任吳疆，張靜，霍清，劉彥霞，郭豫，趙建，白海燕*

（1.北京聯(lián)合大學(xué)生物化學(xué)工程學(xué)院，北京 100023；2.北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院保健食品檢驗中心，北京 100191）

腸道菌群是指分布在腸道的微生物菌群，它們與腸道系統(tǒng)共同構(gòu)成了腸道微生態(tài)，是維持腸道正常功能的基本保障[1]。人體胃腸道內(nèi)棲息著數(shù)量及種類繁多的微生物，這些微生物通過生物拮抗、免疫反應(yīng)和調(diào)節(jié)機(jī)體代謝等方式影響人體健康[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群不僅能夠調(diào)節(jié)腸道的動態(tài)平衡[4]，還能分解食物中的大分子多糖，參與營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收，維持腸上皮屏障的完整性[5]。腸道微生物菌群的結(jié)構(gòu)、功能及其產(chǎn)生的生物活性代謝產(chǎn)物對維持人體腸道健康具有重要意義[6]。益生菌是一種能夠平衡宿主腸道內(nèi)菌群，并且可以產(chǎn)生活性物質(zhì)，同時對宿主產(chǎn)生有益作用的微生物，是人類及動物腸道內(nèi)尤為重要的生理菌[7]。乳酸菌作為廣泛分布在動物腸道內(nèi)的一種益生菌，具有多種益生功能，不僅能夠調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫系統(tǒng)，維持腸道菌群平衡，還具有一定的抗氧化能力，能夠清除腸道內(nèi)的活性氧分子，保持腸道微生物生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定[8]。

鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus，LGG）多存在于人和動物的腸道內(nèi)，屬于乳桿菌屬，鼠李糖亞種，是厭氧、耐酸、不產(chǎn)芽孢的一種革蘭氏陽性益生菌，具有耐膽汁鹽、耐多種抗生素等生物學(xué)特點[9]，其對腸道內(nèi)環(huán)境的耐受性好、腸道黏著率高、定植能力強(qiáng)，有助于提高機(jī)體非特異性免疫，增強(qiáng)機(jī)體抵抗腸道致病菌感染的能力[10]。鼠李糖乳桿菌R9639（Lactobacillus rhamnosus R9639）是從自然發(fā)酵酸馬奶中分離得到的1株益生菌，具有胃腸消化液良好的耐受性，能夠以活的狀態(tài)進(jìn)入人體腸道。聶穎蘭等[11]的研究發(fā)現(xiàn)鼠李糖乳桿菌R9639可以通過增強(qiáng)體液免疫、細(xì)胞免疫、單核-巨噬細(xì)胞功能和免疫細(xì)胞中的自然殺傷細(xì)胞活性來增強(qiáng)小鼠的免疫功能。但目前研究中鼠李糖乳桿菌R9639在腸道菌群及抗氧化能力方面的相關(guān)研究較少，有待進(jìn)一步探究。

因此，本研究主要采用鼠李糖乳桿菌R9639制劑灌胃正常小鼠，探究其對正常小鼠體重和攝食、小腸形態(tài)、臟器系數(shù)、小腸和肝臟組織抗氧化水平、腸道微生物和小鼠糞便短鏈脂肪酸的影響，以期為闡明鼠李糖乳桿菌R9639和宿主的相互作用關(guān)系積累基礎(chǔ)研究，并為益生菌制劑在保健食品領(lǐng)域應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

44只健康SPF級BALB/c雄性小鼠[體重18 g～20 g，實驗動物使用許可證號：SYXK（京）2017-0038]：北京華阜康生物科技股份有限公司。所有動物均飼養(yǎng)于北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院SPF級動物房，飼養(yǎng)室溫度為（20±2）℃、相對濕度為45%～60%。本研究動物實驗設(shè)計和實施方案通過了北京聯(lián)合大學(xué)倫理委員會審核和批準(zhǔn)（實驗動物倫理委員會意見書編號20210902）。

1.2 材料與試劑

鼠李糖乳桿菌 R9639（2×1011CFU/g）：北京科拓恒通生物技術(shù)股份有限公司；谷胱甘肽（gutathione，GSH）測定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（gutathione peroxidase，GSH-Px）測定試劑盒、總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）測定試劑盒、丙二醛（mlondialdehyde，MDA）測定試劑盒：南京建成生物工程研究所；白細(xì)胞介素-2（iterleukin-2，IL-2）、白細(xì)胞介素-6（iterleukin-6，IL-6）、白細(xì)胞介素-1β（inter-leukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（tmor necrosis factor-α，TNF-α）試劑盒：武漢華美生物工程有限公司；伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基、疊氮鈉-結(jié)晶紫-七葉苷瓊脂培養(yǎng)基、乳桿菌選擇性培養(yǎng)基、雙歧桿菌選擇性培養(yǎng)基、產(chǎn)氣莢膜梭菌選擇性培養(yǎng)基：麥克林試劑公司。

1.3 儀器與設(shè)備

Infinite M NANO TECAN酶標(biāo)儀：廣州深華公司；CPA225D電子分析天平：美國Sartorius公司；Centrifuge 5702 RH-低速離心機(jī)：德國Eppendorf公司；Hula Dancerbasic漩渦振蕩器：德國IKA公司；Milli-QEQ7000超純水機(jī)：法國Millipore公司；UV-4802紫外可見分光光度計：尤尼柯儀器有限公司；GI54DW高壓滅菌鍋：美國Zealway公司；DHG-9003電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科技有限公司；NU-9483E超低溫冰箱：美國Nuaire公司；HHW21.420D恒溫水箱：天津泰斯特儀器有限公司；Agilent 8890氣相色譜儀：美國安捷倫公司。

1.4 方法

1.4.1 動物分組及分組處理

取44只SPF級健康雄性BALB/c小鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為4組，每組11只，分為對照組（C）、低劑量組（L）、中劑量組（M）、高劑量組（H），其中低、中、高劑量組分別灌胃 0.25×108、0.50×108、1.50×108CFU/kg鼠李糖乳桿菌R9639制劑，對照組灌胃相同體積的生理鹽水，連續(xù)灌胃30 d。實驗過程中小鼠自由攝取食物和飲水。灌胃期間每天測量小鼠體重和攝食情況并記錄。

1.4.2 小鼠臟器系數(shù)的測定

BALB/c小鼠灌胃結(jié)束后，將所有小鼠脫頸處死，進(jìn)行解剖，取出心、肝、脾、肺、腎、胸腺等臟器進(jìn)行稱重并記錄，計算其臟器系數(shù)。

1.4.3 小鼠小腸質(zhì)量和長度的測定

BALB/c小鼠解剖后，取出并測量小腸的質(zhì)量和長度，比較各組之間小鼠小腸質(zhì)量和長度的變化。

1.4.4 小鼠血清中炎癥細(xì)胞因子的含量測定

BALB/c小鼠脫頸處死前，摘眼球取血，離心取小鼠血清，用酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）測定IL-2、IL-6、IL-1β、TNF-α的含量，具體實驗步驟嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4.5 小鼠抗氧化能力水平的測定

BALB/c小鼠解剖后，取出小腸的空腸段和肝臟組織，對組織中的MDA、T-SOD、GSH、GSH-Px含量進(jìn)行測定，詳細(xì)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4.6 小鼠糞便菌群計數(shù)

在小鼠灌胃的第0天和第30天，無菌操作收集所有小鼠糞便0.1 g，加入稀釋液充分振蕩混勻，10倍梯度稀釋至10-8，分別用相應(yīng)的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后計算每克濕便中腸桿菌、腸球菌、乳桿菌、雙歧桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌的活菌數(shù)，均取對數(shù)計算以lg（CFU/g）表示。腸桿菌選擇伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基，（36±1）℃培養(yǎng)24 h；腸球菌選擇疊氮鈉-結(jié)晶紫-七葉苷瓊脂培養(yǎng)基，（36±1）℃培養(yǎng)48 h；乳桿菌選擇乳桿菌選擇性培養(yǎng)基，（36±1）℃培養(yǎng)48 h；雙歧桿菌選擇雙歧桿菌選擇性培養(yǎng)基，（36±1）℃厭氧培養(yǎng)48 h；產(chǎn)氣莢膜梭菌選擇產(chǎn)氣莢膜梭菌選擇性培養(yǎng)基，（36±1）℃厭氧培養(yǎng)24 h。

1.4.7 小鼠糞便的短鏈脂肪酸檢測分析

參考Zubaidah等[12]的方法，采用氣相色譜法檢測乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸的含量。每只小鼠取糞便約0.2 g，加入0.25 mL 25% H3PO3，在室溫25℃下振蕩混勻，靜置1 min，加入1.25 mL丙酮，充分混勻后3 000 r/min離心5 min，取上清液0.35 mL，再加入0.65 mL丙酮，12 000 r/min離心5 min，取上清液200 μL，使用氣相色譜儀進(jìn)行檢測。

氣相色譜條件為色譜柱：DB-FFAP毛細(xì)管柱；載氣：純度為99.99%氮氣；柱溫：初始溫度40℃，以10℃/min升至200℃，保持3 min，檢測器溫度為270℃。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析方法

應(yīng)用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行顯著性分析，采用單因素方差分析，所有數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。小鼠糞便細(xì)菌計數(shù)實驗采用獨立樣本t檢驗，各組自身前后比較采用成對t檢驗。p＜0.05表示有顯著差異，p＜0.01表示有極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 鼠李糖乳桿菌R9639對小鼠體重和攝食的影響

鼠李糖乳桿菌R9639對小鼠體重和攝食的影響見圖1。

圖1 鼠李糖乳桿菌R9639對小鼠體重和攝食的影響Fig.1 The effect of Lactobacillus rhamnosus R9639 on body weight and food intake of mice

由圖1 A可知，小鼠體重隨著時間的緩慢延長，各組之間小鼠體重?zé)o顯著差異（p＞0.05）；由圖1 B可知，小鼠的攝食各組之間也無顯著差異（p＞0.05）。上述結(jié)果表明鼠李糖乳桿菌R9639制劑對健康小鼠體重、攝食均無影響。

2.2 鼠李糖乳桿菌R9639對小鼠臟器系數(shù)的影響

臟器系數(shù)又稱臟體比，是實驗動物某臟器的質(zhì)量與其體重的比值。臟器系數(shù)可反映動物內(nèi)臟的功能狀態(tài)，是機(jī)體營養(yǎng)代謝和健康狀態(tài)的綜合表征，也是藥物安全評價中必要的檢測指標(biāo)。正常時各臟器質(zhì)量與體重的比值比較恒定。一般情況下，臟器系數(shù)增大，表示臟器充血、水腫或增生肥大等；臟器系數(shù)減小，表示臟器萎縮及其他退行性改變[13]。鼠李糖乳桿菌R9639對小鼠臟器系數(shù)的影響見表1。

表1 鼠李糖乳桿菌R9639對小鼠臟器系數(shù)的影響Table 1 The effect of Lactobacillus rhamnosus R9639 on the organ coefficient of mice

由表1可知，各劑量組與對照組心、肝、脾、肺、腎、胸腺等主要臟器相比均無顯著差異（p＞0.05），上述結(jié)果說明鼠李糖乳桿菌R9639制劑對小鼠臟器系數(shù)無顯著影響（p＞0.05）。

2.3 鼠李糖乳桿菌R9639對小鼠小腸質(zhì)量和長度的影響

小腸作為消化營養(yǎng)物質(zhì)最重要的器官，與機(jī)體的健康密切相關(guān)[14]，小腸長度過短、質(zhì)量過輕可能會造成短腸綜合征，小腸長度和質(zhì)量的增加不僅可以改善腸道的發(fā)育，還可以加快機(jī)體對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收[15-16]。此外，微生物群可以影響腸道形態(tài)，從而改善腸道發(fā)育、健康和功能[17]。鼠李糖乳桿菌R9639對小鼠小腸質(zhì)量和長度的影響見圖2。

圖2 鼠李糖乳桿菌R9639對小鼠小腸質(zhì)量和長度的影響Fig.2 Effects of Lactobacillus rhamnosus R9639 on the quality and length of small intestine in mice

由圖2可知，鼠李糖乳桿菌R9639灌胃后的小腸質(zhì)量和長度均無顯著差異（p＞0.05），表明其對小腸質(zhì)量和長度無明顯影響。

2.4 鼠李糖乳桿菌R9639對小鼠血清中炎癥細(xì)胞因子含量的影響

研究表明，在氧化自由基過多的情況下，T細(xì)胞功能低下，不能有效控制B細(xì)胞，導(dǎo)致自身抗體過多產(chǎn)生，使機(jī)體不能準(zhǔn)確識別自己和非己，從而導(dǎo)致一些嚴(yán)重的疾病。益生菌不僅能夠調(diào)節(jié)腸道微生物群，還能調(diào)節(jié)局部或全身水平的免疫。益生菌的抗炎作用是通過免疫調(diào)節(jié)和炎癥細(xì)胞因子調(diào)節(jié)來實現(xiàn)的[18]。Wong等[19]的研究發(fā)現(xiàn)益生菌、益生元有抗炎作用，可以通過調(diào)節(jié)腸道微生物群來加強(qiáng)腸道屏障、抑制IL-6/STAT3信號傳導(dǎo)。本研究對小鼠血清中炎癥因子含量的影響見圖3。

圖3 小鼠血清中炎癥細(xì)胞因子的含量Fig.3 The content of inflammatory cytokines in serum of mice

由圖3可知，本實驗灌胃鼠李糖乳桿菌R9639制劑后，低劑量組與對照組相比，IL-1β水平極顯著降低（p＜0.01），IL-6水平顯著降低（p＜0.05）；中劑量組與對照組相比，IL-6、IL-1β 水平極顯著降低（p＜0.01）；高劑量組與對照組相比，IL-2、IL-6、IL-1β水平極顯著降低（p＜0.01），TNF-α水平顯著降低（p＜0.05）。上述結(jié)果表明，在鼠李糖乳桿菌R9639制劑灌胃后，IL-2、IL-6、IL-1β、TNF-α細(xì)胞因子水平均有所降低，說明鼠李糖乳桿菌R9639制劑對炎癥細(xì)胞因子水平具有一定的調(diào)節(jié)作用，有助于維持腸道微生物群的生態(tài)平衡，從而避免了因腸道生態(tài)失衡可能引起的腸道屏障完整性被破壞而導(dǎo)致局部或全身炎癥。

2.5 鼠李糖乳桿菌R9639對小鼠組織抗氧化水平的影響

抗氧化是抗氧化自由基的簡稱，人體由于外界污染、放射線照射以及自身新陳代謝等活動會不斷產(chǎn)生氧化自由基。作為抗氧化系統(tǒng)中重要的酶，SOD和CAT的活性高低可以表示機(jī)體清除自由基能力的強(qiáng)弱，體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度可以用MDA水平反映[20]。以往研究結(jié)果顯示，攝入乳酸菌有助于提高抗氧化能力，且不同菌株之間的抗氧化能力不盡相同[21]。Qian等[22]的研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌CQPC11可以提高衰老小鼠血清、肝臟和脾臟組織中SOD、GSH-Px和GSH的水平，降低MDA的水平。Zhang等[23]的研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵乳桿菌JX306能顯著降低血清、腎臟和肝臟組織中MDA的水平，提高GSH-Px的水平和總抗氧能力。本研究對小鼠組織抗氧化水平的影響見表2。

表2 鼠李糖乳桿菌R9639對小鼠組織抗氧化水平的影響Table 2 The effect of Lactobacillus rhamnosus R9639 on antioxidant level in mice tissues

由表2可知，小腸組織中，低劑量組與對照組相比，MDA的水平顯著降低（p＜0.05）；中劑量組與對照組相比，T-SOD和GSH的水平顯著升高（p＜0.05），GSH-Px的水平極顯著升高（p＜0.01），MDA的水平極顯著降低（p＜0.01）；高劑量組與對照組相比，T-SOD、GSH和GSH-Px水平均極顯著升高（p＜0.01），MDA水平極顯著降低（p＜0.01）。肝臟組織中，低劑量組與對照組相比，GSH和GSH-Px水平顯著升高（p＜0.05）；中劑量組與對照組相比，T-SOD、GSH和GSH-Px水平均極顯著升高（p＜0.01）；高劑量組與對照組相比，T-SOD、GSH和GSH-Px水平均極顯著升高（p＜0.01），MDA水平顯著降低（p＜0.05）。結(jié)果表明，各劑量組指標(biāo)與正常小鼠相比，對T-SOD、GSH和GSH-Px水平均有不同程度提高，并降低了MDA的水平，表現(xiàn)出了劑量依賴性，說明鼠李糖乳桿菌R9639制劑有助于改善、提高小鼠小腸和肝臟組織的抗氧化水平，增強(qiáng)小鼠小腸和肝臟組織的抗氧化防御系統(tǒng)能力，從而維持了小鼠腸道內(nèi)微生物的生態(tài)平衡。

2.6 鼠李糖乳桿菌R9639對小鼠腸道常見微生物的影響

對灌胃鼠李糖乳桿菌R9639制劑前后的小鼠糞便中腸桿菌、腸球菌、乳桿菌、雙歧桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌進(jìn)行計數(shù)，結(jié)果見圖4。

圖4 鼠李糖乳桿菌R9639對小鼠腸道微生物的影響Fig.4 Effects of Lactobacillus rhamnosus R9639 on the intestinal microbes of mice

由圖4可知，灌胃前第0天，腸桿菌、腸球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、乳桿菌和雙歧桿菌各組數(shù)量與第30天對照組或第0天自身比較均無顯著差異（p＞0.05），灌胃后第30天，低劑量組各菌含量與第30天對照組或第0天自身比較均無顯著差異（p＞0.05），中劑量組和高劑量組乳桿菌和雙歧桿菌含量均有所增加，其中中劑量組乳桿菌和雙歧桿菌與第30天對照組相比均有顯著差異（p＜0.05），與第0天自身相比，分別有顯著差異（p＜0.05）和極顯著差異（p＜0.01）。高劑量組乳桿菌和雙歧桿菌與第30天對照組及第0天自身相比均有極顯著差異（p＜0.01）。結(jié)果表明，灌胃中、高劑量鼠李糖乳桿菌R9639制劑乳桿菌和雙歧桿菌數(shù)量顯著增加，有助于調(diào)節(jié)和改善小鼠腸道菌群，促進(jìn)小鼠腸道的健康。

2.7 鼠李糖乳桿菌R9639對小鼠糞便中短鏈脂肪酸的影響

短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）也稱揮發(fā)性脂肪酸，主要包括乙酸、丙酸、丁酸、異戊酸、異丁酸，SCFAs對于維持大腸的正常功能和結(jié)腸上皮細(xì)胞的形態(tài)和功能具有重要作用，也可促進(jìn)鈉的吸收，丁酸在這方面的作用比乙酸和丙酸更強(qiáng)，并且丁酸可以增加乳酸桿菌的數(shù)量和減少大腸桿菌的數(shù)量。目前研究表明，SCFAs主要由腸道內(nèi)未消化的碳水化合物經(jīng)厭氧菌酵解產(chǎn)生，結(jié)腸厭氧菌發(fā)酵產(chǎn)生乙酸、擬桿菌門發(fā)酵產(chǎn)生丙酸、厚壁菌門發(fā)酵代謝產(chǎn)生丁酸[24]，這些菌屬及其產(chǎn)生的SCFAs對腸屏障功能的維護(hù)有重要作用[25]。鼠李糖乳桿菌R9639對小鼠糞便中短鏈脂肪酸的影響見圖5。

圖5 鼠李糖乳桿菌R9639對小鼠糞便短鏈脂肪酸的影響Fig.5 Effects of Lactobacillus rhamnosus R9639 on SCFAs in feces of mice

由圖5可知，各劑量組與對照組相比，中、高劑量組乙酸、丙酸、丁酸含量均極顯著升高（p＜0.01），低劑量組丙酸和丁酸含量與對照組相比極顯著升高（p＜0.01）、乙酸含量與對照組相比顯著升高（p＜0.05），異戊酸和異丁酸各劑量組之間無顯著差異（p＞0.05）。結(jié)果表明，在鼠李糖乳桿菌R9639制劑灌胃后，糞便SCFAs的檢測多為乙酸、丙酸和丁酸，這些SCFAs都能在短時間內(nèi)被結(jié)腸吸收，鼠李糖乳桿菌R9639制劑的干預(yù)對腸道中SCFAs含量的影響存在一定的量效關(guān)系。

3 結(jié)論

本研究主要探究了鼠李糖乳桿菌R9639制劑對健康小鼠小腸和肝臟組織抗氧化水平、血清中炎癥細(xì)胞因子含量、腸道微生物和糞便中短鏈脂肪酸的影響。結(jié)果表明鼠李糖乳桿菌R9639可以有效降低血清中IL-2、IL-6、IL-1β、TNF-α炎癥細(xì)胞因子水平，提高小腸和肝臟組織中T-SOD、GSH和GSH-Px的水平、降低MDA的水平，提高組織的抗氧化水平和機(jī)體的免疫水平、增加腸道內(nèi)的有益菌、減少有害菌，提高了腸道中短鏈脂肪酸乙酸、丙酸和丁酸的含量。鼠李糖乳桿菌R9639制劑可以通過調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)抗氧化酶的活性、炎癥細(xì)胞因子的水平來維持腸道內(nèi)微生物的生態(tài)平衡，對促進(jìn)小鼠的健康有一定效果。