子蟲(chóng)檢出96份陽(yáng)性，大腸桿菌檢出160份陽(yáng)性，另外還有71份糞便樣品未檢出病原。就BVDV檢測(cè)陽(yáng)性率高低地區(qū)進(jìn)行分析，唐山和張家口2個(gè)地區(qū)奶牛場(chǎng)BVDV感染率明顯高于其他6個(gè)地區(qū)，由于張家口地區(qū)位于河北省北部，冬季環(huán)境寒冷，犢牛在寒冷的環(huán)境極易引起腹瀉，容易繼發(fā)感染其他病原，所以環(huán)境寒冷應(yīng)該是張家口地區(qū)BVDV陽(yáng)性率高的原因之一；唐山地區(qū)地處河北省東北部，該地區(qū)水源豐富，空氣濕潤(rùn)，犢牛經(jīng)常處于潮濕環(huán)境下會(huì)造成抵抗力下降，飲食不佳，繼而較容易引起疾病，腹瀉就是一種較常見(jiàn)的疾病。因此當(dāng)?shù)啬膛?chǎng)應(yīng)該給予重視，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，做好預(yù)防工作。經(jīng)調(diào)查，秋、冬季節(jié)BVDV的檢出率較高，明顯高于春季和夏季，尤其是冬季檢出率最高，因此在秋、冬季節(jié)，牛場(chǎng)要注意給牛群做好保暖，及時(shí)清除污糞，勤換墊草墊料等，為犢牛的生長(zhǎng)提供舒適的環(huán)境。本研究對(duì)河北省8個(gè)地區(qū)采集的犢牛腹瀉糞便樣品經(jīng)過(guò)檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BVDV的檢出率最高，為27.11%，表明BVDV是河北省部分地區(qū)致?tīng)倥８篂a的主要病原，這一研究為河北省內(nèi)致?tīng)倥８篂a病原的調(diào)查提供科學(xué)數(shù)據(jù)支持，為犢牛腹瀉病的防制提供方向，對(duì)河北省內(nèi)BVDV的防控具有重要意義。

對(duì)檢出病原的犢牛應(yīng)針對(duì)病情給予治療，另外，要加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，為犢牛生長(zhǎng)發(fā)育提供適宜的環(huán)境；對(duì)于71份糞便樣品未檢出病原這一結(jié)果進(jìn)行分析，原因有以下幾個(gè)方面：第一，被檢的牛只出現(xiàn)的腹瀉，不是這幾種病原引起的，引起犢牛腹瀉的病原有很多，除本研究著重檢測(cè)的6種病原外，還有BPV、諾如病毒(bovine Norovirus，BNoV)、牛球蟲(chóng)等多種病原[20-22]，對(duì)導(dǎo)致?tīng)倥８篂a的其他病原應(yīng)引起重視，防制結(jié)合，為犢牛生長(zhǎng)提供良好的大環(huán)境；第二，由于糞便樣品中病原含量少，沒(méi)有達(dá)到普通PCR能檢出的最低限。因此，針對(duì)致?tīng)倥８篂a病原建立敏感性較高的檢測(cè)方法具有重要意義，為臨床上研究犢牛腹瀉病原提供一種快速、有效的手段迫在眉睫。