張 黎，鄭龍龍，呂曉玲，白 瑞，霍乃蕊，鄭明學(xué) (山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801)

豬圓環(huán)病毒3型(porcine circovirus 3，PCV-3)可引起一種免疫抑制疾病，常表現(xiàn)出皮炎腎病綜合征、繁殖功能障礙、呼吸系統(tǒng)疾病和多系統(tǒng)炎癥等相關(guān)的疫病，對我國部分感染豬場的疫病防控造成巨大的困難[1-2]。2015年我國研究者通過PCV-3核酸檢測發(fā)現(xiàn)部分種豬群中存在30%的PCV-3核酸陽性，常引起母豬流產(chǎn)、仔豬腹瀉和呼吸系統(tǒng)癥狀為主的臨床癥狀，在臨床生產(chǎn)中對仔豬的危害性最大，且隨著種豬及仔豬的調(diào)運(yùn)，流行范圍呈不斷擴(kuò)大的趨勢[3-4]。

安全高效的疫苗是防控一切病毒性疾病的首選，但目前尚無PCV-3商品化疫苗可用。降低母豬帶毒量，減少病毒垂直傳播給仔豬的載量，可能是當(dāng)前最簡便的防控方式。PCV ORF2基因編碼病毒的衣殼蛋白(capsid protein,Cap)作為PCV唯一的結(jié)構(gòu)蛋白和主要的免疫保護(hù)性抗原，以其為靶抗原研制的PCV-2基因工程疫苗備受青睞[5]。湛洋等[6]通過對PCV-2與PCV-3 Cap結(jié)構(gòu)和抗原性的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)二者具有較大的差異，推測不存在交叉免疫保護(hù)能力。

本研究通過對比山西省某商品母豬場免疫PCV-2疫苗29個月內(nèi)的ORF2基因陽性率、豬群臨床癥狀、育肥期生產(chǎn)成績，并對PCV-3-CN-SX1-2019(NMDC序列號：NMDCN0000NPN)、PCV-3-CN-SX2-2019(NMDC序列號：NMDCN0000NPO)、PCV-3-CN-SX1-20209(NMDC序列號：NMDC-N0000NPP)、PCV-3-CN-SX2-2020(NMDC序列號：NMDCN0000NPQ)、PCV-3-CN-SX1-2021(NMDC序列號：NMDCN0000NPR)、PCV-3-CN-SX2-2021(NMDC序列號：NMDCN0000NPS)進(jìn)行部分分子生物學(xué)分析，了解其與我國部分其他省份的PCV同源性，為深入研究我國PCV-3的遺傳變異及其生物學(xué)特性以及評估母豬免疫PCV-2疫苗對仔豬PCV-3病毒學(xué)和病理學(xué)方面的交叉保護(hù)作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源2018年10月到2021年5月連續(xù)從山西省某500頭種豬未免疫過PCV-2疫苗的商品母豬場連續(xù)采購6批次12～17 kg保育豬，每批次1 000頭左右。回場1周內(nèi)(10～11周齡)均出現(xiàn)不同程度的腹式呼吸、黏稠黃白色鼻涕、耳尖及臀部充血發(fā)紺、皮膚出現(xiàn)紅色丘疹、皮毛粗亂、豬群扎堆等癥狀，用藥效果不顯著，傷亡率達(dá)25.5%；經(jīng)實驗室ORF-2基因和細(xì)胞病理學(xué)診斷確診為PCV-2、PCV-3及PRRSV共同感染。種豬群免疫PCV-2疫苗及使用藥物控制方案后，所產(chǎn)仔豬全期傷亡率從25.5%逐漸降低到8.0%；采集6批次60～70日齡15～20 kg病死豬組織樣品120份(每批次20份)，并對樣品進(jìn)行100℃煮沸處理后于-20℃冷凍保存，對PCV-3 ORF2基因進(jìn)行核酸檢測與基因測序，了解仔豬群PCV-3感染情況及ORF2基因進(jìn)化規(guī)律。

1.2 試驗材料QI Aamp DNA MiniKit(QIAN-GE)，EasyTap聚合酶(TaKaRa)，DL1000 DNA Marker(Biomed)，其他化學(xué)試劑均從Sigma-Aldrich公司購買。

1.3 樣品處理取100 mg冰凍的淋巴結(jié)進(jìn)行充分研磨，加入1 mL PBS液反復(fù)凍融3次，10 000 r/min離心5 min，取上清液0.2 mL提取DNA。

1.4 基因擴(kuò)增參考WEN等[7]報道的方法對發(fā)病豬組織中的PCV-3 ORF2基因進(jìn)行檢測(F:5′-ATTATGGATGCTCCTCATCGTG-3′，R:5′-CA-TCTTCTCCGCAACTTCAGTC-3′)。反應(yīng)條件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，35個循環(huán)；72℃延伸7 min。

1.5 基因序列測定與分析將鑒定為陽性的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序分析，利用NCBI BLAST、DNAStar和Mega 5.0等生物學(xué)軟件，分別對PCV-3 ORF2基因序列進(jìn)行比對和遺傳進(jìn)化分析，并與國內(nèi)外部分已知的參考序列進(jìn)行比較并繪制遺傳進(jìn)化樹，參考序列見表1。

表1 PCV-3毒株參考序列及其來源

1.6 磷酸化分析使用NetPhos 3.1 Server進(jìn)行氨基酸磷酸化預(yù)測，為制備抗原、磷酸化抗體及基因突變研究提供理論依據(jù)。

1.7 信號肽預(yù)測使用SignalP-5.0 Server對Cap蛋白氨基酸N端進(jìn)行信號肽預(yù)測，預(yù)測其促進(jìn)蛋白分泌到胞外的能力。

1.8 跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測使用TMHMM Server v.2.0進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測，根據(jù)胞外區(qū)(outside)、胞內(nèi)區(qū)(inside)、跨膜區(qū)(transmembrane)的數(shù)值預(yù)測在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的潛力，數(shù)值越大表示該氨基酸位于該區(qū)的可能性越大。

2 結(jié)果

2.1 同源性分析測序結(jié)果顯示，共獲得6株長度為252 bp PCV-3 ORF2基因。利用生物學(xué)軟件DNAStar對基因序列與23條PCV序列進(jìn)行核苷酸同源性分析，結(jié)果表明，此次從死亡仔豬淋巴結(jié)內(nèi)分離出的PCV-3-CN-SX1-2019、PCV-3-CN-SX2-2019、PCV-3-CN-SX1-2020、PCV-3-CN-S1-2020、PCV-3-CN-SX1-2021及PCV-3-CN-SX2-2021毒株同源性為98.4%～99.2%；6株序列與PCV-2a(32.5%～32.9%)、HBxz-PCV2a(32.5%～32.9%)、XJ0904-PCV2a (32.5%～32.9%)同源性32.5%～32.9%；與GXHP-PCV-2b(31.2%～31.7%)、BJ0401-PCV2b(31.2%～31.7%)、SXTY-PCV-2b(30.8%～31.2%)同源性30.8%～31.7%；與XJ16-MD05-PCV2d(33.1%～33.5%)、CBNU0324-PCV-2d(32.6%～33.1%)同源性32.6%～33.5%；與HNU-AHZ-2019-PCV-4同源性33.9%～34.3%。6株序列ORF2基因與PCV-3 ORF2基因同源性為97.2%～99.6%，屬于PCV-3基因型(圖1)。

圖1 PCV-3 ORF2基因同源性分析

6株P(guān)CV-3 ORF2基因與PCV-2a、PCV-2d、PCV-3、PCV-4進(jìn)行基因進(jìn)化樹分型，結(jié)果顯示與PCV-3基因型2012—2015年分離的浙江株ZJ-HB347-20120914、ZJ-459-20130424、ZJ-592-201408-01、ZJ-526-20150703，湖南2018年分離的PCV3-YiY-1-11、PCV3-YiY-2-11及新疆2018年分離的CN-Xinjiang-AL15-2018進(jìn)化同步。與其他地域PCV-3基因型分離株P(guān)CV3-CH-Beijing-1-2016、PCV3-CN-HeNan17、YM2018-YN、CN-Xinjiang-AL15-2018、PCV3-CN-HLJ-p6-2018、FJ65、PCV3-CN-JL-JL44-2019，PCV-2a、PCV-2d、PCV-4進(jìn)化不同步(圖2)。

圖2 PCV-3 ORF2基因遺傳進(jìn)化分析

2.2 氨基酸殘基磷酸化預(yù)測結(jié)果顯示，獲得的6株P(guān)CV-3 ORF2基因均有17個磷酸化位點(diǎn)，其中11個蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)位點(diǎn)，3個Ⅰ型酪蛋白激酶(casein kinase Ⅰ,CKI)位點(diǎn)，3個沒有特異性激酶預(yù)測結(jié)果位點(diǎn)(unsp kinase,UNSP)(表2，圖3)。

表2 Cap蛋白氨基酸殘基磷酸化預(yù)測

圖3 PCV-3 Cap蛋白氨基酸殘基磷酸化預(yù)測

2.3 信號肽預(yù)測6株P(guān)CV-3 ORF2基因編碼的Cap蛋白氨基酸均未預(yù)測到信號肽的潛在可能性，蛋白 N 末端不存在典型的信號肽結(jié)構(gòu)。

2.4 跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測6株P(guān)CV-3 ORF2基因編碼的Cap蛋白氨基酸位于胞外區(qū)的可能性最大，均未預(yù)測到跨膜結(jié)構(gòu)存在的潛在可能性(圖4)，蛋白可在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。

表3 Cap蛋白信號肽預(yù)測

圖4 PCV-3 Cap蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測

3 討論

2018年10月到2021年5月連續(xù)從未免疫過PCV-2疫苗的商品母豬場采購6批次10周齡保育豬，全期傷亡率(8.0%～25.5%)。本研究從病死仔豬淋巴組織中獲得6株P(guān)CV-3 ORF2基因，其與PCV-3基因型2012-2015年分離的浙江株、2018年湖南及新疆分離株進(jìn)化同步；與1999-2020年分離的北京、河南、云南、黑龍江、福建、吉林等地區(qū)PCV-3、PCV-2a、PCV-2d、PCV-4基因型毒株進(jìn)化不同步；磷酸化位點(diǎn)、信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)等預(yù)測結(jié)果一致，氨基酸進(jìn)化同步。

健康豬群免疫高效商品疫苗是目前獸醫(yī)臨床上防控PCV-2的最主要手段，通過使用疫苗已經(jīng)基本控制住疫情的大流行[8-12]。檢測數(shù)據(jù)顯示，我國部分地區(qū)PCV-3感染率呈逐年增加的趨勢，但是目前鮮有報道PCV-3有安全有效的商品疫苗[13-15]。該病的防控面臨著極大的困難，需要對其進(jìn)行流行病學(xué)的持續(xù)調(diào)查和疫苗防控手段以外措施的不斷探討。

我國各地豬場在2018年后減少了疫苗的使用，部分豬場PCV-2疫苗長期不免疫或降低免疫頻次用于減少非洲豬瘟傳入的風(fēng)險，造成地域性或個別場區(qū)種豬群PCV常年帶毒生產(chǎn)，臨床中時有斷奶仔豬出現(xiàn)皮炎腎炎綜合征的典型癥狀，給豬群造成免疫抑制性危害，同時也加大了PCV-3、PCV-4傳入的風(fēng)險和臨床損失[16-18]。根據(jù)本研究數(shù)據(jù)顯示，母豬免疫PCV-2疫苗能夠給仔豬提供部分病毒學(xué)和病理學(xué)方面的保護(hù)，減少PCV-3核酸的檢出率和傷亡率。