張 衛(wèi)，譚北平，龐奧博，鄧君明，楊奇慧，張海濤

（1.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524088；2.農(nóng)業(yè)部南方水產(chǎn)與畜禽飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524074）

魚粉（FM）價(jià)格上漲迫使尋找新的替代物，大豆制品產(chǎn)量高且氨基酸組成較平衡，是目前應(yīng)用最廣的植物型替代蛋白源。但飼料中添加高劑量豆粕（SBM）易引起魚類腸炎反應(yīng)[1]，這與其含有大豆抗原蛋白、蛋白酶抑制劑、植酸鹽、皂苷、凝集素、植物甾醇和低聚糖等抗?fàn)I養(yǎng)因子有關(guān)[2]。目前，關(guān)于SBM 誘導(dǎo)的魚類腸炎（SBMIE）確切原因和機(jī)制尚不完全清楚，對(duì)于腸炎形成的分子機(jī)制仍缺乏系統(tǒng)研究。醇溶性抗?fàn)I養(yǎng)因子，尤其是大豆皂苷極可能是主要的潛在致病因素[3]。但大豆皂苷直接作用復(fù)雜。單獨(dú)喂食或與玉米面筋、向日葵、菜籽或蠶豆蛋白聯(lián)用時(shí)，未見(jiàn)或幾乎無(wú)炎癥，然而大豆皂苷與豌豆蛋白合用時(shí)，組織學(xué)和轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生了顯著變化[4]。皂苷引起的腸炎有劑量依賴性，較高含量的皂苷（2～4 g/kg）可引起大西洋鮭（Salmo salar）腸炎，與基礎(chǔ)飼料蛋白源種類無(wú)關(guān)[3]。此外，低水平皂苷似對(duì)一些魚類生長(zhǎng)還有促進(jìn)作用，可能與皂素佐劑特性的免疫促進(jìn)作用有關(guān)[5]。豆粕引發(fā)的腸炎也可能是大豆皂苷膜干擾特性的次要作用[6]。新的組學(xué)技術(shù)對(duì)研究魚類營(yíng)養(yǎng)與免疫間復(fù)雜關(guān)系有巨大潛力[7]。

珍珠龍膽石斑魚（Epinephelus fuscoguttatus♀×Epinephelus lanceolatus♂）是典型的海水肉食性魚類，有生長(zhǎng)快、市場(chǎng)價(jià)值高、抗病性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，在養(yǎng)殖過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)SBM 引起的腸道黏膜受損及腸炎癥狀[1]。本研究對(duì)珍珠龍膽石斑魚腸道組織進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)分析，以篩選與飼料SBM 模式相關(guān)的差異代謝物，從綜合性視角在SBM 飼料替代魚粉模式下，篩選SBM 誘導(dǎo)的腸炎候選生物標(biāo)志物，為魚類腸道健康研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)飼料

實(shí)驗(yàn)飼料組成見(jiàn)表1。分別配制3 種等氮（粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)約50%）和等脂（粗脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)約10%）的實(shí)驗(yàn)飼料（20 kJ/g），以相應(yīng)的SBM 蛋白替代質(zhì)量分?jǐn)?shù)0%、20%和40%的FM 蛋白，分別命名為FM（對(duì)照組）、SBM20 和SBM40。在實(shí)驗(yàn)飼料中加入賴氨酸和蛋氨酸進(jìn)行氨基酸配平。飼料原料磨成細(xì)粉，過(guò)250 μm 篩，并根據(jù)配方準(zhǔn)確稱量。用造粒機(jī)制備粒徑為2.0、3.0 mm 的顆粒飼料，陰涼處風(fēng)干，分裝，在-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。飼料中必需氨基酸含量（四川威爾檢測(cè)技術(shù)股份有限公司檢測(cè)）見(jiàn)表2。

表1 飼料配方和基本組成質(zhì)量分?jǐn)?shù) (干物質(zhì))Table 1 Formulation and proximate composition of experimental diets (dry matter) %

表2 飼料中17 種必需氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 2 Mass fraction of 17 amino acids in diets %

1.2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

平均體質(zhì)量約9 g 的健康石斑魚幼魚購(gòu)自湛江市。在實(shí)驗(yàn)條件馴養(yǎng)1 周，喂食商品飼料。實(shí)驗(yàn)前停飼24 h，用丁香酚（體積分?jǐn)?shù)0.01%）麻醉，分組。規(guī)格相似幼魚隨機(jī)分配至1 000 L 圓柱形玻璃鋼桶中，每桶60 尾，每組4 個(gè)重復(fù)。每日8:00、16:00投喂至表觀飽腹水平，實(shí)驗(yàn)周期10 周。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中記錄飼料消耗。室內(nèi)靜水養(yǎng)殖，所有養(yǎng)殖桶用氣石連續(xù)充氣，自然光照，溫度（29 ± 1）℃，氨和硝酸鹽低于0.03 mg·L-1，溶解氧不少于7 mg·L-1。前2周每天每桶換水量為60%；后期每桶每天換水量約100%，為減少魚的應(yīng)激，用保證魚自由游動(dòng)的最低水位流水式換水，待水足夠清澈時(shí)加至原有水位。

1.3 樣品收集

養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，停飼24 h，統(tǒng)計(jì)石斑魚數(shù)量和體質(zhì)量。每桶隨機(jī)取魚6 尾，取血清，置-80 ℃，以分析血清酶活力；取后腸和肝臟，清除腸系膜和脂肪組織，置液氮中，取樣后移至-80 ℃以備酶活性分析；部分腸道組織剪碎，置于裝有RNAlater的試管，置4 ℃下12 h，移至-80 ℃用于基因表達(dá)測(cè)定。

在最后攝食時(shí)間點(diǎn)前對(duì)實(shí)驗(yàn)魚腸道組織進(jìn)行代謝組學(xué)取樣。剖取腸道，輕輕擠出糞便，用去離子水沖洗干凈。每處理組取12 個(gè)樣本（同一桶3尾魚腸道組織等量為一個(gè)樣本）。樣品置凍存管，液氮速凍后，移至 -80 ℃以備代謝組學(xué)分析。

1.4 生長(zhǎng)生理指標(biāo)

1.4.1 生長(zhǎng)性能 選用增重率（Weight gain rate，WGR，%）、特定生長(zhǎng)率（Specific growth rate，SGR，%/d）、肝體指數(shù)（Hepatosomatic index，HIS，%）和存活率（Survival rate，SR，%）作為生長(zhǎng)性能指標(biāo)，計(jì)算公式：

式中，m0，初始體質(zhì)量；mt，終末體質(zhì)量，t試驗(yàn)時(shí)間，d。

1.4.2 腸道免疫基因表達(dá) 用 Trizol 試劑盒（Invitrogen,Carlsbad,CA,USA）參照說(shuō)明書提取腸道組織總RNA。取質(zhì)量合格的RNA 樣品，用Evo M-MLV 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara,Japan）制備cDNA，于-20 ℃下保存待用。用Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)il1β、il12、tnfα促炎相關(guān)基因和il10、igm、cd4抗炎相關(guān)基因的引物（表3）[8]，內(nèi)參為β-actin。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)基因表達(dá)量。所用引物模板均來(lái)自廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料實(shí)驗(yàn)室珍珠龍膽石斑魚2 代和3 代全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，原始數(shù)據(jù)的NCBI 登錄號(hào)分別是PRJNA664623、PRJNA66441。

表3 珍珠龍膽石斑魚腸道免疫相關(guān)基因PCR 引物Table 3 PCR primers for intestinal immune related genes of grouper

1.4.3 組織切片及炎癥指標(biāo)分析 每缸隨機(jī)取魚3尾，剖取適宜長(zhǎng)度后腸，置于體積分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛通用組織固定劑（武漢塞維爾生物技術(shù)有限公司，武漢，中國(guó)）中24 h，制作H&E 切片。根據(jù)半定量方法，對(duì)H&E 染色切片進(jìn)行光學(xué)顯微鏡隨機(jī)盲評(píng)，后腸SBM 誘導(dǎo)型腸炎程度評(píng)價(jià)方法見(jiàn)文獻(xiàn)[9]。

1.5 代謝組學(xué)分析

1.5.1 代謝物提取及UPLC-MS 分析 腸道樣品經(jīng)液氮充分研磨，用預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)80%甲醇和體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸再懸浮。冰上孵育5 min，于15 000 r/min、4 ℃條件下離心5 min。部分上清液用LC-MS級(jí)水稀釋至甲醇體積分?jǐn)?shù)60%。將樣品移至有0.22 μm 過(guò)濾器的新鮮Eppendorf 管，于15 000g、4 ℃條件下離心10 min。將濾液注入LC-MS/MS 系統(tǒng)。

1.5.2 質(zhì)量控制 為控制樣本質(zhì)量，在樣品處理的同時(shí)制備質(zhì)量控制（QC）樣品。QC 樣品是實(shí)驗(yàn)樣品的等份混合樣品，用于平衡色譜-質(zhì)譜系統(tǒng)，監(jiān)測(cè)系統(tǒng)性能，并在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中評(píng)價(jià)系統(tǒng)穩(wěn)定性。QC 樣本相關(guān)性越高（越接近1），整個(gè)方法穩(wěn)定性越佳。在PCA 分析圖中反映的是QC 樣品的分布聚集在一起[10]。同時(shí)建立空白樣品去除背景離子。

1.5.3 數(shù)據(jù)處理和代謝物鑒定 用Compound Discoverer 3.0（CD 3.0,Thermo Fisher）處理UPLC-MS/MS的原始數(shù)據(jù)，對(duì)每種代謝物進(jìn)行峰對(duì)齊、峰提取和定量。主要參數(shù)：保留時(shí)間耐受性為0.1 min，實(shí)際質(zhì)量公差為5×10-6，信號(hào)強(qiáng)度公差為30%，信噪比為3，最低強(qiáng)度為100 000。將峰值強(qiáng)度歸一化為總光譜強(qiáng)度。利用歸一化數(shù)據(jù)根據(jù)添加劑離子、分子離子峰和碎片離子預(yù)測(cè)分子式。將峰值與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，以獲得準(zhǔn)確的定性和相對(duì)定量結(jié)果。將所選數(shù)據(jù)導(dǎo)入EZinfo 軟件用于主成分分析（PCA）和偏最小二乘判別分析（PLS-DA）。統(tǒng)計(jì)分析前對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行Pareto 標(biāo)度處理，用PCA 分析評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)集的可靠性（包括QC 樣本），并提供所有樣本可視化總體分離結(jié)果。為更好區(qū)分不同群體，建立PLS-DA模型。此外，為避免PLS-DA 模型過(guò)度擬合，用SIMCA-P+14.0 軟件（Umetrics AB,Umea,Sweden）對(duì)200 個(gè)隨機(jī)排列進(jìn)行7 次交叉循環(huán)檢驗(yàn)。用PLS-DA 模型變量在投影中的重要性（VIP）值和t檢驗(yàn)的P值尋找差異代謝產(chǎn)物。VIP 值反映每個(gè)變量對(duì)模型的貢獻(xiàn)。VIP 值較大則可區(qū)分對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組主要潛在生物標(biāo)志物。VIP >1，P<0.05，對(duì)數(shù)值差異倍數(shù)（Fold change，F(xiàn)C）≥2 或FC≤0.5 的代謝產(chǎn)物視為差異性代謝物[11]。

1.5.4 差異代謝物分析 用火山圖篩選代謝物的log2(FC) 和-lgP，用z-Score 圖展示同一水平代謝物的相對(duì)含量，用cor.mtest() 函數(shù)計(jì)算不同代謝物間協(xié)同或互斥關(guān)系，顯著相關(guān)的閾值水平為P<0.05。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

統(tǒng)計(jì)分析用SPSS 22.0 進(jìn)行，結(jié)果以平均±標(biāo)準(zhǔn)差表示。為檢驗(yàn)各組間的差異，同質(zhì)方差檢驗(yàn)后進(jìn)行單因素方法分析。顯著性閾值為P<0.05。對(duì)代謝物進(jìn)行受試者工作特征曲線（ROC）分析以確定曲線下面積（AUC），比較代謝物預(yù)測(cè)能力。

2 結(jié)果

2.1 生長(zhǎng)性能

與對(duì)照組相比，隨著SBM 替代水平的增加，各實(shí)驗(yàn)組增重率和特定生長(zhǎng)率依次顯著降低（P<0.05）；各組肝體比和存活率無(wú)顯著變化（P>0.05）（表4）。

表4 不同水平豆粕蛋白替代魚粉蛋白對(duì)珍珠龍膽石斑魚生長(zhǎng)的影響Table 4 Effects of different levels of soybean meal protein substitute for fish meal protein on growth of pearl gentian grouper

2.2 免疫相關(guān)基因表達(dá)

表5 顯示，與對(duì)照組相比，隨著替代水平的增加，各實(shí)驗(yàn)組促炎相關(guān)基因il1β、il12、tnfα表達(dá)量總體上呈顯著增加趨勢(shì)（P<0.05），SBM40 組表達(dá)量最高；隨著替代水平的增加，與對(duì)照組相比，抗炎相關(guān)基因il10、igm、cd4表達(dá)量呈顯著下降趨勢(shì)（P<0.05），SBM40 組表達(dá)量最低。

表5 豆粕替代魚粉蛋白對(duì)珍珠龍膽石斑魚后腸免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響Table 5 Effects of soybean meal protein substitute for fish meal protein on immune related gene expression in hindgut of pearl gentian grouper

2.3 組織切片和炎性指標(biāo)

組織切片和半定量分析表明，與對(duì)照組相比，不同替代水平的SBM 均引起珍珠龍膽石斑魚后腸炎癥反應(yīng)，有顯著差異（P<0.05）。其中SBM40組炎癥最嚴(yán)重，SBM20 組次之，有較明顯的炎癥表征，如腸道黏膜皺襞縮短、固有膜腫脹及各種炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等（圖1 和表6），說(shuō)明本研究SBM 替代水平誘發(fā)了珍珠龍膽石斑魚的腸炎癥狀。

表6 腸道切片半定量組織學(xué)腸炎評(píng)估得分Table 6 Semi-quantitative histological evaluation of intestinal sections

圖1 珍珠龍膽石斑魚后腸Fig.1 Hindgut of pearl gentian grouper

2.4 腸道組織UPLC-MS 代謝譜分析

2.4.1 UPLC-MS 代謝譜分析 腸道組織的代謝譜圖如圖2。圖3 展示LC-MS 正負(fù)離子兩種模式下腸道組織樣本的PCA 得分。QC 樣本位于中心，聚類緊密，表明數(shù)據(jù)質(zhì)量好，模型穩(wěn)定可靠。圖4 展示QC 樣本的相關(guān)性。

圖2 正、負(fù)離子模式下后腸組織的典型UPLC-MS 光譜Fig.2 Representative UPLC-MS spectra of the distal intestine tissues in positive and negative modes

圖3 正、負(fù)離子模式下后腸總樣本主成分分析(PCA)Fig.3 Total sample PCA score plots resulting from UPLC-MS spectra of distal intenstine in positive and negative modes

圖4 正離子和負(fù)離子模式下后腸組織質(zhì)控樣品相關(guān)性Fig.4 Correlation of QC samples of distal intestine tissues in positive and negative modes

圖5 展示正、負(fù)離子模式下腸道組織差異代謝物PLS-DA 模型的結(jié)果。兩組間分離清晰，各組樣本基本在95%置信橢圓內(nèi)。用正、負(fù)兩種離子模式進(jìn)行置換檢驗(yàn)，以防止模型過(guò)度擬合 (圖6)。FM 和SBM20 組的置換檢驗(yàn)R2Y 和Q2Y 參數(shù)在正離子模式中為分別0.73和0.67，在負(fù)離子模式中分別為0.61和0.73；FM 和SBM40 組的置換檢驗(yàn)R2Y 和Q2Y參數(shù)在正離子模式中為分別0.67 和0.62，在負(fù)離子模式中分別為0.57 和0.65。其值均大于0.5，左邊的紅線(Q2Y)和藍(lán)線(R2Y)比右邊起始點(diǎn)低，表明這些模型過(guò)擬合風(fēng)險(xiǎn)低。

圖5 正離子(A,C)和負(fù)離子(B,D)模式下后腸組織總樣本PLS-DA 評(píng)分Fig.5 Total sample PLS-DA score resulting from the UPLC-MS spectra of distal intestine tissues in positive (A,C) and negative modes (B,D)

圖6 正離子（A,C）和負(fù)離子（B,D）模式下后腸組織PLS-DA模型置換檢驗(yàn)Fig.6 Permutation test result of the PLS-DA models of distal intestine tissues in the positive (A,C) and negative (B,D) modes

2.4.2 差異代謝物分析 差異代謝物的PLS-DA 得分圖（圖5）顯示，F(xiàn)M 組與SBM20 組和SBM40 組之間可明顯分離，且未過(guò)擬合。與FM 對(duì)照組相比，正離子和負(fù)離子模式下，SBM20 組和SBM40 組中，從腸道組織中各鑒定2 260 種差異代謝物(正離子模式1 404 種，負(fù)離子模式856 種)。所鑒定物質(zhì)的保留時(shí)間、質(zhì)/荷比（m/z）和碎片模式與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)比較，正離子模式下，SBM20 組差異代謝物中有53 種代謝物顯著上調(diào)，120 種代謝物顯著下調(diào)（圖7）；SBM40 組差異代謝物中有69 種代謝物顯著上調(diào)，293 種代謝物顯著下調(diào)。同時(shí)，負(fù)離子模式下，SBM20組差異代謝物中有52 種代謝物顯著上調(diào)，77 種代謝物顯著下調(diào)；SBM40 組差異代謝物中有46 種代謝物顯著上調(diào)，190 種代謝物顯著下調(diào)。

圖7 正離子（A,C）、負(fù)（B,D）離子模式下組間P 值火山圖Fig.7 Volcano plot of P values between FM,SBM20 and SBM40 groups in positive (A,C) and negative (B,D) modes

2.4.3 潛在生物標(biāo)志物篩選 根據(jù)VIP >1，|log2(FC)| >1，P<0.05，在正離子模式下，在SBM20 組中，篩選的前10 種可區(qū)分FM 和SBM20 組最有影響差異代謝物分別為染料木素、大豆黃酮、染料木素-4'-O葡萄糖醛酸酯、癸二酸、雞黃豆素、2-O-乙基抗壞血酸、檸檬苦素、吲哚-3-丙烯酰甘氨酸、2-苯基-1,4-二羥基萘和白三烯B4 二甲胺；在SBM40 組中，篩選的前10 種可區(qū)分FM 和SBM40 組最有影響差異代謝物分別為2-氨基-3,4-二甲基咪唑（4,5-F）喹啉、檸檬苦素、吲哚-3-丙烯酰甘氨酸、N-甲基蒽酰胺、N,N-二甲基甲氧基噻吩、染料木素、染料木素-4’-O 葡萄糖醛酸酯、白三烯B4 二甲胺、大豆黃酮和5-羥基吲哚-3-乙酸。

在負(fù)離子模式下，在SBM20 組中，篩選的前10種可區(qū)分FM和SBM20組最有影響差異代謝物分別為染料木素、維生素C、雞黃豆素、黃芩苷、大豆黃酮、葡萄糖二酸、大豆皂苷Ⅰ、苜蓿酸3-O-三葡萄糖苷、小肽（Leu-Gly-Pro）和戊基-4-羥脯氨酸；在SBM40組中，篩選的前10 種可區(qū)分FM 和SBM40組的最有影響差異代謝物分別為維生素C、染料木素、葡萄糖二酸、大豆黃酮、黃芩苷、小肽、戊基-4-羥脯氨酸、大豆皂苷Ⅰ、雞黃豆素和磷酸肌酸。SBM20 組替代水平下，正負(fù)離子模式下的20 種潛在腸炎標(biāo)志物中，有3 種是共有的；SBM40 組替代水平下，正負(fù)離子模式下的20 種潛在腸炎標(biāo)志物中，有2 種是共有的。因此，SBM20 和SBM40 組分別選出17 種和18 種代謝物作為珍珠龍膽石斑魚腸道組織豆粕誘導(dǎo)型腸炎（SBMIE）的潛在生物標(biāo)志物。

為進(jìn)一步明確潛在生物標(biāo)志物特征，圖8 展示差異代謝物正負(fù)離子模式下的z-得分（z-score）。表7 展示正、負(fù)離子模式下，SBM20 組潛在腸炎標(biāo)志物的離子強(qiáng)度；表8 展示正、負(fù)離子模式下，SBM40組潛在腸炎標(biāo)志物的離子強(qiáng)度。與FM 組對(duì)比，SBM20 組癸二酸、檸檬苦素、吲哚-3-丙烯酰甘氨酸、小肽Leu-Gly-Pro、戊基-4-羥脯氨酸和磷酸肌酸離子強(qiáng)度顯著降低（P<0.05），而其他12 種代謝物的強(qiáng)度顯著增加（P<0.05）；SBM40 組2-氨基-3,4-二甲基咪唑（4,5-F）喹啉、檸檬苦素、吲哚-3-丙烯酰甘氨酸、N-甲基蒽酰胺、N,N-二甲基甲氧基噻吩、小肽Leu-Gly-Pro、戊基-4-羥脯氨酸和磷酸肌酸的離子強(qiáng)度顯著下降（P<0.05），其他10 種代謝物強(qiáng)度顯間內(nèi)，代謝物AUC 均超過(guò)0.9（圖9），表明對(duì)潛在生物標(biāo)志物預(yù)測(cè)能力較佳。

圖8 正離子（A,C）和負(fù)離子（B,D）模式下FM 與SBM20、SBM40 組間潛在生物標(biāo)記物的z-Score 評(píng)分Fig.8 z-Score plot of potential biomarkers for comparison between FM and SBM20 and SBM40 in positive and negative modes

表7 SBM20 組正負(fù)離子模式下腸炎潛在標(biāo)志物的離子強(qiáng)度Table 7 Intensities of metabolites identified as the potential biomarkers of SBM20 vs.FM in positive and negative modes

表8 SBM40 組正負(fù)離子模式下腸炎潛在標(biāo)志物的離子強(qiáng)度Table 8 Intensities of metabolites identified as the potential biomarkers of SBM20 vs FM in positive and negative modes

2.4.4 潛在生物標(biāo)志物篩選 圖9 表明，SBM20 組中，正離子模式下，檸檬苦素、吲哚-3-丙烯酰甘氨酸與染料木素-4'-O 葡萄糖醛酸酯、2-O-乙基抗壞血酸、2-苯基-1,4-二羥基萘、白三烯B4 二甲胺呈顯著負(fù)相關(guān)；吲哚-3-丙烯酰甘氨酸與大豆黃酮呈顯著負(fù)相關(guān)，白三烯B4 二甲胺與癸二酸呈顯著負(fù)相關(guān)。其他潛在腸炎生物標(biāo)志物間呈顯著正相關(guān)；負(fù)離子模式下，小肽（Leu-Gly-Pro）和戊基-4-羥脯氨酸與其他標(biāo)志物大部分呈顯著負(fù)相關(guān)。正、負(fù)離子模式中，其他生物標(biāo)志物間呈顯著正相關(guān)（空白處除外）。

圖9 正離子（A,C）和負(fù)離子（B,D）模式下組間潛在生物標(biāo)志物的ROC 分析Fig.9 ROC analysis of potential biomarker metabolites between groups and FM in positive (A,C) and negative (B,D) modes

SBM40 組中，正離子模式下，染料木素-4′-O葡萄糖醛酸酯、白三烯B4 二甲胺、5-羥基吲哚-3-乙酸與2-氨基-3,4-二甲基咪唑（4,5-F）喹啉、檸檬苦素、吲哚-3-丙烯酰甘氨酸、N,N-二甲基甲氧基噻吩呈顯著負(fù)相關(guān)；此外，檸檬苦素還大豆黃酮呈顯著負(fù)相關(guān)。負(fù)離子模式下，除戊基-4-羥脯氨酸和磷酸肌酸外，小肽（Leu-Gly-Pro）與其他其中標(biāo)志物呈顯著負(fù)相關(guān)。戊基-4-羥脯氨酸與維生素C、染料木素、葡萄糖二酸、黃芩苷、大豆皂苷Ⅰ呈顯著負(fù)相關(guān)。磷酸肌酸與維生素C、葡萄糖二酸、大豆皂苷Ⅰ呈顯著負(fù)相關(guān)。正離子和負(fù)離子模式中，其他生物標(biāo)志物間呈顯著正相關(guān)（空白處除外）。

對(duì)比不同SBM 蛋白替代水平腸炎潛在生物標(biāo)志，發(fā)現(xiàn)SBM20 組和SBM40 組有13 種標(biāo)志物較為保守，稱之為核心生物標(biāo)志物（表9）。除核心生物標(biāo)志物外，SBM20 組特有的標(biāo)志物包括癸二酸、2-O-乙基抗壞血酸、2-苯基-1,4-二羥基萘和苜蓿酸3-O-三葡萄糖苷；SBM40 組特有的標(biāo)志物包括磷酸肌酸、5-羥基吲哚-3-乙酸、N，N-二甲基甲氧基噻吩、N-甲基蒽酰胺、2-氨基-3,4-二甲基咪唑（4,5-F）喹啉。

表9 不同替代水平腸道組織腸炎潛在生物標(biāo)志物對(duì)比Table 9 Comparison of potential biomarkers of enteritis in intestinal tissues at different substitute levels

3 討論

SBMIE 在水產(chǎn)養(yǎng)殖中普遍存在，對(duì)魚類生長(zhǎng)和飼料利用有明顯的負(fù)面影響，如顯著降低養(yǎng)殖對(duì)象的增重率、特定生長(zhǎng)率，增加飼料系數(shù)等。SBMIE為非感染性亞急性腸炎，其組織學(xué)特征主要表現(xiàn)為黏膜褶皺縮短，固有膜和黏膜下層腫脹，各種炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腸上皮細(xì)胞吸收，空泡減少[12]。腸炎主要發(fā)生在后腸部分，后腸是依靠胞吞作用吸收蛋白質(zhì)的主要部位，這種特殊的吸收方式，導(dǎo)致對(duì)各種外源抗原的接觸更加密切，因此更易誘發(fā)食物感染引起的腸道疾病[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)水平的SBM引起了珍珠龍膽石斑魚腸炎的產(chǎn)生，生長(zhǎng)性能和腸道生理結(jié)構(gòu)的變化也證實(shí)這一結(jié)果。

本研究中，珍珠龍膽石斑魚后腸組織代謝表型在FM 組和實(shí)驗(yàn)組之間表現(xiàn)出顯著的模式差異。在PLS-DA 評(píng)分圖中，F(xiàn)M 組與SBM20、SBM40 組明顯分離，表明飼料中SBM 的添加引起了后腸組織代謝譜變化，SBMIE 在代謝水平上有一定差異表征。

VIP 值反映變量的重要性，在代謝組學(xué)中常用來(lái)篩選潛在的生物標(biāo)志物[14]。本研究中，在SBM20和SBM40 替代水平下，分別根據(jù)VIP 值篩選到17和18 種代謝產(chǎn)物作為珍珠龍膽腸道組織SBMIE 的潛在生物標(biāo)志物，其中有13 種為保守的核心生物標(biāo)志物。與FM 組相比，SBM 替代FM 后腸道組織中異黃酮和皂苷等明顯增加。

異黃酮在結(jié)構(gòu)上與天然雌激素相似，在動(dòng)物體內(nèi)有類似雌激素的生物學(xué)效應(yīng)[15]。SBM 富含植物雌激素（稱為異黃酮）。目前，普遍認(rèn)為大豆異黃酮主要由12 種化合物組成，可分為游離型苷元和結(jié)合型糖苷兩種類型。游離型苷元主要包括染料木素、大豆苷元和大豆黃素；結(jié)合型糖苷主要包括染料木苷、大豆苷、丙二酰染料木苷和丙二酰大豆苷等。本研究的13 種潛在核心生物標(biāo)志物中，有5 種屬于黃酮類化合物，包括染料木素、大豆黃酮、染料木素-4′-O-葡萄糖醛酸酯、雞黃豆素和黃芩苷。大豆異黃酮也被稱為生長(zhǎng)促進(jìn)劑，用于家禽養(yǎng)殖以提高產(chǎn)量。然而，大豆異黃酮對(duì)魚類生長(zhǎng)性能、飼料利用和免疫反應(yīng)的影響是有爭(zhēng)議的，可能與其類型、用量及實(shí)驗(yàn)對(duì)象性別等有關(guān)[16-17]。當(dāng)大豆異黃酮在飼料中添加量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）達(dá)到 0.8%時(shí)，牙鲆（Paralichthys olivaceus）后腸完整性受到損害；SBM中大豆異黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.10%～0.35%，當(dāng)大豆異黃酮添加量不超過(guò) 0.4% 時(shí)，對(duì)異育銀鯽（Allogynogentic silver crucian carp）和牙鲆的生長(zhǎng)和腸道生理幾乎無(wú)負(fù)面影響[18-19]。然而，當(dāng)SBM 以原料形式整體添加以取代FM 時(shí)，大豆異黃酮的負(fù)面影響不能被排除，因?yàn)轱暳现械目範(fàn)I養(yǎng)因子之間可能存在協(xié)同作用，如本研究圖10 顯示，大豆皂苷與其他抗?fàn)I養(yǎng)因子之間存在這種現(xiàn)象。

圖10 正離子（A,C）和負(fù)離子（B,D）模式下組間潛在生物標(biāo)志物相關(guān)性分析Fig.10 Correlation analysis of the potential biomarkers between groups and FM in positive (A,C) and negative (B,D) modes

在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，大豆皂苷是一種研究較為廣泛的抗?fàn)I養(yǎng)因子。本研究中，二替代組中大豆皂苷I含量均顯著增加。SBM 的皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5～7 g/kg[20]。在大西洋鮭中，大豆皂苷是引起腸炎的主要抗?fàn)I養(yǎng)因子[21]。但是，大豆皂苷引起腸炎的直接作用是復(fù)雜的，不同抗?fàn)I養(yǎng)因子間的協(xié)同或拮抗作用亦較為重要[3]。Zhang 等[19]發(fā)現(xiàn)，雖然用SBM 代替FM 飼喂異育銀鯽的負(fù)面效應(yīng)可能與大豆異黃酮無(wú)關(guān)，但大豆皂苷與大豆異黃酮之間存在協(xié)同效應(yīng)。本研究中，不同潛在生物標(biāo)志物與腸炎之間的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

13 種潛在核心生物標(biāo)志物中剩余7 種分別是檸檬苦素、吲哚-3-丙烯酰甘氨酸、白三烯B4 二甲胺、維生素C、葡萄糖二酸、小肽Leu-Gly-Pro 和戊基-4-羥脯氨酸。檸檬苦素是一類三萜類化合物，有抗炎、抑菌、抗氧化、解毒和生物除蟲等多種生物活性[22]，在治療潰瘍性結(jié)腸炎方面有顯著的療效[23]。吲哚類化合物有抗炎、抗癌、抗菌、抗病毒、清除自由基和保護(hù)神經(jīng)等作用[24]。吲哚-3-丙烯酰甘氨酸可能是色氨酸生物合成過(guò)程中的代謝中間體，由色氨酸經(jīng)吲哚丙酸和吲哚乙酸合成。Bull 等[25]研究發(fā)現(xiàn)，吲哚-3-丙烯酰甘氨酸可作為診斷自閉癥譜系障礙的尿液標(biāo)記物。白三烯B4 是一種與炎性反應(yīng)有關(guān)的白三烯類物質(zhì)。受病原感染后，組織釋放的白三烯B4 可提高巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞對(duì)病原菌的吞噬和殺傷功能，并促進(jìn)其釋放抗菌性活性介導(dǎo)物[26]。但相關(guān)研究也指出，過(guò)量的白三烯B4 合成與釋放，可能會(huì)導(dǎo)致各種炎性疾病，如支氣管哮喘和關(guān)節(jié)炎等[27]。小肽有多種生物學(xué)功能，如保護(hù)腸道結(jié)構(gòu)和功能、促進(jìn)蛋白質(zhì)的吸收利用、改善動(dòng)物的生長(zhǎng)性能、提高動(dòng)物免疫性能及抗氧化作用等。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，沙丁魚肌肉水解小肽（如Val-Tyr、Ile-Tyr、Tyr-Val、Trp-His）可誘導(dǎo)收縮主動(dòng)脈的松弛，用以預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化[28]。也發(fā)現(xiàn)Ile-Arg-Trp、Ile-Gln-Trp（蛋），Val-Pro-Pro、Ile-Pro-Pro、Leu-Pro-Pro（發(fā)酵豆粕）、Val-Pro-Tyr（豆粕）等食物來(lái)源的小肽有抗炎、降壓、降糖和改善腎功能等作用[29]。羥脯氨酸在FM 中含量豐富，而在植物原料中含量極少甚至幾乎不存在。以往研究指出，羥脯氨酸除可改善魚類生長(zhǎng)性能外，還有清除氧化劑、調(diào)控細(xì)胞凋亡的作用，且游離的羥脯氨酸可下調(diào)炎性基因的表達(dá)[30]。本研究發(fā)現(xiàn)，SBM 替代FM 后，檸檬苦素、吲哚-3-丙烯酰甘氨酸、白三烯B4 二甲酸、小肽Leu-Gly-Pro 和戊基-4-羥脯氨酸的含量顯著降低，提示這些物質(zhì)的缺乏與腸炎的發(fā)生有密切關(guān)系。維生素C 是魚類必需的水溶性維生素，不僅影響生長(zhǎng)和飼料利用，還有免疫調(diào)節(jié)作用，是與水生動(dòng)物免疫、鐵代謝和血液學(xué)相關(guān)的營(yíng)養(yǎng)素之一[31]。維生素C 對(duì)魚類免疫有有益影響，如溶菌酶及補(bǔ)體活性、吞噬活性、抗糖化、呼吸爆發(fā)和黏膜免疫反應(yīng)等[32]。葡萄糖二酸是一種無(wú)毒的葡萄糖衍生物，通常以手性化合物D-葡萄糖二酸的形式存在。葡萄糖二酸天然存在于櫻桃、柑橘和豆類等水果和蔬菜中，少量哺乳動(dòng)物和人體內(nèi)也有分泌[33]。葡萄糖二酸在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用鮮有報(bào)道，在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)，與葡萄糖二酸可相互轉(zhuǎn)化的葡萄糖-1,4-內(nèi)酯有很強(qiáng)的解毒和抗氧化能力，還可緩解腸道黏膜損傷[34]。尿液中葡萄糖二酸在人類藥物性肝炎診斷和鑒別中也視為一種標(biāo)志物[35]。本研究中，SBM 替代FM 后，維生素C 和葡萄糖二酸的含量顯著升高，提示腸炎狀態(tài)下，魚類可能通過(guò)增加某些物質(zhì)的含量緩解腸道損傷或炎癥。

不同替代水平下，珍珠龍膽腸道組織中篩選的潛在生物標(biāo)志物中，SBM20 組特有的是癸二酸、2-O-乙基抗壞血酸、2-苯基-1,4-二羥基萘和苜蓿酸3-O-三葡萄糖苷，SBM40 組特有的是磷酸肌酸、5-羥基吲哚-3-乙酸、N,N-二甲基甲氧基噻吩、N-甲基蒽酰胺和2-氨基-3,4-二甲基咪唑（4,5-F）喹啉。通過(guò)本研究，可將此類物質(zhì)作為判定珍珠龍膽石斑魚SBMIE 程度的標(biāo)志性物質(zhì)。但在魚類SBM 誘導(dǎo)的腸炎研究中，對(duì)這些代謝物與腸炎關(guān)系鮮有報(bào)道。從本研究結(jié)果看，雖然這些潛在腸炎標(biāo)志物之間相關(guān)性較高，但在實(shí)際生理過(guò)程中，其對(duì)腸炎的作用是獨(dú)立的、協(xié)同的還是拮抗的，尚不完全清楚，仍有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

基于代謝組學(xué)分析，本研究在20%和40%SBM替代水平下，從珍珠龍膽腸道組織中分別篩選到17和18 種SBMIE 的潛在生物標(biāo)志物；有13 種較為保守的核心生物標(biāo)志物為兩實(shí)驗(yàn)組共有，反映了珍珠龍膽石斑魚SBMIE 的典型表征；兩組分別特有的潛在腸炎標(biāo)志物可作為腸炎嚴(yán)重程度的判定依據(jù)。不同替代水平下，大部分生物標(biāo)志物間存在顯著的正相關(guān)或負(fù)相關(guān)作用，但其與腸炎之間的關(guān)系和作用機(jī)制仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。