張旭偉，高向陽，雷昌貴*，馬振興，孟宇竹

（1.河南質(zhì)量工程職業(yè)學院，河南 平頂山 467000；2.河南農(nóng)業(yè)大學，河南 鄭州 450002）

獼猴桃（Actinidia Chinese Planch）又名奇異果、中國醋梨、羊桃等，屬獼猴桃科獼猴桃屬，為漿果類落葉藤本植物。獼猴桃屬植物共有66個種，我國是其分布中心，現(xiàn)已在世界多個國家廣泛種植[1]。獼猴桃常見商用栽培品種僅有數(shù)種，其余品種均屬于未被開發(fā)利用的野生資源。我國獼猴桃野生資源品種繁多，約有62種。

獼猴桃在我國有2 000多年的文字記載歷史，現(xiàn)在多個省市均有規(guī)?；耘喾N植，例如陜西、浙江、福建等地，已初步形成了產(chǎn)業(yè)規(guī)模[2]。野生獼猴桃資源相對比較集中，主要分布在我國西南部分省市，特別是經(jīng)濟欠發(fā)達的山區(qū)，每到成熟季節(jié)，果實漫山遍野，但由于種種原因未能得到有效開發(fā)，浪費了這一能帶動山區(qū)農(nóng)民發(fā)家致富的有利資源[3]。

果醋飲料作為新型營養(yǎng)保健型功能飲料，具有促進新陳代謝、調(diào)節(jié)酸堿平衡、消除疲勞、降低膽固醇和血壓、增強肌體免疫力、防癌、抗菌消炎、美容護膚、延緩衰老、減肥等功效[4]，自上市以來受到廣大消費者的喜愛[5]。近年來，國內(nèi)外學者已對石榴醋[6]、葡萄醋[7]、西紅柿醋[8]、蘋果醋[9]、柑橘醋[10]、山楂醋[11]、黃皮醋[12]、火龍果醋[13]等果醋飲品進行了研究。劉建文等[5]關(guān)于軟棗獼猴桃果醋的研究得出最佳工藝條件為酒精發(fā)酵溫度25℃，采用果酒酵母和酒精酵母混合發(fā)酵，配比為2∶1，接種量在10%以上；醋酸發(fā)酵溫度為33℃，最初酒精度5.0%，初始pH5.5，醋酸菌接菌量12%，醋酸發(fā)酵最大轉(zhuǎn)化率達到80%。目前，市面上也存在著一款野生獼猴桃果醋。目前關(guān)于獼猴桃已有較多研究，如獼猴桃保藏[14]、無損檢測[15]、獼猴桃果酒[16]和濃縮果汁[17]的研制等。

本文在前期研究的基礎(chǔ)上，以太行山區(qū)野生獼猴桃為原料，榨汁后帶渣發(fā)酵生產(chǎn)果酒，再加入果醋菌醋酸二次發(fā)酵生產(chǎn)獼猴桃果醋。研究果醋二次發(fā)酵過程中能代表發(fā)酵過程參數(shù)動力學模型和發(fā)酵過程中主要風味組分含量變化動力學方程，有利于野生獼猴桃資源的開發(fā)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野生獼猴桃果酒：由河南質(zhì)量工程職業(yè)學院食品與化工學院實驗室采摘野生獼猴桃破碎后連渣發(fā)酵制作；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：安琪酵母股份有限公司；巴氏醋桿菌（CICC 20001）（Acetobacter pasteurianus）：中國工業(yè)微生物菌種保藏中心；白砂糖（食品級）：市售；亞硫酸氫鈉、檸檬酸、NaOH（均為分析純）：西隴化工股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

S210-S精密pH計：梅特勒-托利多公司；0-40型酒精計：河間市宏利玻儀廠；Specord 250Plus紫外/可見光分光光度計：德國耶拿公司；7890A-5975C氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國Agilent公司；HS-100型自動進樣器：瑞士CTC公司。

1.3 方法

1.3.1 野生獼猴桃果醋制作方法

野生獼猴桃果醋制作方法參考熊亞等[18]的方法，并稍作修改。本文著重研究果醋發(fā)酵階段，果酒發(fā)酵結(jié)束后將整個果醋發(fā)酵過程以天為單位分為8個階段，分別測定菌體生長量（OD值）、底物消耗量（乙醇）、產(chǎn)物生成量（乙酸）和發(fā)酵液主要風味組分。

1.3.2 發(fā)酵參數(shù)指標測定

果醋菌菌體濃度（OD值）的測定參考姜開維[19]的方法，菌體生長量與光密度值（OD值）具有直接線性關(guān)系，可以通過測定570 nm波長下發(fā)酵液中光密度值來表達菌體生長量；醋酸發(fā)酵是以乙醇為基質(zhì)，生成乙酸的過程。底物消耗量是采用酸堿中和滴定原理進行測定乙醇消耗量；產(chǎn)物生成量采用蒸餾法測定乙醇生成含量。

1.3.3 發(fā)酵過程主要風味組分測定

發(fā)酵過程主要風味組分測定，參考文獻[20-21]的方法，略作修改。取2 mL野生獼猴桃果醋發(fā)酵液（按0.3 g/mL加氯化鈉），放入20 mL頂空瓶中，50℃下預熱20 min，插入萃取頭吸附20 min，將PDMS/DVB/CAR三相復合萃取頭插入氣相色譜進樣口，250℃解吸附5 min。

氣質(zhì)條件：進樣口溫度為250℃，柱初始溫度為40℃，以3℃/min升溫至180℃，再以2℃/min升溫至250℃。載氣為氦氣，流量為1.0 mL/min，不分流進樣。色譜柱：DB-5MS（30.0 m×250 μm×0.25 μm）。離子源為電子轟擊（electron impact，EI）模式，電子轟擊能量為70 eV，離子源溫度為230℃，接口溫度為250℃，掃描范圍為35 amu～350 amu，色譜庫為NIST 17譜庫。

1.3.4 半定量分析及正構(gòu)烷烴標定

使用3-辛醇外標半定量法對化合物進行半定量測定。即默認每個化合物對3-辛醇的相對響應(yīng)因子為1，為計算準確使用二氯甲烷為溶劑做3-辛醇標準曲線，從表中數(shù)據(jù)得出回歸方程：y=1.21×10-5x-9.35，其中y表示化合物濃度（ug/g），x表示化合物峰面積，R2=0.995 2，呈線性相關(guān)[22]。

質(zhì)譜解析后與NIST 17標準譜庫比對；計算待定化合物線性保留指數(shù)（linear retention index，LRI），不確定化合物通過與參考文獻[10-11]中保留指數(shù)比對。線性保留指數(shù)使用正構(gòu)烷烴（C7-C30）標定，計算公式如下。

式中：LRI為線性保留指數(shù)；tx為待定性化合物的保留時間，min；tn、tn+1分別為組分具有n和n+1個碳原子的正構(gòu)烷烴保留時間，min。其中 tn+1＞tx＞tn。

1.3.5 動力學模型構(gòu)建方法

參考張琪等[23]和王少曼等[24]的研究結(jié)果，選擇Logistic模型、SGompertz模型、Boltzmann模型和Dose Resp模型對發(fā)酵參數(shù)進行擬合；發(fā)酵過程主要風味組分動力學模型根據(jù)實際情況選擇合適模型構(gòu)建。

1.4 統(tǒng)計分析

試驗操作每組數(shù)據(jù)重復3次，以減少試驗誤差；數(shù)據(jù)分析為各組數(shù)據(jù)平均值，利用Microsoft Excel 2010進行統(tǒng)計處理；運用Origin 2018軟件對試驗結(jié)果進行非線性擬合，建立果醋菌菌體生長、乙酸生成、酒精消耗和主要風味組分的動力學模型方程。

2 結(jié)果與分析

2.1 關(guān)鍵發(fā)酵參數(shù)動力學分析

獼猴桃果醋發(fā)酵過程關(guān)鍵發(fā)酵參數(shù)是指發(fā)酵過程中巴氏醋酸桿菌菌體生長量、乙酸轉(zhuǎn)化途徑底物消耗量（乙醇）和產(chǎn)物生成量（乙酸）。該發(fā)酵參數(shù)能基本反映整個發(fā)酵過程發(fā)酵效率，許多學者采用該指標表達果酒或果醋的發(fā)酵效果[11-13]。野生獼猴桃關(guān)鍵發(fā)酵參數(shù)見表1。

表1 獼猴桃果醋發(fā)酵過程中參數(shù)結(jié)果Table 1 Results of parameters of fermentation of kiwi fruit vinegar

由表1可知，獼猴桃果醋醋酸發(fā)酵所用菌種在前3 d增長緩慢，第4天和第5天醋酸桿菌含量迅速增加，其后含量增加緩慢，該生長代謝符合菌種生長規(guī)律。果醋發(fā)酵是以醋酸桿菌為基礎(chǔ)，因此菌種生長、底物消耗和產(chǎn)物生成處于聯(lián)動狀態(tài)，從參數(shù)結(jié)果數(shù)據(jù)來看，三者之間相互聯(lián)系、相互對應(yīng)，醋酸代謝屬于“生長耦聯(lián)”型發(fā)酵。其前3 d處于生長代謝適應(yīng)階段，菌種代謝系統(tǒng)適應(yīng)新環(huán)境和快速增殖，但由于菌種量小，所以增長相對緩慢，相對于底物消耗和產(chǎn)物生成差異均不明顯；4 d～5 d菌種處于指數(shù)生長期，菌體大量繁殖，因此底物和產(chǎn)物也大量消耗和生成；5 d后菌種處于穩(wěn)定期，底物和產(chǎn)物依然處于快速消耗和生成狀態(tài)；第7天后底物已基本消耗結(jié)束，表示醋酸發(fā)酵結(jié)束。本試驗的結(jié)果與王榮榮等[25]和熊亞等[18]的果醋發(fā)酵結(jié)果基本一致。

2.1.1 菌體生長量動力學分析

醋酸菌菌體生長OD值在不同模型下的擬合動力學方程及擬合系數(shù)見表2。

表2 菌體生長的擬合動力學方程及其擬合系數(shù)Table 2 Fitting kinetic equation of acetobacter growth and its fitting coefficient

由表2可知，對Logistic模型、SGompertz模型和Dose Resp模型擬合系數(shù)比較可以看出，不同模型中擬合系數(shù)差異并不明顯；Dose Resp模型擬合效果相對另外兩種較好，擬合系數(shù)R2為0.995 04。因此，試驗中可使用Dose Resp模型來擬合野生獼猴桃果醋菌體生長。菌體生長動力學模擬曲線見圖1。

圖1 菌體生長動力學模擬曲線Fig.1 Growth fitting curve of acetobacter

2.1.2 底物消耗量（乙醇）動力學分析

利用Logistic模型、Boltzmann模型和Dose Resp模型對底物消耗量（乙醇）的擬合方程以及擬合系數(shù)見表3。

表3 乙醇消耗的擬合動力學方程及其擬合系數(shù)Table 3 Fitting kinetic equation of ethanol consumption and its fitting coefficient

由表3可知，3種擬合方程的擬合系數(shù)R2分別為0.995 20、0.997 38、0.996 38，不同模型擬合系數(shù) R2沒有明顯差異，但Boltzmann模型擬合系數(shù)R2略高，可用該模型描述發(fā)酵過程乙醇消耗情況。擬合動力學模型的擬合曲線見圖2。

由圖2可知，3種擬合曲線均能較好地描述醋酸發(fā)酵過程中乙醇消耗情況，乙醇消耗速率與菌體生成呈直接關(guān)系，屬于典型的生長“耦聯(lián)”型。

圖2 底物消耗量（乙醇）動力學模擬曲線Fig.2 Kinetic simulation of substrate consumption（ethanol）

2.1.3 產(chǎn)物生成量（乙酸）動力學分析

通過Logistic模型、SGompertz模型和Dose Resp模型對發(fā)酵過程中乙酸生成進行非線性擬合，見表4和圖3。

圖3 產(chǎn)物生成量（乙酸）動力學模擬曲線Fig.3 Kinetic simulation of product generation（acetic acid）

表4 乙酸生成的擬合動力學方程及其擬合系數(shù)Table 4 Fitting kinetic equation of acetic acid production and its fitting coefficient

由表4可知，Logistic模型、SGompertz模型和Dose Resp模型的擬合系數(shù)R2分別為0.999 78、0.999 80和0.998 80，三者之間無差異，均有較好的擬合效果；SGompertz模型擬合系數(shù)R2略高于其它兩種，因此實際生產(chǎn)中可選擇SGompertz模型對乙酸生成進行擬合。由圖3可以看出，3種模型擬合下的乙酸生成過程與圖1中醋酸菌生長模擬過程基本同步，醋酸菌在對數(shù)生長期內(nèi)代謝產(chǎn)生乙酸增長速度迅速增加，乙酸含量在發(fā)酵5 d后趨于穩(wěn)定，在7 d時醋酸值達到最大值。

2.2 發(fā)酵過程風味組分動力學分析

野生獼猴桃果醋以果酒為基礎(chǔ)的二次發(fā)酵，因此野生獼猴桃果醋風味建立在果酒風味基礎(chǔ)上。乙醇和乙酸是發(fā)酵過程兩種主要組分，在發(fā)酵參數(shù)階段已研究其動力學模型，因此不再加以闡述。通過頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜（headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPMEGC-MS）技術(shù)分析野生獼猴桃果醋中主要風味組分，由于野生獼猴桃本身揮發(fā)性風味組分較少，其發(fā)酵的果酒和果醋中的主要揮發(fā)性風味組分均由發(fā)酵途徑本身產(chǎn)生。檢測到含量較多的主要揮發(fā)性風味組分見表5。

由表5可知，主要揮發(fā)性風味組分19種，其中含量最多的組分為乙酸乙酯；同時可以看出野生獼猴桃果醋最終揮發(fā)性風味組分主要由含量較多的4種組分構(gòu)成，其他組分含量雖相對較多，但也僅占總含量的23.15%。

表5 野生獼猴桃果醋發(fā)酵過程主要揮發(fā)性風味組分Table 5 The main volatile flavor components of wild kiwi fruit vinegar during fermentation

續(xù)表5 野生獼猴桃果醋發(fā)酵過程主要揮發(fā)性風味組分Continue table 5 The main volatile flavor components of wild kiwi fruit vinegar during fermentation

野生獼猴桃果醋含量最高的4種揮發(fā)性組分分別為乙酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸異丁酯和乙酸苯乙酯，占總含量的76.85%，其它組分的存在使果醋風味更加多樣化，同時也更加柔和。該4種風味組分建立的動力學方程及模擬曲線，結(jié)果見表6和圖4。

圖4 4種主要揮發(fā)性風味擬合動力學曲線Fig.4 Fitting kinetic curves of four main volatile flavors

表6 4種主要揮發(fā)性風味擬合動力學方程及其擬合系數(shù)Table 6 Fitting kinetic equations of four main volatile flavors and their fitting coefficients

由表6和圖4可知，含量超過總含量的75%，基本可以表達野生獼猴桃果醋風味特征[26]。

3 結(jié)論與討論

獼猴桃被稱為VC之王，營養(yǎng)價值高，具有多種保健功能。作為我國特產(chǎn)水果，除市售品種外，還有大量野生獼猴桃存在，雖口感稍差，但仍具有較高的開發(fā)利用價值。本文利用野生獼猴桃開發(fā)果醋，分析了主要發(fā)酵參數(shù)指標和發(fā)酵過程中主要風味組分含量變化趨勢，建立動力學方程，為野生獼猴桃綜合利用提供技術(shù)參考。

發(fā)酵參數(shù)指標可直接指導野生獼猴桃果醋發(fā)酵生產(chǎn)，是發(fā)酵過程重要指標。野生獼猴桃果醋發(fā)酵參數(shù)動力學趨勢與其它作物，比如葡萄醋、黃皮醋等的趨勢基本類似，所采用的模型得出了較好的模擬效果，菌體生長量、底物消耗量和產(chǎn)物生成量的擬合系數(shù)R2分別為0.995 04、0.997 38和0.999 80。

獼猴桃本身香氣較淡，目前尚未有獼猴桃風味論文報道，野生獼猴桃成熟后同樣不能直接聞到香氣。試驗中檢測到的風味組分可以看出主要是釀酒酵母和巴氏醋酸桿菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的。由于菌種的不同，可能會得到不同的風味組合。野生獼猴桃營養(yǎng)豐富，檢測出含量較多的也就19種，其中以乙酸乙酯、乙酸異戊酯等為主，以4種主要的風味組分做動力學模擬，擬合效果良好，可以體現(xiàn)發(fā)酵過程風味組分形成過程。