柳入銘，張朝輝

（中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266005）

單細(xì)胞蛋白（single cell protein，SCP）大部分來自于細(xì)菌和酵母，其不但與魚粉具有相似的賴氨酸、蛋氨酸和半胱氨酸等氨基酸含量，還具有較高比例的色氨酸和蘇氨酸[1]。SCP是一種高品質(zhì)蛋白質(zhì)的替代來源，在畜產(chǎn)和水產(chǎn)養(yǎng)殖中已經(jīng)得到了廣泛應(yīng)用[2]，并且它可以作為富含蛋白質(zhì)食物的替代品[3]，可以替代傳統(tǒng)（植物和動(dòng)物）蛋白質(zhì)來源，而不會(huì)產(chǎn)生有害影響[4]。

乙醇梭菌蛋白就是一種新型單細(xì)胞蛋白源，是以乙醇梭菌（Clostridium autoethanogenum）為發(fā)酵菌種生產(chǎn)的一種新型菌體蛋白[5]，代謝快、生產(chǎn)率高、成本較低且蛋白質(zhì)含量高，蛋白質(zhì)含量可達(dá)80%，超過了進(jìn)口魚粉，并含有豐富的必需氨基酸[6]。尹秀娟等[1]用3%的單細(xì)胞蛋白和蛋白肽替代魚粉，發(fā)現(xiàn)可以使斷奶仔豬獲得與使用魚粉時(shí)相似的生長(zhǎng)性能、養(yǎng)分消化和腸道形態(tài)。吳雨珊[7]對(duì)乙醇梭菌蛋白與傳統(tǒng)蛋白源豆粕、棉粕、菜粕和酒糟蛋白（distillers dried grains with solubles，DDGS）進(jìn)行對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)乙醇梭菌蛋白的蛋白含量高、蛋白溶解度高、吸水性強(qiáng)，其制粒性能優(yōu)于其他4種蛋白源。陳穎[8]用乙醇梭菌蛋白替代飼料中不同比例的魚粉，發(fā)現(xiàn)其對(duì)生長(zhǎng)性能、抗氧化能力和消化酶活性等未見明顯的不良影響，并且可以明顯降低氮磷排放量。

乙醇梭菌蛋白與傳統(tǒng)植物源性蛋白質(zhì)相比，其不含抗?fàn)I養(yǎng)因子，而相對(duì)于動(dòng)物源性蛋白質(zhì)來說，其生產(chǎn)具有綠色、節(jié)能、環(huán)保的特性，沒有致病性，因此具有廣闊的開發(fā)前景。目前我國(guó)廣泛使用的動(dòng)物蛋白源主要是豆粕、花生粕、魚粉等，每年依靠進(jìn)口大量的大豆來做飼料，成本很高[9]，而且近年來魚粉供求關(guān)系緊張，因此解決該困境的重要途徑之一就是合理地開發(fā)和利用動(dòng)植物蛋白源[10]。

蛋白質(zhì)的提取分離對(duì)于研究蛋白質(zhì)非常重要，提取分離方法主要包括咪唑法、電泳法、苯酚提取法等[11]，其中超聲技術(shù)可以通過聲波的影響來提高提取效率，也可用于增強(qiáng)蛋白質(zhì)功能性質(zhì)，是一種安全、低成本、可靠、可復(fù)制、無創(chuàng)性而又不會(huì)污染環(huán)境的提取方法，與傳統(tǒng)的萃取方法相比有著很大的優(yōu)勢(shì)[12-13]。Osborne分級(jí)法是根據(jù)蛋白質(zhì)的溶解性進(jìn)行分級(jí)提取的一種方法，簡(jiǎn)單便捷易于操作，并且可以有效分離不同溶解性的蛋白質(zhì)，孫媛[14]通過改良Osborne分級(jí)法為小麥麩皮的高值利用提供了新路徑；姜燕蓉等[15]也曾用此方法成功提取牡蠣蛋白，該方法可以根據(jù)溶解性質(zhì)的不同將蛋白質(zhì)分級(jí)成水溶性蛋白、鹽溶性蛋白、醇溶蛋白（溶于50%～90%的乙醇溶液）和堿溶性蛋白[16]，對(duì)蛋白質(zhì)可以進(jìn)行較好地分離。

乙醇梭菌蛋白價(jià)值很大、前景廣闊，但國(guó)內(nèi)外的各種研究報(bào)道較少，因此本研究擬通過Osborne分級(jí)法對(duì)乙醇梭菌蛋白進(jìn)行分級(jí)分離，并對(duì)其含量最高的蛋白質(zhì)種類進(jìn)行提取條件的優(yōu)化，探究超聲溫度、超聲時(shí)間、料液比以及溶液濃度對(duì)其提取率的影響，為乙醇梭菌蛋白的后續(xù)開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

乙醇梭菌蛋白：北京首鋼朗澤新能源科技有限公司；蒸餾水：上?？盗κ糠治鰞x器有限公司；硫酸鈉、乙醇、氫氧化鈉、氯化鈉：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；考馬斯亮藍(lán)G-250、牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)液：碧云天生物技術(shù)有限公司；以上試劑均為分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

CP413精密天平：上海奧豪斯儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；2-16KL臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)SIGMA公司；ALPHA 1-4 LD Plus冷凍干燥機(jī)：德國(guó)CHRIST公司；MULTISKAN Sky全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀：美國(guó)Thermo scientific公司，Heal Force凈水系統(tǒng)：上?？盗κ糠治鰞x器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 Osborne分級(jí)法提取乙醇梭菌蛋白

稱取一定質(zhì)量的乙醇梭菌蛋白粉末，將蒸餾水按料液比1∶15（g/mL）加入其中，在30℃、100 W的條件下超聲輔助提取20 min，在4℃、8 000 r/min的條件下離心20 min，對(duì)得到的上清液進(jìn)行旋蒸濃縮、冷凍干燥后得到水溶性蛋白，離心得到的沉淀中按料液比1∶15（g/mL）加入2%硫酸鈉溶液，在相同條件下進(jìn)行超聲離心，所得上清液進(jìn)行冷凍干燥得到鹽溶性蛋白，之后在離心得到的沉淀中按料液比1∶15（g/mL）加入70%乙醇溶液，在相同條件下進(jìn)行超聲離心，所得上清液進(jìn)行濃縮、冷凍干燥后得到醇溶性蛋白，向離心得到的沉淀中按照料液比1∶15（g/mL）加入2%氫氧化鈉溶液，超聲離心，所得上清液濃縮、冷凍干燥得堿溶性蛋白[17-18]，具體工藝流程見圖1。記錄分類后進(jìn)行各蛋白組分含量[19]的計(jì)算，之后再對(duì)含量最多的蛋白質(zhì)種類進(jìn)行進(jìn)一步研究。

圖1 乙醇梭菌蛋白分級(jí)提取工藝流程圖Fig.1 Process flow chart of fractionated extraction of Clostridium autoethanogenum protein

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

采用牛血清蛋白（bovine albumin，BSA）作為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品[20]制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。具體方法為準(zhǔn)確吸收5.00 mg/mL牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)液于試管中，分別以蒸餾水稀釋，配成 0、0.125、0.250、0.500、0.750、1.000、1.500mg/mL的牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)液，空白對(duì)照組以蒸餾水代替，之后各吸取5 μL于96孔板中，再于各孔中加入250 μL考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，2 min后在酶標(biāo)儀上于595 nm處測(cè)吸光值，制作蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

針對(duì)Osborne分級(jí)法分離出的蛋白質(zhì)含量最高的堿溶性蛋白進(jìn)行單因素試驗(yàn)，研究超聲時(shí)間、氫氧化鈉溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)、超聲溫度和料液比對(duì)蛋白得率的影響。

1.3.3.1 超聲時(shí)間對(duì)蛋白得率的影響

準(zhǔn)確稱取一定量的乙醇梭菌蛋白粉末7份，在2%氫氧化鈉溶液中以料液比1∶20（g/mL）、超聲溫度35℃、超聲功率100W的條件下，探究超聲時(shí)間15、20、25、30、35、40、45 min 對(duì)堿溶性蛋白的蛋白得率的影響。

1.3.3.2 氫氧化鈉溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)蛋白得率的影響

準(zhǔn)確稱取一定量的乙醇梭菌蛋白粉末6份，在料液比1∶20（g/mL）、超聲溫度35℃、超聲功率100 W、超聲時(shí)間20 min的條件下，探究氫氧化鈉溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%對(duì)堿溶性蛋白的蛋白得率的影響。

1.3.3.3 超聲溫度對(duì)蛋白得率的影響

準(zhǔn)確稱取一定量的乙醇梭菌蛋白粉末6份，在2%氫氧化鈉溶液中以料液比1∶20（g/mL）、超聲時(shí)間20 min、超聲功率100 W的條件下，探究超聲溫度25、30、35、40、45、50 ℃對(duì)堿溶性蛋白的蛋白得率的影響。

1.3.3.4 料液比對(duì)蛋白得率的影響

準(zhǔn)確稱取一定量的乙醇梭菌蛋白粉末6份，在2%氫氧化鈉溶液中以超聲溫度35℃、超聲功率100 W、超聲時(shí)間20min條件下，探究料液比 1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40（g/mL）對(duì)堿溶性蛋白的蛋白得率的影響。

1.3.4 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，采用L9（34）正交設(shè)計(jì)對(duì)乙醇梭菌蛋白中堿溶性蛋白的提取條件進(jìn)行優(yōu)化，正交試驗(yàn)因素水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平Table 1 Factor level table of orthogonal test

1.3.5 蛋白得率的計(jì)算

通過考馬斯亮藍(lán)染色法[21]，測(cè)定595 nm處的吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出相應(yīng)的蛋白濃度，根據(jù)不同提取條件下的提取液，計(jì)算得到相應(yīng)的蛋白得率[22]，具體計(jì)算方法如下。

式中：c為乙醇梭菌蛋白堿溶性蛋白濃度，g/mL；v為溶液體積，mL；m為乙醇梭菌蛋白質(zhì)量，g。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)單因素試驗(yàn)進(jìn)行3次平行試驗(yàn)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel軟件進(jìn)行制圖，利用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，通過單因素分析、F檢驗(yàn)對(duì)各因素水平進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇梭菌蛋白的Osborne分級(jí)法分類結(jié)果

通過Osborne分級(jí)法對(duì)乙醇梭菌蛋白進(jìn)行分級(jí)提取后，得到的各類蛋白含量見圖2。

圖2 Osborne分級(jí)法提取后各類蛋白含量Fig.2 Content of various proteins after Osborne classification

由圖2可知，按照Osborne分級(jí)提取的方法提取得到的4種蛋白中，水溶性蛋白占蛋白質(zhì)總含量的3.43%、鹽溶性蛋白占0.21%、醇溶性蛋白占0.04%、堿溶性蛋白占76.80%。其中含量最多的為堿溶性蛋白，因此后續(xù)對(duì)堿溶性蛋白進(jìn)行進(jìn)一步的研究，研究堿溶性蛋白的最佳提取條件。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3。

由圖3可知，以牛血清蛋白濃度為橫坐標(biāo)，以595 nm處的吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程y=0.751 7x+0.692 7（R2=0.996 7），線性關(guān)系良好。

圖3 牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Bovine serum protein standard curve

2.3 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 超聲時(shí)間對(duì)提取結(jié)果的影響

超聲時(shí)間對(duì)堿溶性蛋白的蛋白得率影響見圖4。

由圖4可知，在15 min～30 min時(shí)，蛋白得率隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸上升，但趨勢(shì)較為緩慢，到35 min時(shí)蛋白得率達(dá)到最高，之后開始下降，這可能是因?yàn)檫m宜的超聲時(shí)間可以一定程度上促進(jìn)蛋白質(zhì)的提取，但隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)容易導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，從而導(dǎo)致得率在一定程度上下降[23]。通過單因素分析可看出15min與35min有明顯差異，因此選擇30、35、40 min 3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖4 超聲時(shí)間對(duì)蛋白得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on extraction yield

2.3.2 氫氧化鈉溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)提取結(jié)果的影響

氫氧化鈉溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)堿溶性蛋白的蛋白得率影響見圖5。

圖5 氫氧化鈉溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)蛋白得率的影響Fig.5 Effect of mass fraction of sodium hydroxide solution on extraction yield

由圖5可知，氫氧化鈉溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.3%～0.5%時(shí)，蛋白得率隨著質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加逐漸升高，0.5%時(shí)蛋白得率達(dá)到最大，之后整體呈下降趨勢(shì)，由此可見，隨著氫氧化鈉溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，堿溶性蛋白得率也升高，但繼續(xù)增加得率反而下降，分析可能是隨著氫氧化鈉溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的上升，改變了蛋白質(zhì)對(duì)水的親和性和表面帶電荷狀況等[24]，在低濃度的堿溶液中，由于效應(yīng)離子強(qiáng)度增加，增強(qiáng)了蛋白質(zhì)分子與水分子之間的相互作用，進(jìn)而使蛋白質(zhì)的溶解度增加[25]，但增長(zhǎng)有一定的限度，再增加氫氧化鈉濃度可能會(huì)導(dǎo)致此蛋白質(zhì)變性，從而使提取率下降。因此選擇0.3%、0.5%、1.0%3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.3.3 料液比對(duì)提取結(jié)果的影響

料液比對(duì)堿溶性蛋白的蛋白得率影響見圖6。

圖6 料液比對(duì)蛋白得率的影響Fig.6 Effect of solid-liquid ratio on extraction yield

由圖6可知，料液比在1∶15（g/mL）～1∶30（g/mL）時(shí)蛋白得率隨著溶液體積的增加逐漸升高，但增長(zhǎng)緩慢，到1∶35（g/mL）時(shí)達(dá)到最大，之后稍微有所下降，這可能是因?yàn)槿芤后w積較小時(shí)，溶液較黏稠，溶出率較小，因此得率不高，之后隨著溶液體積的增大，蛋白質(zhì)在更多溶劑中的分散作用使蛋白質(zhì)的提取量有所增加[26]，但隨著溶液體積增大，分散度已經(jīng)達(dá)到最大，再增加已經(jīng)不會(huì)有更好的提取效果，反而有可能受到一定的抑制作用。因此選擇1∶30、1∶35、1∶40（g/mL）3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.3.4 超聲溫度對(duì)提取結(jié)果的影響

超聲溫度對(duì)堿溶性蛋白的蛋白得率影響見圖7。

圖7 超聲溫度對(duì)蛋白得率的影響Fig.7 Effect of ultrasonic temperature on extraction yield

由圖7可知，在25℃～45℃時(shí)，蛋白得率隨著超聲溫度的升高而升高，在50℃有所下降，在45℃，時(shí)蛋白得率達(dá)到最高，之后蛋白得率開始下降，這可能是因?yàn)榫S持蛋白質(zhì)各亞基之間的空間構(gòu)象的各類次級(jí)鍵因分子劇烈運(yùn)動(dòng)而破壞[27]，溫度達(dá)到一定程度會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性或熱降解從而使蛋白得率不再增加[28]。因此選擇40、45、50℃3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.3.5 正交試驗(yàn)結(jié)果

正交設(shè)計(jì)結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表2 正交設(shè)計(jì)結(jié)果Table 2 Orthogonal design results

表3 正交設(shè)計(jì)方差分析Table 3 Analysis of variance of orthogonal design

由表2可知，通過極值R大小得出各因素對(duì)蛋白得率影響大小為超聲時(shí)間＞氫氧化鈉溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞料液比＞超聲溫度。由表3可知，本試驗(yàn)超聲時(shí)間對(duì)堿溶性蛋白的蛋白得率影響為極顯著（p＜0.01），氫氧化鈉溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)得率的影響顯著（p＜0.05），提取溫度和料液比對(duì)得率有一定影響（p＜0.25），結(jié)果不顯著[29]。綜合分析得到堿溶性蛋白的最佳提取工藝參數(shù)為A3B2C1D1。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取一定量乙醇梭菌蛋白粉末3份，按最佳工藝參數(shù)A3B2C1D1進(jìn)行超聲輔助提取，測(cè)量其吸光值，算出其蛋白得率為75.75%。蛋白得率大于其他提取工藝參數(shù)，因此選擇A3B2C1D1為最佳工藝參數(shù)，此時(shí)得率75.75%。

3 結(jié)論

本研究通過Osborne分級(jí)法提取乙醇梭菌蛋白并進(jìn)行了提取分類，最終分級(jí)為水溶性蛋白、鹽溶性蛋白、醇溶性蛋白以及堿溶性蛋白4種蛋白，水溶性蛋白占蛋白質(zhì)總含量的3.43%、鹽溶性蛋白占0.21%、醇溶性蛋白占0.04%、堿溶性蛋白占76.80%。由此可知，堿溶性蛋白含量最多，具有研究?jī)r(jià)值，因此后續(xù)的條件優(yōu)化以堿溶性蛋白作為研究對(duì)象。

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果以及正交試驗(yàn)對(duì)乙醇梭菌蛋白中的堿溶性蛋白進(jìn)行了提取優(yōu)化，探究超聲溫度、料液比、超聲時(shí)間以及氫氧化鈉溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)堿溶性蛋白的蛋白得率的影響，最終得到最佳工藝參數(shù)為超聲溫度50℃、料液比1∶35（g/mL）、超聲時(shí)間為30 min、氫氧化鈉溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%，此時(shí)蛋白得率為75.75%。

乙醇梭菌蛋白擁有廣闊的開發(fā)前景，是一種可以代替植物和動(dòng)物蛋白源的優(yōu)質(zhì)蛋白源，但目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于乙醇梭菌蛋白的研究都非常少，乙醇梭菌蛋白的結(jié)構(gòu)及活性探究方面還需要進(jìn)一步的研究，因此該試驗(yàn)可以為乙醇梭菌蛋白在飼料及功能性食品等方面的開發(fā)利用提供一定的試驗(yàn)依據(jù)，給后續(xù)研究以一定的參考，有利于其進(jìn)一步的研究與開發(fā)。